Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

El objetivo general de esta técnica es poder cuantificar diferentes metaloproteínas en patrones complejos basados en el uso de patrones de metaloproteínas conocidos. Este método puede responder a preguntas clave sobre el papel de los metales en la biología. Por ejemplo, ¿cómo cambia el estado metálico de una proteína en una enfermedad?

Una ventaja clave de esta técnica es que permite medir el estado metálico de una proteína en su estado nativo. La demostración de la técnica estará a cargo de Amber Lothian, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para empezar, tejido homogeneizado, o muestras de cultivo celular, mediante descensos manuales o sonicación durante cinco minutos utilizando solución salina tamponada Tris.

Clarificar homogeneizados por centrifugación a 16.000 veces G, durante cinco minutos. Después de recolectar el sobrenadante resultante, normalice la cantidad total de proteína determinando las concentraciones de proteína como se describe en el protocolo de texto. Caliente y ajuste el maspectrómero de plasma acoplado inductivamente, utilizando los protocolos del fabricante.

Diluya los estándares de metaloproteína para disfrutar de la caída dentro del rango de cero a 500 microgramos por litro, utilizando ácido nítrico al uno por ciento. Para lograr estándares dentro de este rango, no utilice diluciones superiores a uno y 20. Configure el orden de las inyecciones analizando primero los siete niveles de calibración.

Concentraciones que van de cero a 500 microgramos por litro, seguidas de los estándares de metaloproteínas. Los siete niveles de calibración son cero, uno, cinco, diez, 50, 100 y 500 microgramos por litro. A continuación, seleccione los elementos de interés.

Aquí, use hierro, cobre, zinc, cobalto y yodo. Ya que son los elementos a los que están ligados los patrones de proteínas. Seleccione los elementos en el método de adquisición abriendo la pestaña selector de elementos y agregando los elementos y sus respectivas masas isotópicas que se van a analizar.

A continuación, realice el análisis de muestras con el instrumento. El software del instrumento crea automáticamente las curvas de calibración para cada uno de los elementos que se están analizando. Utilice las curvas de calibración para determinar la concentración de metal en las muestras desconocidas.

A partir de los resultados del análisis masivo, genere los estándares de metaloproteínas que incluyen los tres oligoelementos más abundantes en los tejidos de mamíferos utilizando una mezcla de cobre, superóxido de zinc dismutasa y ferritina. Purgue la cromatografía rápida de alto rendimiento, o bombas de HPLC, con tampón de nitrato de amonio de 200 milimolares durante cinco minutos a un caudal de cinco mililitros por minuto. Una vez purgado el sistema, ajuste el caudal a cero punto un mililitros por minuto.

Y conecte la columna de exclusión del lado. Conecte el extremo opuesto de la columna al detector UV, establezca la absorbancia de medición en 280 nanómetros, utilizando un tubo de pico. Aumente gradualmente el caudal de la columna en incrementos de cero coma un mililitros por minuto, hasta alcanzar un caudal final de cero coma cuatro mililitros por minuto.

Mientras esto ocurre, revise las conexiones de los tubos a la columna para ver si hay fugas. Monitoree la presión de este sistema para asegurarse de que no exceda los requisitos de la columna observando la traza de presión en el cromatograma en el software. Deje que la columna se equilibre al caudal requerido en volúmenes de cinco a 10 columnas.

Una vez que esté equilibrado, conecte los instrumentos para permitir que se realice el análisis de la muestra. Configure el método de HPLC para bombear el tampón A sobre la columna a cero coma cuatro mililitros por minuto, durante 15 minutos. Coloque el ICPMS en modo de espera antes de cambiar la configuración de hardware.

Una vez en modo de espera, apague la comunicación para el muestreador automático y cambie la introducción de la muestra a otra. Utilice tubos de PEEK para conectar el flujo de salida del detector UV directamente al nebulizador del ICPMS. Encienda el ICPMS y deje que el instrumento se caliente durante 10 a 20 minutos.

