Name: Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende una estrategia de purificación combinada para glicómica cuantitativa y proteómica mediante LC-MS/MS. Este método de alto rendimiento permite analizar simultáneamente N-glicanos y proteínas plasmáticas con alta reproducibilidad.

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Esta investigación fue generosamente financiada por la Subvención R33 del Programa IMAT del NCI de los NIH (CA147988-02), la Subvención Estatal de Carolina del Norte (T32GM008776), el Programa de Becas GAANN del Departamento de Educación de EE. UU. en la Subvención Estatal de Carolina del Norte (P200A140020), la Fundación W.M. Keck y la Universidad Estatal de Carolina del Norte. El plasma de gallina se obtuvo con la ayuda del Dr. James N. Petitte y Rebecca Wysocky en el Departamento de Ciencias Avícolas de la Universidad Estatal de Carolina del Norte.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
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<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
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</ol>

Tenemos una relación de colaboración con Cambridge Isotope Laboratories (CIL) para difundir el reactivo y la tecnología P2GPN a la comunidad científica en general en forma de producto (GTK-1000). Sin embargo, no recibimos ningún ingreso basado en la venta de este producto.

Se necesitan métodos cuantitativos de alto rendimiento para facilitar el análisis rutinario de glicanos. Durante los últimos treinta años, el análisis de la glicómica se ha limitado a un subconjunto de grupos de investigación, a pesar de su importancia en enfermedades, aplicaciones clínicas y productos farmacéuticos. El método de purificación y etiquetado FANGS-P2GPN para glicómica y proteómica realiza el mismo análisis en una sola alícuota de muestra, reduciendo el costo de los suministros y la cantidad de material necesario (particularmente importante en estudios en humanos y ratones). Además, los esfuerzos para minimizar la variabilidad en las preparaciones son de vital importancia, ya que cada paso adicional contribuye al error, enmascarando potencialmente cambios importantes pero poco abundantes en los estudios de casos y controles. El acoplamiento de FANGS al etiquetado de hidrazida hidrofóbica permite que las muestras de proteínas y glicanos se ejecuten en la misma columna RPLC, mejora la ionización de glicanos, proporciona una cuantificación relativa y se puede aplicar cuantitativamente al plasma.
Para el análisis de N-glicano, es fundamental utilizar el nivel sugerido de PNGasa F para lograr la desglicosilación completa. Aunque los glicanos están expuestos a solventes, la desnaturalización de las proteínas y el exceso de enzimas ayudan a garantizar una escisión eficiente y completa. Para una cuantificación precisa de los glicanos, es necesario asegurarse de que estén completamente secos después de la derivatización para enfriar la reacción y evitar reacciones cruzadas al mezclar las especies NAT y SIL. Finalmente, al extender el flujo de trabajo al análisis de glicositas, el tiempo de los pasos es fundamental para minimizar la desamidación no específica. Los protocolos modificados proporcionados para el análisis combinado de glicómica y proteómica funcionan de manera consistente cuando se realizan en consecuencia.
El flujo de trabajo logra una cuantificación relativa precisa de N-glicanos del plasma en comparación con el método SPE estándar de oro. No hay sesgo aparente en los tipos de glicanos extraídos en términos de peso molecular, hidrofilia y estructura de composición. Aunque no hemos explorado el análisis cualitativo de los glicanos ligados a O, esperamos que FANGS pueda acomodar la adición de un paso de eliminación de β después de la digestión de la PNGasa F de glicanos ligados a N. Sin embargo, los procedimientos requerirían modificaciones significativas para la limpieza de reactivos antes de la espectrometría de masas, y el análisis de péptidos se verá significativamente afectado. Para la proteómica, se logra la misma profundidad de cobertura de proteoma en comparación con los métodos tradicionales de FASP. Es importante destacar que los métodos logran una tasa mínima de falsos descubrimientos para la desamidación de N-glicano. Si bien el método es compatible con el marcado de 18O de Asn durante el paso de digestión PNGasa22,23, la baja tasa de descubrimiento falso del sitio de glicosilación sugiere que puede no ser necesario, lo que reduce aún más los costos y la complejidad.
El proteoma no está enriquecido para glicoproteínas en este método, lo que tiene ventajas y desventajas. Es posible que ciertas glicoproteínas poco abundantes no se detecten en el análisis. Sin embargo, la ocupación de sitios glicosilados por proteína, se puede comparar entre muestras biológicas. Además, se eliminan los errores y sesgos introducidos por la purificación por afinidad de lectinas o el enriquecimiento químico. En conclusión, el acoplamiento de FANGS a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano da como resultado un método simplificado, cuantitativo y de alto rendimiento para el análisis en tándem del glicoma y el proteoma con un gran potencial para su aplicación en estudios clínicos de casos y controles.

