Name: El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar células inmunes gingivales de ratón para estudiar la inmunidad oral y la patogénesis de la periodontitis. Este método permite obtener células viables suficientes para análisis funcionales detallados.

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Los autores fueron financiados en parte por el programa intramuros de NIDCR (N.M.M) y apoyados por una beca Wellcome Trust Stepping Stones (097820/Z/11/B a J.E.K) y por una beca del Centro Colaborativo de Manchester para la Investigación de la Inflamación (a J.E.K). Los autores agradecen a Teresa Wild por la revisión crítica del manuscrito.

Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo siguen las pautas requeridas y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, NIDCR / NIH. 1. Prepárese por adelantado <ol><li> Preparar medio completo: RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina y 10% de FBS. </li><li> Preparar medios DNasa: 50 ml de medio RPMI suplementado con 7,5 mg de DNasa (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento). </li><li> Preparar los medios de colagenasa-DNasa: 5 ml de medio DNasa más 3,2 mg / ml de colagenasa tipo IV (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento). </li><li> Pre-cool tampón FACS: 0,5% de SFB diluido en PBS. </li><li> centrifugadora pre-enfriamiento a 4 ° C. </li><li> agitador incubadora caliente a 37 ° C. </li></ol> 2. El aislamiento, la disección y aislamiento de células gingivales de los bloques <ol><li> La eutanasia a los ratones mediante la exposición a CO 2 en una cámara apropiada, según las directrices de ARAC. </li> &lt;li&gt; Abra la cavidad torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. Para perfundir, hacer una incisión en la vena cava inferior y perfundir 3 ml de PBS a través del ventrículo izquierdo con una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 G. </li><li> Inmovilizar el cuerpo y la cabeza del ratón sobre un cojín con el estómago hacia arriba. </li><li> Cortar cada comisura del labio hacia el cuello con unas tijeras, separando la piel que cubre la región de la mandíbula y el cuello, la exposición de los tejidos y los músculos subyacentes. Diseccionar el labio inferior para descubrir la mandíbula. </li><li> Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula e inmovilizar cada lado para acceder a la cavidad oral. </li><li> Visualizar y analizar el paladar lejos de la cavidad nasal. </li><li> Diseccionar áreas utilizando una cuchilla 10 e incluyen áreas molares maxilares y mandibulares y la zona gingival (Figura 1). Hacen incisiones verticales, justo por delante del primer molar y posterior al tercer molar y una incisión horizontal enel borde de la encía (blanco cuello de los dientes adyacentes de tejido). </li><li> Coloque el maxilar y mandibular bloques en un tubo cónico de 50 ml con 5 ml de colagenasa / DNasa (mantener en hielo). </li><li> Incubar en un incubador agitador a 37 ° C durante 1 hora y durante el último 5 min de incubación se añaden 50 l de 0,5 M EDTA. </li><li> Añadir 5 ml de medio de DNasa frío al tubo de 50 ml con los tejidos y agitar suavemente para mezclar. </li><li> La transferencia de los 4 bloques de tejido en una placa de Petri y cubrir con 500 l de DNasa medios. Eliminar encía de cada bloque de tejido, utilizando una hoja de bisturí y apuntando la hoja en las áreas gingivales y interdentales. </li><li> La transferencia de los tejidos y los medios de comunicación de la placa de Petri, así como los medios de comunicación de DNasa anteriores utilizados durante la disección, a un nuevo tubo de 50 ml a través del filtro de células (70 micras de tamaño). Lavar con medios DNasa (3-5 ml) todos los instrumentos utilizados y filtro. </li><li> Usando el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triturar el tejido contra el colador,filtración con medios DNasa frío (30 a 35 ml). </li><li> Lavar el filtro de células con DNasa medios frío. </li><li> Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 min. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio completo. </li><li> Recuento de células (la cantidad esperada debe oscilar entre 8 x 10 5 a 1,2 x 10 6 células con una viabilidad de&gt; 80%) usando un contador de células automatizado. </li></ol> 3. Estimulación y FACS La tinción de las células de la encía <ol><li> Estimular la suspensión de células individuales con PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 g / ml) en presencia de 1 l / ml de Brefeldina A. </li><li> Incubar durante 3,5 horas a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Centrifugar y lavar con PBS y centrifugar a 4 ° C; 314 xg durante 6 minutos. </li><li> Tinción de las células utilizando una mancha viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Mancha de marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCR, CD4, CD8, TCRγδ o de hormigasibodies de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Se lavan las células con tampón frío FACS y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> vórtice suavemente para perturbar el sedimento celular. </li><li> Fijar las células con 2% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan las células con tampón frío FACS, se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min y las manchas para citoquinas intracelulares. <ol><li> Llenar los tubos FACS con una solución de frío saponina 0,5% diluido en tampón de FACS y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Añadir 300 l de solución de saponina 0,5% a los tubos de FACS, se incuba durante 15 min en la oscuridad a 4 ° C y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Teñir las células para marcadores intracelulares (IL-17A y IFN o citocinas de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante. Lavar las células con solución de saponina 0,5% y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Lavar a continuación con FACStampón y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Volver a suspender las células en 300 l de tampón FACS. </li></ol></li><li> Analizar los resultados en un citómetro de flujo. </li></ol> 4. Análisis de Citometría de Flujo <ol><li> visualizar las células a analizar en adelante (FSC) y dispersión lateral (SCC) y la puerta para excluir los desechos. </li><li> Seleccionar celdas individuales con área de dispersión frontal (FSC-A) vs. parámetros de altura (FSC-H). </li><li> Células de puertas que son en vivo (como se indica por la tinción de viabilidad) y positivos para el marcador hematopoyéticas CD45 + para el análisis adicional (Figura 2A y 2C). </li><li> Continuar el análisis de marcadores específicos como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La técnica actual produce con éxito un gran número de células inmunes (de un solo ratón) adecuado, no sólo para la caracterización fenotípica, sino también para estudios funcionales ex vivo. Otro grupo había publicado previamente un protocolo para aislar y caracterizar células inmunes gingivales murino y se introduce el valor de la utilización de la citometría de flujo multicolor en el estudio de la periodontitis en modelos animales 9. Tras la resolución de problemas considerables la modificación cla...

