El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

El objetivo general de este método es aislar células inmunitarias gingivales para la caracterización detallada de las respuestas inmunitarias relacionadas con la inmunidad oral y la periodontitis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad oral, como qué factores celulares están implicados en la patogénesis de la periodontitis. Las principales ventajas de esta técnica son que permite la evaluación de la red de células inmunitarias orales y el aislamiento de un número suficiente de células viables para investigaciones posteriores in vitro.

Como primer paso de este protocolo, comience colocando alfileres para inmovilizar el cuerpo del ratón y abra las cavidades torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. A continuación, realice una incisión en la vena cava y utilice una jeringa de 3 mililitros, equipada con una aguja de 27 gauge, para perfundir 3 mililitros de PBS a través del ventrículo izquierdo. Una vez que se haya eliminado toda la sangre, clave la cabeza del ratón sobre una bandeja de disección, con el estómago hacia arriba.

Luego, use tijeras para cortar cada comisura del labio en dirección al cuello, separando la piel que cubre la región de la mandíbula y el cuello, y exponiendo los tejidos y músculos subyacentes. Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula. Inmovilice cada lado de la mandíbula separada con agujas de calibre 25 para acceder a la cavidad oral.

Después de identificar el paladar, utilice una hoja quirúrgica número 10 para realizar incisiones verticales justo anterior al primer molar y posterior al tercer molar. A continuación, separe el tejido de la cavidad nasal y también seccione los bloques del maxilar. Luego elimine el tejido excesivo del borde de la encía y transfiera los bloques maxilar y mandibular a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 5 mililitros de colagenasa y DNasa sobre hielo.

Digiera el tejido en un incubador con agitación a 37 grados Celsius durante una hora, añadiendo 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante los últimos cinco minutos. A continuación, añada 5 mililitros de medio de DNasa frío al tejido y mezcle suavemente el contenido del tubo girando. Luego, transfiera los cuatro fragmentos de tejido a una placa de Petri.

Y cúbralos con 500 microlitros de medio fresco de DNasa. Utilice un escalpelo para eliminar la encía de cada bloque de tejido. Y transfiera todo el contenido del recipiente a un filtro celular de 70 micrones colocado encima de un tubo de 50 mililitros.

Lave la placa de Petri y el colador con 3 a 5 mililitros de medio de DNasa fresco. Luego, utilice el émbolo de una jeringa estéril de 3 mililitros para machacar el tejido gingival contra la malla del colador. Enjuague el colador con 30 a 35 mililitros de medio de DNasa frío y centrifugue el filtrado.

Luego, resuspenda el paladar en 1 mililitro de medio completo y determine el número de células viables. El aislamiento y procesamiento de células inmunitarias tal como se acaba de demostrar proporciona un número suficiente de células para realizar una estimulación ex vivo y la caracterización de los patrones de secreción de citoquinas de células gingivales procedentes tanto de animales de tipo salvaje como de animales susceptibles a periodontitis. De hecho, la composición de células inmunitarias gingivales en ratones puede analizarse como se muestra en estos gráficos de densidad que evalúan los compartimentos de células T y células asesinas naturales en ratones knockout de LFA susceptibles a periodontitis.

Utilizando las estrategias de selección adecuadas, también se puede determinar la producción intracelular de citocinas en células T TCR beta CD4 positivas, TCR beta CD8 positivas, TCR gamma delta positivas, así como en células NK y células linfoides innatas. Una vez dominada la técnica, las células pueden aislarse en tres horas para la inmunotinción si el procedimiento se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar completar todos los pasos de manera eficiente y rápida, manteniendo las células en hielo siempre que no estén siendo manipuladas.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de células, para responder preguntas adicionales relacionadas con la función de subpoblaciones celulares específicas.