En el campo de la proteómica, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) ha sido ampliamente adoptado por su capacidad para minimizar la cantidad de material de partida, disminuir los artefactos de preparación de muestras, y maximizar el rendimiento de la muestra 1. Sin embargo, tal método tiene todavía a surgir y ganar tracción para el campo de glycomics. Desarrollo de alto rendimiento, flujos de trabajo cuantitativos son necesarios debido a la función integral de glicosilación en defensa biológica y su modulación por el cáncer o las enfermedades 2,3. En los mamíferos, N -glycans están compuestos de unidades repetitivas de sacáridos (hexosas (Hex), hexosaminas (HexNAc), ácidos siálico (NeuAc), y fucoses (FUC)), que decoran una estructura de núcleo (Hex 3 HexNAc 2) 4 unido covalentemente a asparagina. Aunque el glycospace es considerablemente grande cuando se cuentan isómeros (&gt; 10 12), que es bastante pequeña en una base composición y pesos moleculares suelen oscilar entre 1,000-8,000 Da 5 &lt;/ Sup&gt;. La homogeneidad de composición de la clase y la hidrofilia de glicanos plantean desafíos únicos para la purificación, separación y espectrometría de masas (MS) 6 flujos de trabajo. Tradicionalmente, N -glycans son digeridos a partir de proteínas o péptidos por péptido N -glycosidase F (PNGasa F) y luego enriquecidos mediante cromatografía de afinidad de lectina 7, capturados por los granos de hidrazida 8, o purificarse a través de extracción en fase sólida (SPE) 9,10. Si bien estos métodos son muy eficaces, introducen medidas adicionales para el desalado y limitan el número de muestras procesadas simultáneamente. Durante la última década, se han propuesto una serie de plataformas de alto rendimiento para glycomics. Kim et al. Publicó un método semi-automatizado usando una placa de 96 pocillos SPE accionado por vacío 11. Alternativamente, un método de afinidad-filtro (N--glyco FASP) fue desarrollado por el grupo de Mann, que requiere la derivación inicial de la fifiltro con una combinación de 12 lectinas. Por último, el grupo Thomas-Oates propuso un método semi-cuantitativo, el filtro de separación Aided N -Glycan (FANGS), que explotaba el tamaño de composición estrecha de la glycospace 13. Basándose en filtros de corte de peso molecular, pequeños contaminantes se lavaron primero en perder y luego los -glycans N se digirieron y se eluyeron. desglicosiladas proteínas permanecen en el filtro en este protocolo y se pueden someter a FASP en línea. Identificación y cuantificación de los glicanos de ionización por electrospray (ESI) MS requiere separaciones fuera de línea para la solución (parcial) de isómeros y derivación para la detección de especies de bajo abundantes. Etiquetado en la individualidad cuando la normalización de las etiquetas con la estrategia de hidrazida glicanos confiere compatibilidad con cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) 14,15. El 4-fenetil-benzohydrazide (P2PGN) etiqueta hidrofóbica media la hidrofilicidad de los glicanos, ENHancing ionización por, en promedio, cuatro veces 16. Aunque otras técnicas, tales como permetilación 17 o amina reactiva químicas de marcado 18, ofrecen ventajas similares, en la reacción de la hidrazida, glicanos se hacen reaccionar 1: 1 estequiométricamente en condiciones fáciles. Cuantificación relativa se logra mediante el análisis de muestras tándem derivados con nativo (NAT) o 13 C 6 etiquetas de isótopos estables (SIL). El siguiente método evoluciona FANGS para aplicaciones de plasma y la acopla a la etiqueta hidrófobo P2GPN para la cuantificación relativa precisa. Además, se ha diseñado para llevar a cabo la proteómica de escopeta, perfiles, desamidación y glycomics cuantitativos en una sola parte alícuota de la muestra, sin comprometer la integridad de los análisis.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético (50%)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Bradford</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>B6916</td><td>Alternativa: Kit de ácido bicinconínico (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Las centrífugas alternativas que alcanzan 14.000 x g son adecuadas</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp; M en solución</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Las LC alternativas de nano o ultra alta presión producirán datos similares, tales como: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Aguas).</td></tr><tr><td>Bastidor de tubo flotante</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Hornos Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Incubadoras alternativas que alcanzan 56&nbsp; &deg; C son adecuados</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Horno de microondas GE General Electric</td><td></td><td>57B5 E82904</td><td>Cualquier microondas con configuraciones de potencia ajustables es adecuado</td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de glicanos INLIGHT&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>El kit INLIGHT proporciona versiones NAT y SIL del reactivo P2GPN.</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18 fase estacionaria a granel</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Alternativa de medios a granel</td><td>: Cualquier C18 fase estacionaria 5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon Software y servidor</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternativa: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Metanol, grado de HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Columna Auto-Pack: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m ID, 15&nbsp; &#956; punta m, sin recubrimiento, 5 por caja, 50 cm</td><td>Nuevo Objetivo</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGasa F (sin glicerol), 75.000&nbsp; unidades/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Alternate de alta precisión de masa (5&nbsp; ppm) los espectrómetros de masas proporcionarán datos similares</td></tr><tr><td>RNasa B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina de páncreas porcino</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacíoSavant SPD131DDA Concentrador SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Son adecuados los concentradores de vacío alternativos</td></tr><tr><td>Filtros Vivacon 500 de 30 kDa&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech VN01H22</td><td></td><td>alternativa: Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra 0.5 con Ultracel-10&nbsp; membrana kDa (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Agua, grado HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Agua, 18</td><td>O Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>La adición de 18O en el paso de digestión PNGase F es opcional y puede no ser necesaria para los estudios de desamidación completados con un 95% de confianza</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