Tejidos gingivales rodean la dentición humana y murina y están constantemente expuestos al complejo biofilm del diente 1. La red de células inmunes la vigilancia de la barrera gingival es vital para mantener la integridad del tejido, asegurando homeostasis con los microbios comensales locales y, al mismo tiempo, proporcionando una inmunidad eficaz contra el desafío patogénico 2. Para lograr la homeostasis, el sistema inmunológico está cuidadosamente adaptada al entorno gingival creación de una red de células inmunes altamente especializado, sin embargo, poco se conoce el detalle de las poblaciones de células inmunes gingivales y su papel en el mantenimiento de la inmunidad tisular 2. Cuando se interrumpe la homeostasis inmune en la encía, ya sea mediante el aumento de la susceptibilidad y / o presencia de comunidades microbianas dysbiotic, una condición inflamatoria del huésped, surge la periodontitis 3 4. La periodontitis es una enfermedad inflamatoria común, lo que lleva a la pérdida del diente sPOYO estructuras. En sus formas severas se observa en aproximadamente el 10% de la población general 5. La disección de los factores clave implicados en la susceptibilidad periodontitis y la progresión ha sido difícil 6. Sin embargo, los modelos animales han sido extremadamente útiles en la comprensión de los mecanismos de iniciación y progresión periodontitis 7. Los modelos pueden ser empleados para definir las poblaciones de células y mediadores moleculares clave que son vitales para el mantenimiento de la homeostasis inmune y el desarrollo de la unidad de la periodontitis. Tal visión va a transformar nuestra comprensión del control-encía específica de la homeostasis inmune y mejorar nuestra comprensión actual de la patogénesis de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí #10</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10010-00</td><td>Pinzas de astilla estériles</td></tr><tr><td></td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Agujas con bisel regular&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, 12,7 mm de longitud</td></tr><tr><td>Jeringas Monoject</td><td>Covidien 8881513934</td><td></td><td>Punta Luer-lock, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Sin Calcio y Magnesio</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Sin L-glutamina</td></tr><tr><td>DNasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV</td><td>Gibco (por Life technologies)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gemini Bioproductos</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg/ml</td><td>Calidad biológica</td><td>120-098-661EA Pluma</td><td></td></tr><tr><td>Strep</td><td>Gibco (por Life technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco (por Life technologies)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Calidad biológica</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polipropileno, estéril</td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros de células M</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Tubos</td></tr><tr><td>FACS estériles de 5 ml</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>estéril</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Contiene solución de brefeldina A</td></tr><tr><td>Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina Sal de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponina de corteza de quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas Aqua reparable</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse gamma delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IFN-&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival inmune

