Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

El objetivo general de este flujo de trabajo basado en un solo filtro es purificar fácil y cuantitativamente N-glicanos y proteínas en tándem a partir de muestras biológicas de análisis de espectrometría de masas. La escalabilidad, velocidad y reproducibilidad analítica de este método lo hace directamente accesible en lo que respecta a recursos y conjuntos de habilidades para los laboratorios de espectrometría biológica de masas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores investigar simultáneamente cuestiones de glucomica, ocupación del sitio de glicosilación y proteómica en estudios biológicos de alto rendimiento a gran escala.

Hemos superado los desafíos de las mediciones de N-glicanos al acoplar este método a una estrategia de derivación personalizada de espectrometría de masas que da como resultado una cuantificación precisa y relativa entre el cáncer y los estados de control. Con la reducción de la variabilidad analítica, se pueden dilucidar nuevas interacciones biológicas entre el glicoma y el proteoma, lo que proporciona información clave sobre los estados de la enfermedad y nuevas oportunidades para el descubrimiento de biomarcadores. Para empezar, cargue 2,5 microlitros de plasma en un filtro.

Luego, agregue 2 microlitros de solución de ditiotreitol 1M a cada muestra en el filtro. Diluir la muestra con 200 microlitros de tampón de digestión PNGasa de bicarbonato de amonio de 100 mM. Tape el tubo de muestra del filtro y agite ligeramente el vórtice, teniendo cuidado de no alterar el filtro desde su asiento.

Incubar la muestra a 56 grados centígrados durante 30 minutos para desnaturalizar las proteínas y glicoproteínas. Para alquilar las muestras, agregue 50 microlitros de yodoacetamida 1M para dar una concentración final de aproximadamente 200 mM. Luego, incube a 37 grados centígrados durante 60 minutos.

Concentre la glicoproteína desnaturalizada en el filtro centrifugando las muestras a 14.000 x g durante 40 minutos antes de descartar el flujo. Lave la muestra con 100 microlitros de tampón de digestión PNGase. Concentre la glicoproteína en el filtro y deseche el flujo.

Repita el paso de lavado y concentración dos veces para un total de tres veces, produciendo un concentrado en el volumen muerto del filtro. Deseche todo el flujo y el vial de recolección una vez que se completen los lavados. A continuación, añada 2 microlitros de péptido N-glicosidasa F o PNGasa F sin glicerol al filtro después de transferirlo a un vial de recogida fresco.

Agregue 98 microlitros de tampón de digestión PNGase, lo que eleva el volumen total a 100 microlitros, y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo en el filtro para mezclar. Para el pico en el protocolo de digestión, incube las muestras a 50 grados centígrados durante 2 horas. Trabajando rápidamente, retire las muestras y agregue 2 microlitros adicionales de PNGase F sin glicerol. Agite ligeramente las muestras durante 1 a 2 segundos para mezclar.

Incube las muestras a 50 grados centígrados durante 2 horas adicionales. Después de eludir los glicanos centrifugando la muestra a 20 grados centígrados, agregue 100 microlitros de tampón de digestión PNGase al filtro y vuelva a centrifugar. Recoja el lavado que contenga cualquier glicano ligado a N restante en el mismo vial de recolección que el eluyente.

Después de repetir dos veces, retire el filtro y colóquelo en un nuevo vial de recolección para la preparación proteómica. A continuación, incube las muestras de glicanos en el congelador a 80 grados centígrados durante 30 a 60 minutos hasta que se congelen. Luego, seque hasta completar a temperatura ambiente en un concentrador de vacío durante 4 a 6 horas.

Enjuague el filtro que contiene los péptidos desanimados con 400 microlitros de tampón de urea 8M. Tape el frasco de recolección y agite ligeramente el vórtice para mezclar. Concentre los péptidos en el filtro antes de desechar todo el flujo a través de él.

Después de repetir el lavado del tampón de urea dos veces más, enjuague el filtro que contiene los péptidos desanimados con tampón de digestión de tripsina. Tape el vial de recolección y agite ligeramente el vórtice para mezclar antes de concentrarse en el filtro nuevamente como antes. Deseche todo el flujo y repita 2 veces más para un total de 3 lavados con tampón de digestión de tripsina.

Recoja todos los eluyentes y lavados futuros en un nuevo vial de recolección. A continuación, añada 50 microlitros de tripsina porcina modificada en una proporción de tripsina a proteína de 1:50 para la proteómica de descubrimiento o una proporción de tripsina a proteína de 1:5 para experimentos de proteómica cuantitativa. Tape el frasco de recolección y agite ligeramente el vórtice para mezclar.

Después de incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 2 horas, trabaje rápidamente para eliminar las muestras y aumentar la cantidad de 50 microlitros adicionales de tripsina en la proporción adecuada de tripsina a proteína. Agite ligeramente las muestras durante 1 a 2 segundos para mezclar. Luego, incube a 50 grados centígrados durante 2 horas adicionales.