un glicómica cuantitativa y proteómica estrategia de purificación combinada

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Existe un deseo creciente en las ciencias biológicas y clínicas de integrar y correlacionar múltiples clases de biomoléculas para desentrañar la biología, definir vías, mejorar el tratamiento, comprender la enfermedad y ayudar al descubrimiento de biomarcadores. La glicosilación ligada a N es una de las modificaciones postraduccionales más importantes y robustas de las proteínas y regula funciones celulares críticas como la señalización, la adhesión y la función enzimática. Las técnicas analíticas para purificar y analizar los N-glicanos se han mantenido relativamente estáticas durante la última década. Si bien son precisos y efectivos, comúnmente requieren experiencia y recursos significativos. Aunque se han desarrollado algunos esquemas de purificación de alto rendimiento, aún no han encontrado una adopción generalizada y, a menudo, se basan en el enriquecimiento de glicopéptidos. Un método prometedor, desarrollado por Thomas-Oates et al., la separación de N-glicanos asistida por filtro (FANGS), se demostró cualitativamente en tejidos. Aquí, adaptamos FANGS al plasma y lo acoplamos a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano para lograr una cuantificación relativa precisa mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas e ionización mejorada por electrospray. Además, diseñamos una nueva funcionalidad para el protocolo al lograr análisis de sitios de glicosilación y proteómica en tándem, shotgun y glicosilación en plasma de gallina. Demostramos que los N-glicanos purificados en filtro y derivados por marcadores de hidrazida hidrofóbica eran comparables en términos de abundancia y clase a los de extracción en fase sólida (SPE); Este último se considera un estándar de oro en el campo. Es importante destacar que la variabilidad en los dos protocolos no fue estadísticamente diferente. Los datos proteómicos que se recopilaron en línea con los datos glicómicos tuvieron la misma profundidad en comparación con una digestión estándar de tripsina. La desamidación de péptidos se minimiza en el protocolo, limitando la desamidación inespecífica detectada en los motivos de glicosilación. Esto permitió el análisis directo del sitio de glicosilación, aunque el protocolo también puede acomodar el etiquetado del sitio 18O. En general, demostramos un nuevo protocolo en línea de alto rendimiento, imparcial y basado en filtros para el análisis cuantitativo de glicómica y proteómica.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Figura 1:. Se da el esquema del método FANGS-P2GPN etiquetado hidrófobo acoplado (método A) para la proteómica y glycomics combinados análisis de los pasos que difieren entre glicómica sólo para glycomics de procesamiento y en tándem y el análisis de proteómica, con identificación del sitio de glicosilación, se destacan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La línea en la proteómica y la glycomics, P2GPN método de marcado hidrófobo basado en filtro (Método A) fue validado para la identificación, cuantificación, y el sesgo de peso molecular utilizando muestras de plasma de gallina agrupados (Figura 1). Por únicamente glicómica experimentos, inter-comparaciones en las abundancias de N -glycans extraídos por el métodoUna de carbograph SPE (estándar de oro, Método B) se hicieron (Figura 2). No hubo diferencias significativas en la abundancia de glicanos entre los dos métodos. La variabilidad intra-también se evaluó mediante la cuantificación del SIL: NAT proporción de glicanos extraídos por el mismo método. El registro de 2 -distributions de ambos métodos fueron Gaussian, centrado en cero, y no significativamente diferente (Figura 3A-B). El peso molecular oscila entre los dos protocolos completamente solapados, lo que sugiere que el filtro no discriminó N -glycans basa en rango de peso molecular y carácter hidrófilo (Figura 4). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Figura 2: Una mezcla equimolar de NAT y SIL N -glycans extraído por el método A y B se preparó a partir de 2,5 l de plasma de gallina (N = 4) Las muestras fueron anal.yzed por UPLC-MS de acuerdo con los parámetros recomendados sugeridas en la sección 6. Las abundancias para cada glicano, en cada canal de NAT / SIL, se calcularon mediante la integración del área bajo el cromatograma de iones extraídos (MMA = 3 ppm), la corrección de la molecular solapamiento de peso, y el ajuste por el TGNF. Estas relaciones se muestran con sus errores estándar. Las abundancias de Método B: Método A N -glycans no fueron significativamente diferentes (p&gt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Figura 3: La intra-variabilidad en el (A) Método A (N = 133) o (B) Método B (N = 123) se comparó estrategias. NAT y SIL mezclas equimolares de N -glycans, desde el mismo esquema de extracción, Se analizaron más de tres repeticiones técnica. El registro de 2 -distributions estaban centrados en cero y no fueron significativamente diferentes entre los dos flujos de trabajo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Figura 4: Los rangos de peso molecular de glicanos de cada estrategia se compararon. Los dos flujos de trabajo rindieron glicanos que abarca el mismo rango de peso molecular. N -glycans detectó en un protocolo contra el otro cayó justo por encima del límite de detección (1 × 10 5 abundancia) y no reflejan el sesgo sistemático. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page = &quot;1&quot;&gt; La retención de las proteínas desglicosiladas por el filtro de pesos moleculares activados en línea proteoma amplio análisis y la identificación del sitio de glicosilación. Múltiples protocolos para la purificación combinada de glicanos y proteínas se compararon con una preparación FASP tradicional sin desglicosilación (Tabla 5). Nuestro típico filtro 18 hr PNGasa F digestión base, seguido de digestión con tripsina FASP (protocolo Std) dio lugar a niveles significativos de desamidación no específica, que pueden interferir con la identificación de glycosites. Por lo tanto, un método que utiliza un tiempo de incubación más corto a temperatura elevada (50 ° C) y una etapa de espiga-en PNGasa F (protocolo SPI) se exploró como alternativa, junto con un protocolo de digestión por microondas (protocolo MD), para minimizar la no desamidación específico. Los glicanos observados en los nuevos métodos de digestión no fueron significativamente diferentes en las composiciones o abundancias de la norma de 18 horas, 37 ° C filtro PNGasa F digerir ( <strong&gt; Figura 5). En combinación con una breve incubación con tripsina, desamidación no específica se redujo significativamente, con una tasa de falsos positivos para glycosites &lt;5% (Tabla 5). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Las proteínas </td><td></td><td colspan="4"> péptidos </td><td></td><td colspan="4"> Los péptidos desamidada </td><td></td><td colspan="4"> glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glicoproteínas </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> Maryland </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tabla 5: Las comparaciones de los datos proteómicos de una tripsina estándar resumida en lugar se hizo el método de marcado en la línea FANGS-P2GPN Los preparativos se realizaron con (+) y sin (-) PNGasa F para determinar las tasas de fondo de la desamidación y la estimación no específica glycosite tasas de falsos positivos. Las proteínas se identificaron con 1% de tasa de falso descubrimiento (FDR); péptidos fueron filtradas en base a la confianza péptido &quot;alta&quot; en Proteoma descubridor 1.4 (q &lt;0,01); glycosites se identified basado en secuencias únicas que contienen desamidación del motivo de glucosilación conservado (NXS / T); y glicoproteínas se definieron como proteínas identificadas que contienen al menos un glycosite identificado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Figura 5: acortado protocolos para glicanos se desarrollaron para minimizar la desaminación de las muestras y se compararon con el 18hr FANGS PNGasa F digestión. Las diferencias en las abundancias promedio fueron de 10% y 5% para el MD (2.2.3) y (2.2.2) protocolos SPI, respectivamente. De los 48 glicanos identificados, el 90% está representada la variación de menos de 1,5 veces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