Después de que el plasma se haya encendido, conecte el cable remoto del ICPMS a la parte posterior del muestreador automático de HPLC. Hazlo una vez que el plasma se haya encendido. De lo contrario, el sistema HPLC se apagará automáticamente, ya que el ICPMS no está encendido.

Cambie el método ICPMS para recopilar datos para LC ICPMS modificando primero el método de adquisición de espectro a adquisición de resolución de tiempo. A continuación, seleccione los elementos que se van a analizar. Hierro, cobre, zinc, cobalto, yodo, así como cualquier otro elemento de interés, y establecer tiempos de integración.

Una vez elegidos los elementos de interés, ajuste el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo de ejecución de la cromatografía. Ajuste manualmente el ICPMS para la sensibilidad y los caudales de gas helio de la celda de colisión con un tampón de cromatografía que fluye con cesio y antimonio incluidos en el tampón. Una vez que los recuentos de iones metálicos se han estabilizado y los valores relativos de desviación estándar están por debajo del cinco por ciento, el sistema está listo para usar.

Cree listas de ejecución de muestra en los programas de software HPLC e ICPMS. La lista de ejecución de muestras contiene el orden en el que se va a inyectar cada una de las muestras. Así como el nombre por el que se guardarán los datos.

Compruebe que el número total de muestras de la lista coincida entre los dos programas. Inicie el lote de muestras para el ICPMS antes de la HPLC, ya que la inyección de la muestra por parte de la HPLC activará el ICPMS para comenzar a recopilar datos. Si esto no se hace en el orden correcto, faltarán datos.

Genere puntos de curva de calibración inyectando volúmenes variables del patrón mixto de superóxido dismutasa y ferritina. Los volúmenes de inyección van desde un microlitro hasta 30 microlitros. Por último, analice cada una de las muestras desconocidas, como tejido, plasma o cultivo celular, antes de analizar los datos tal y como se describe en el protocolo de texto.

Se muestra la ilusión de ferritina en un rango de 2000 a 60.000 picogramos de hierro inyectado en la columna. El análisis de regresión se realizó utilizando el área de picos. Los perfiles de ilusión para cobre, zinc, superóxido dismutasa se muestran tanto para cobre como para zinc.

También se muestran los análisis de regresión generados utilizando áreas de picos. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos sin procesar en recuentos por segundo a picogramos por segundo. De modo que la cantidad de metal asociada a la proteína puede determinarse cuantitativamente.

Esta técnica se puede utilizar para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Aquí, se muestra el cerebro humano separado por SEC ICPMS. Cada uno de los cuales representa un metal de interés diferente.

A saber, cobre, zinc o hierro. Aquí se muestran los rastros obtenidos cuando el plasma humano se somete a esta técnica. La complejidad y abundancia de la muestra influirá en el número de picos que se ven.

Como era de esperar, el plasma está dominado por unas pocas metaloproteínas, como la ceruloplasmina y la transferrina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un instrumento para medir el estado nativo de las metaloproteínas en muestras complejas. Una vez dominada, esta técnica se puede aplicar con éxito en tres o cuatro horas.

Esto permite analizar de 20 a 36 muestras en un solo día. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar los estándares de metaloproteína adecuados, como el SOD de cobre y zinc si está interesado en el cobre y el zinc. Así como los estándares internos en el tampón, como el cesio, que le permite corregir cualquier desviación en el instrumento con el tiempo.

Siguiendo este procedimiento, también puede implementar otras formas de espectrometría de masas para responder a preguntas importantes. Por ejemplo, ¿cuáles son las metaloproteínas presentes en mi muestra? Esto se puede hacer mediante viajes estándar en la digestión y la secuenciación de péptidos de proteínas con espectrometría de masas.

O bien, analizando las proteínas intactas, en su estado nativo. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica comprendan el papel de las metaloproteínas en enfermedades como el Alzheimer. No hay que olvidar que se trabaja con ácido nítrico concentrado, y muestras clínicas.

Se debe usar equipo de protección personal adecuado.