Después de la elución de los péptidos por centrifugación como antes durante 20 minutos, enjuague los péptidos restantes del filtro con tampón Quench. Eluir el filtro centrifugando como antes durante 15 minutos. Después de cuantificar la concentración de péptidos en las muestras, incube las muestras de péptidos en el congelador a 80 grados centígrados hasta que se congelen.

Luego, seque hasta completar a temperatura ambiente en un concentrador de vacío durante 4 a 6 horas. A continuación, las proteínas trípticas justo antes de la cromatografía líquida, la espectrometría de masas o el análisis LCMS en la fase A de Mobile hasta la concentración deseada. Las concentraciones de péptidos trípticos de plasma de 2,5 microlitros oscilan entre 100 y 300 nanogramos por microlitro.

Antes del análisis de glicanos, reconstituya los reactivos de 4-fenetil benzohidrazida marcados con isótopos estables secos, así como los reactivos P2GPN nativos en un mililitro de solución de derivación para una concentración final de 0,25 miligramos por mililitro. Los reactivos tardarán hasta 10 minutos en solubilizarse por completo. Extenso vórtice para garantizar una solubilzación completa.

Marque los N-glicanos secos con 200 microlitros de reactivo P2GPN nativo o marcado con isótopos estables. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender los glicanos secos. A continuación, haga un vórtice de las muestras y gírelas durante aproximadamente 5 segundos en una centrífuga de sobremesa.

Hacer reaccionar los glicanos con el reactivo durante 3 horas a 56 grados centígrados. Transfiera inmediatamente los glicanos de la incubadora al concentrador de vacío y seque hasta completar a 55 grados centígrados durante 3 a 5 horas. Vuelva a suspender el N-glicano marcado en 25 a 50 microlitros de agua justo antes de la cromatografía líquida y el análisis de espectrometría de masas.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo para asegurarte de que los N-glicanos estén completamente solubilizados. Después de centrifugar las muestras como antes durante 5 minutos, retire el sobrenadante, teniendo cuidado de que la punta de la pipeta no toque el fondo del tubo de centrífuga. Combine un par de muestras nativas y marcadas con isótopos estables en una proporción de 1:1 para el análisis en tándem de cuantificación relativa.

Preparar 2 métodos diferentes de LCMS para los flujos de trabajo de proteómica y glicomica. Para el análisis de proteínas, inyecte aproximadamente 400 nanogramos de proteína en la columna de NPA. Procese la muestra a 300 nanolitros por minuto, con un equilibrio de precolumna de 1 microlitro y un equilibrio de columna analítica de 5 microlitros.

Ionizar las proteínas en las condiciones de MS proporcionadas en el protocolo de texto. Para el análisis de glicanos, inyecte 5 microlitros de muestras de equi-M nativas y marcadas con isótopos estables con P2GPN resuspendidas en la columna. Ejecute la muestra a 300 nanolitros por minuto con un equilibrio de precolumna de 2 microlitros y un equilibrio de columna analítica de 5 microlitros.

A continuación, ionice los glicanos en las condiciones de MS proporcionadas en el protocolo de texto. El protocolo de purificación basado en filtro se comparó con el método estándar de extracción en fase sólida y las abundancias de glicanos plasmáticos detectadas entre los 2 protocolos no fueron significativamente diferentes. En ambos métodos, los mismos glicanos se encuentran cerca del límite de detección donde aumenta la variabilidad.

Se evaluó la intervariabilidad de las mezclas equiM de plasma purificado por el protocolo de extracción basado en filtro o estándar de fase sólida. Ambos protocolos tenían distribuciones gaussianas cuyas medias no eran significativamente diferentes de cero. El 80 por ciento de los glicanos se encontraban dentro de un doble cambio.

Las distribuciones de peso molecular de los glicanos detectadas en los protocolos de purificación nuevos y tradicionales no fueron significativamente diferentes y cubrieron el mismo rango. Cualitativamente, no se observó ningún sesgo entre los glicanos. Las proteínas plasmáticas se prepararon mediante la preparación estándar de muestras asistida por filtro y múltiples protocolos en línea.

El número de proteínas identificadas fue similar para los distintos protocolos. La desamidación inespecífica se controló en los protocolos de digestión por microondas e indigestión de picos a menos del 10 por ciento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la ocupación precisa del sitio de glicosilación depende de minimizar el calor y el tiempo de exposición.

Una vez dominado, la purificación de N-glicanos de pecurikene en línea se puede completar en 2 días. Siguiendo este procedimiento, se puede integrar y modelar la cuantificación precisa de la proteína N-glicano y la ocupación del sitio de glicosilación utilizando técnicas estadísticas de orden superior. Esta técnica permite leer rápidamente el complejo lenguaje que habla la biología del cáncer, comparar cuantitativamente las diferencias en la terapéutica de las proteínas y revelar realmente la importancia de la glicosilación en un contexto biológico.