El objetivo general de este protocolo basado en un solo filtro es purificar de forma sencilla y cuantitativa N-glicanos y proteínas simultáneamente a partir de muestras biológicas para su análisis por espectrometría de masas. La escalabilidad, rapidez y reproducibilidad analítica de este método lo hacen directamente accesible, en cuanto a recursos y conjuntos de habilidades, para laboratorios de espectrometría de masas biológica. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores abordar simultáneamente cuestiones relacionadas con glicómica, ocupación de sitios de glicosilación y proteómica en estudios biológicos de gran escala y alto rendimiento.Hemos superado los desafíos de la medición de N-glucanos al acoplar este método a una estrategia de derivatización adaptada a espectrometría de masas, lo que permite una cuantificación relativa precisa entre estados cancerosos y controles. Con una variabilidad analítica reducida, pueden elucidarse nuevas interacciones biológicas entre el glucoma y el proteoma, proporcionando información clave sobre estados patológicos y nuevas oportunidades para el descubrimiento de biomarcadores. Para comenzar, cargue 2.5 µL de plasma sobre un filtro.Luego, agregue 2 microlitros de solución de ditiotreitol 1 M a cada muestra en el filtro. Diluya la muestra con 200 microlitros de tampón de digestión de PNGasa al 100 mM de bicarbonato de amonio. Tape el tubo de muestra del filtro y vortexee suavemente, teniendo cuidado de no desplazar el filtro de su asiento.Incube la muestra a 56 grados Celsius durante 30 minutos para desnaturalizar las proteínas y glicoproteínas. Para alquilar las muestras, agregue 50 microlitros de yodoacetamida 1 M para obtener una concentración final de aproximadamente 200 mM. Luego, incube a 37 grados Celsius durante 60 minutos.Concentre la glucoproteína desnaturalizada en el filtro mediante centrifugación de las muestras a 14,000 × g durante 40 minutos antes de desechar el flujo atravesante. Lave la muestra con 100 microlitros de tampón de digestión PNGase. Concentre la glucoproteína en el filtro y deseche el flujo atravesante.Repita el paso de lavado y concentración dos veces, para un total de tres repeticiones, obteniendo un concentrado en el volumen muerto del filtro. Deseche todo el flujo pasante y el vial de recolección una vez completados los lavados. A continuación, agregue 2 microlitros de péptido N-glicosidasa F sin glicerol o PNGase F al filtro después de transferirlo a un vial de recolección nuevo.Añada 98 microlitros de tampón de digestión PNGase para alcanzar un volumen total de 100 microlitros, y pase suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo en el filtro para homogeneizar. Para el protocolo de digestión con adición, incube las muestras a 50 grados Celsius durante 2 horas. Trabajando rápidamente, retire las muestras y añada 2 microlitros adicionales de PNGase F sin glicerol. Vortexee ligeramente las muestras durante 1 a 2 segundos para mezclar.Incube las muestras a 50 grados Celsius durante 2 horas adicionales. Después de eluir los glicanos mediante centrifugación de la muestra a 20 grados Celsius, agregue 100 microlitros de tampón de digestión PNGase al filtro y centrifugue nuevamente. Recopile el lavado que contiene cualquier glicano N-enlazado remanente en el mismo vial de recolección que el eluyente.Después de repetir dos veces, retire el filtro y colóquelo en un nuevo vial de recolección para la preparación de proteómica. A continuación, incube las muestras de glicanos en el congelador a 80 grados Celsius durante 30 a 60 minutos hasta que se congelen. Luego, seque por completo a temperatura ambiente en un concentrador de vacío durante 4 a 6 horas.Lave el filtro que contiene los péptidos desnaturalizados con 400 microlitros de tampón de urea 8 M. Tape el vial de recolección y vortexee suavemente para mezclar. Concentre los péptidos en el filtro antes de desechar todo el flujo de paso.Después de repetir el lavado con tampón de urea otras dos veces, enjuague el filtro que contiene los péptidos desaminados