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Las redes de células inmunitarias en los tejidos desempeñan un papel vital en la mediación de la inmunidad local y en el mantenimiento de la homeostasis tisular, sin embargo, se sabe poco de las poblaciones de células inmunitarias residentes en la mucosa oral y la encía. Hemos establecido una técnica para el aislamiento y estudio de células inmunitarias de tejidos gingivales murinos, un área de exposición microbiana constante y un sitio vulnerable a una enfermedad inflamatoria común, la periodontitis. Nuestro protocolo permite una caracterización fenotípica detallada de las poblaciones de células inmunitarias que residen en la encía, incluso en estado estacionario. Nuestro procedimiento también produce suficientes células con alta viabilidad para su uso en estudios funcionales, como la evaluación de la secreción de citocinas ex vivo. Esta combinación de caracterización fenotípica y funcional de la red de células inmunitarias gingivales debería ayudar a investigar los mecanismos implicados en la inmunidad oral y la homeostasis periodontal, pero también permitirá avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la inmunopatología local.

Para ilustrar la aplicación del protocolo, mostramos los resultados representativos que examinan la red de células inmunes en la encía de los ratones con y sin periodontitis (WT vs. LFA - / -, Figura 2A - C). FACS representativos gráficos muestran células CD45 + hematopoyéticos vivos en la encía (Figura 2A, 2C). El aislamiento y la transformación de las células inmunes con este protocolo da suficien...

Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.

El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

El objetivo general de este método es aislar células inmunitarias gingivales para la caracterización detallada de las respuestas inmunitarias relacionadas con la inmunidad oral y la periodontitis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad oral, como qué factores celulares están implicados en la patogénesis de la periodontitis. Las principales ventajas de esta técnica son que permite la evaluación de la red de células inmunitarias orales y el aislamiento de un número suficiente de células viables para investigaciones posteriores in vitro.Como primer paso de este protocolo, comience colocando alfileres para inmovilizar el cuerpo del ratón y abra las cavidades torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. A continuación, realice una incisión en la vena cava y utilice una jeringa de 3 mililitros, equipada con una aguja de 27 gauge, para perfundir 3 mililitros de PBS a través del ventrículo izquierdo. Una vez que se haya eliminado toda la sangre, clave la cabeza del ratón sobre una bandeja de disección, con el estómago hacia arriba.Luego, use tijeras para cortar cada comisura del labio en dirección al cuello, separando la piel que cubre la región de la mandíbula y el cuello, y exponiendo los tejidos y músculos subyacentes. Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula. Inmovilice cada lado de la mandíbula separada con agujas de calibre 25 para acceder a la cavidad oral.Después de identificar el paladar, utilice una hoja quirúrgica número 10 para realizar incisiones verticales justo anterior al primer molar y posterior al tercer molar. A continuación, separe el tejido de la cavidad nasal y también seccione los bloques del maxilar. Luego elimine el tejido excesivo del borde de la encía y transfiera los bloques maxilar y mandibular a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 5 mililitros de colagenasa y DNasa sobre hielo.Digiera el tejido en un incubador con agitación a 37 grados Celsius durante una hora, añadiendo 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante los últimos cinco minutos. A continuación, añada 5 mililitros de medio de DNasa frío al tejido y mezcle suavemente el contenido del tubo girando. Luego, transfiera los cuatro fragmentos de tejido a una placa de Petri.Y cúbralos con 500 microlitros de medio fresco de DNasa. Utilice un escalpelo para eliminar la encía de cada bloque de tejido. Y transfiera todo el contenido del recipiente a un filtro celular de 70 micrones colocado encima de un tubo de 50 mililitros.Lave la placa de Petri y el colador con 3 a 5 mililitros de medio de DNasa fresco. Luego, utilice el émbolo de una jeringa estéril de 3 mililitros para machacar el tejido gingival contra la malla del colador. Enjuague el colador con 30 a 35 mililitros de medio de DNasa frío y centrifugue el filtrado.Luego, resuspenda el paladar en 1 mililitro de medio completo y determine el número de células viables. El aislamiento y procesamiento de células inmunitarias tal como se acaba de demostrar proporciona un número suficiente de células para realizar una estimulación ex vivo y la caracterización de los patrones de secreción de citoquinas de células gingivales procedentes tanto de animales de tipo salvaje como de animales susceptibles a periodontitis. De hecho, la composición de células inmunitarias gingivales en ratones puede analizarse como se muestra en estos gráficos de densidad que evalúan los compartimentos de células T y células asesinas naturales en ratones knockout de LFA susceptibles a periodontitis.Utilizando las estrategias de selección adecuadas, también se puede determinar la producción intracelular de citocinas en células T TCR beta CD4 positivas, TCR beta CD8 positivas, TCR gamma delta positivas, así como en células NK y células linfoides innatas. Una vez dominada la técnica, las células pueden aislarse en tres horas para la inmunotinción si el procedimiento se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar completar todos los pasos de manera eficiente y rápida, manteniendo las células en hielo siempre que no estén siendo manipuladas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de células, para responder preguntas adicionales relacionadas con la función de subpoblaciones celulares específicas.

