El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

El objetivo general de este método es aislar células inmunitarias gingivales para la caracterización en profundidad de las respuestas inmunitarias relacionadas con la inmunidad oral y la periodontitis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad oral, como qué factores celulares están implicados en la patogénesis de la periodontitis. Las principales ventajas de esta técnica son que permite la evaluación de la red de células inmunitarias orales y el aislamiento de suficientes células viables para investigaciones in vitro posteriores.

Como primer paso de este protocolo, comienza colocando alfileres para inmovilizar el cuerpo del ratón y abrir las cavidades torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. A continuación, haga una incisión en la vena cava y utilice una jeringa de 3 mililitros, equipada con una aguja de calibre 27, para profusar 3 mililitros de PBS a través del ventrículo izquierdo. Cuando se haya purgado toda la sangre, sujeta la cabeza del ratón en una almohadilla de disección, con el estómago hacia arriba.

Luego use tijeras para cortar cada comisura del labio hacia el cuello, separando la piel que cubre la mandíbula y la región del cuello, y exponiendo los tejidos y músculos subyacentes. Corta entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula. Inmovilice cada lado de la mandíbula separada con agujas de calibre 25 para acceder a la cavidad oral.

Después de identificar el paladar, use una cuchilla quirúrgica número 10 para hacer incisiones verticales justo antes del primer molar y posteriores al tercer molar. A continuación, disecciona el tejido lejos de la cavidad nasal y también disecciona los bloques de la mandíbula. A continuación, elimine el exceso de tejido del borde de la encía y transfiera los bloques maxilares y mandibulares a un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 5 mililitros de colagenasa y DNasa en hielo.

Digiera el tejido en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante una hora, añadiendo 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante los últimos cinco minutos. A continuación, añada 5 mililitros de medio DNasa frío a los pañuelos y mezcle suavemente el contenido del tubo girando. A continuación, transfiera los cuatro bloques de tejido a una placa de Petri.

Y cúbrelos con 500 microlitros de medio de DNasa fresca. Use un bisturí para extraer la encía de cada bloque de tejido. Y transfiera todo el contenido del plato a un colador de celdas de 70 micras encima de un tubo de 50 mililitros.

Lave la placa de Petri y el colador con 3 a 5 mililitros de medio de DNasa fresca. Y luego use el émbolo de una jeringa estéril de 3 mililitros para triturar el tejido gingival contra la malla del colador. Enjuague el colador con 30 a 35 mililitros de medio DNasa frío y centrifugue el filtrado.

Luego resuspender el paladar en 1 mililitro de medio completo, y determinar el número de células viables. El aislamiento y procesamiento de las células inmunitarias, como se acaba de demostrar, produce un número suficiente de células para realizar una estimulación y caracterización ex-vivo de los patrones de secreción de citocinas de las células gingivales de animales tanto de tipo salvaje como susceptibles a la periodontitis. De hecho, la composición de las células inmunitarias gingivales murinas puede analizarse, como se demuestra en estos gráficos de densidad que evalúan los compartimentos de células t y asesinas naturales en ratones knockout de LFA susceptibles a la periodontitis.

Utilizando las estrategias de activación adecuadas, también se puede determinar la producción de citocinas intracelulares de los linfocitos T TCR beta CD4 positivos, TCR beta CD8 positivos y TCR gamma delta positivos, así como de NK y células linfoides innatas. Una vez dominadas, las células se pueden aislar en tres horas para inmunotinción si la técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar completar todos los pasos de manera eficiente y rápida, manteniendo las células en hielo siempre que no estén siendo manipuladas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de celdas, para responder preguntas adicionales relacionadas con la función de los subconjuntos de celdas específicos.