con tampón de digestión de tripsina. Tape el vial de recolección y vortexee suavemente para mezclar, antes de volver a concentrar en el filtro como antes. Deseche todo el flujo y repita otras 2 veces adicionales, para un total de 3 lavados con tampón de digestión de tripsina.Recolecte todos los eluyentes y lavados futuros en un nuevo vial de recolección. A continuación, agregue 50 microlitros de tripsina modificada de cerdo en una proporción de 1:50 (tripsina:proteína) para experimentos de proteómica descriptiva o en una proporción de 1:5 (tripsina:proteína) para experimentos de proteómica cuantitativa. Tape el vial de recolección y vortexee suavemente para mezclar.Después de incubar las muestras a 37 grados Celsius durante 2 horas, trabaje rápidamente para retirar las muestras y agregar 50 microlitros adicionales de tripsina en la proporción adecuada de tripsina a proteína. Vortexee suavemente las muestras durante 1 a 2 segundos para mezclar. Luego, incube a 50 grados Celsius durante 2 horas adicionales.Tras la elución de los péptidos mediante centrifugación como antes durante 20 minutos, enjuague los péptidos restantes del filtro con tampón de inhibición. Eluya del filtro mediante centrifugación como antes durante 15 minutos. Después de cuantificar la concentración de péptidos en las muestras, incube las muestras de péptidos en el congelador de 80 grados Celsius hasta que se congelen.Luego, seque completamente a temperatura ambiente en un concentrador al vacío durante 4 a 6 horas. A continuación, reconstituya las proteínas digeridas con tripsina justo antes del análisis mediante espectrometría de masas con cromatografía líquida o LCMS, en la fase móvil A hasta la concentración deseada. Las concentraciones de péptidos triptícicos procedentes de 2.5 microlitros de plasma oscilan entre 100 y 300 nanogramos por microlitro.Antes del análisis de glicanos, reconstituya los reactivos secos de 4-fenetil bencenohidrazida marcados con isótopos estables, así como los reactivos P2GPN nativos, en un mililitro de solución de derivatización para obtener una concentración final de 0,25 miligramos por mililitro. Los reactivos pueden tardar hasta 10 minutos en solubilizarse completamente. Agite vigorosamente en vórtex para asegurar una solubilización completa.Etiquete los N-glúcidos secos con 200 microlitros de reactivo P2GPN marcado con isótopos estables o nativo. Pase la pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender los glúcidos secos. Luego, vortexee las muestras y centrifúguelas durante aproximadamente 5 segundos en una centrífuga de banco.Reaccione los glicanos con el reactivo durante 3 horas a 56 grados Celsius. Transfiera inmediatamente los glicanos del incubador al concentrador de vacío y seque por completo a 55 grados Celsius durante 3 a 5 horas. Re-suspenda el N-glicano marcado en 25 a 50 microlitros de agua justo antes del análisis por cromatografía líquida y espectrometría de masas.Pipetee hacia arriba y hacia abajo para asegurar que los N-glucanos se solubilicen completamente. Después de centrifugar las muestras como antes durante 5 minutos, retire el sobrenadante, teniendo cuidado de que la punta de la pipeta no toque el fondo del tubo de centrífuga. Combine un par de muestras nativas y marcadas con isótopos estables en una proporción 1:1 para el análisis en tándem de cuantificación relativa.Prepare dos métodos diferentes de CLME para los flujos de trabajo de proteómica y glicómica. Para el análisis de proteínas, inyecte aproximadamente 400 nanogramos de proteína en la columna en NPA. Ejecute la muestra a 300 nanolitros por minuto, con una equilibración previa de la columna de 1 microlitro y una equilibración de la columna analítica de 5 microlitros.Ionicen las proteínas bajo las condiciones de MS proporcionadas en el protocolo del texto. Para el análisis de glicanos, inyecte 5 microlitros de muestras nativas marcadas con P2GPN y muestras marcadas con isótopos estables equi-M re-suspendidas en la columna. Ejecute la muestra a 300 nanolitros por minuto con una equilibración previa