isolation-characterization-functional-examination-gingival-immune

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método para aislar células del sistema inmune funcional del corazón es una alternativa a los métodos convencionales de digestión de colagenasa, que provoca la activación de células inmunes no deseadas, lo que resulta en una disminución de la respuesta de estas células. Nuestro método de aislamiento de los rendimientos de las células inmunes funcional cardiaca, evitando los problemas asociados con la digestión enzimática.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de la red de células inmunes gingivales a partir de un modelo de ratón. La digestión enzimática libera el tejido gingival de los dientes y el hueso adheridos, que se digiere mecánicamente, liberando células inmunitarias de la encía. Las células aisladas están listas para experimentos inmunológicos.

Aislamiento de la red de células inmunitarias gingivales de bloques dentales murinos

Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.

El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

Este artículo presenta dos protocolos: uno para medir las bacterias anaeróbicas que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias anaeróbicas interactuando con las células huésped. Este estudio se puede aplicar a cualquier anaerobio cultivable y a cualquier tipo de célula eucariota.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

La superficie ocular normal expuesta consiste en córnea y conjuntiva. Las células epiteliales, las células caliciformes y las células inmunes están presentes en la conjuntiva. Aquí, se describe una técnica no invasiva de citología de impresión usando un dispositivo de citología de impresión y citometría de flujo para analizar células inmunes en la conjuntiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.

Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

El protocolo actual presenta un método rápido, eficiente y suave para aislar células individuales adecuadas para el análisis de ARN-seq de una sola célula a partir de un incisivo de ratón en crecimiento continuo, molar de ratón y dientes humanos.

Aislamiento rápido de células individuales de dientes de ratón y humanos

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque estandarizado para evaluar cuantitativamente la integridad de la barrera epitelial gingival murina mediante la aplicación tópica de dextranos marcados con fluorescencia de diferentes tamaños moleculares sobre la superficie gingival in vivo, seguido de imágenes ex vivo mediante un sistema de microscopía de fotón único.

Evaluación funcional de la barrera epitelial gingival del ratón utilizando trazadores fluorescentes

Aprende a aislar y caracterizar células inmunes gingivales de ratón para estudiar la inmunidad oral y la patogénesis de la periodontitis. Este método permite obtener células viables suficientes para análisis funcionales detallados.

El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

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