a la columna de 2 microlitros y una equilibración de la columna analítica de 5 microlitros.Luego, ionice los glicanos en las condiciones de MS indicadas en el protocolo del texto. El protocolo de purificación basado en filtros se comparó con el método estándar de extracción en fase sólida, y las abundancias de glicanos plasmáticos detectados entre ambos protocolos no fueron significativamente diferentes. En ambos métodos, los mismos glicanos encontrados cerca del límite de detección presentaron mayor variabilidad.Se evaluó la intervariabilidad para mezclas equiM de plasma purificado mediante el protocolo de extracción en fase sólida basado en filtros o el estándar. Ambos protocolos presentaron distribuciones gaussianas cuyas medias no diferían significativamente de cero. El 80 por ciento de los glicoconjugados cayó dentro de un cambio de dos veces.Las distribuciones de pesos moleculares de los glicanos detectados en los protocolos nuevos y tradicionales de purificación no fueron significativamente diferentes y cubrieron el mismo rango. Cualitativamente, no se observó ningún sesgo entre los glicanos. Las proteínas plasmáticas se prepararon mediante el método estándar de preparación de muestras asistido por filtro y múltiples protocolos en línea.El número de proteínas identificadas fue similar para los diversos protocolos. La desamidación no específica se controló en los protocolos de digestión por microondas y de indigestión con adición de impurezas a menos del 10 por ciento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la ocupación precisa del sitio de glicosilación depende de minimizar la exposición al calor y al tiempo.Una vez dominado, el procedimiento de purificación de N-glucanos inline pecurikene puede completarse en 2 días. Al seguir este procedimiento, se puede integrar y modelar la cuantificación precisa de N-glucanos proteicos y la ocupación de sitios de glicosilación utilizando técnicas estadísticas de orden superior. Esta técnica permite leer rápidamente el lenguaje complejo que utiliza la biología del cáncer, comparar cuantitativamente las diferencias en terapéuticos proteicos y revelar verdaderamente la importancia de la glicosilación en un contexto biológico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Este video describe un método para extraer y purificar péptidos ubiquitinilados que contienen péptidos di-glicina remanentes de una mezcla compleja de péptidos. El método presentado puede ayudar a identificar los sitios originales de ubiquitinación en la proteína.

Extracción basada en inmunoafinidad de péptidos ubiquitinilados: una técnica para extraer selectivamente péptidos marcados con ubiquitina a partir de fracciones de péptidos purificados

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.

Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

Aquí, describimos un flujo de trabajo de proteómica para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos de células. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas en la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis mediante una plataforma LC-MS/MS y el procesamiento de datos con software especializado.

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Anteriormente se desarrolló un sistema para el análisis automatizado y rápido de glicanos en proteínas. Este artículo presenta el protocolo para el "análisis glicocualitativo", optimizado para un amplio espectro de usuarios, como los que se dedican al análisis de estructuras de glicanos en biofarmacéuticos y otros materiales glicoconjugados.

Evaluación glicocualitativa rápida de proteínas recombinantes mediante un sistema totalmente automatizado

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Aprende una estrategia de purificación combinada para glicómica cuantitativa y proteómica mediante LC-MS/MS. Este método de alto rendimiento permite analizar simultáneamente N-glicanos y proteínas plasmáticas con alta reproducibilidad.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

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