Name: Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a cuantificar metaloproteínas en muestras biológicas mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a ICP-MS. Este método permite analizar el estado metálico de proteínas en su estado nativo.

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Nos gustaría reconocer el apoyo del Programa de Gobierno de Victoria Operacional Apoyo a la Infraestructura, el proyectos de vinculación Esquema Consejo de Investigación Australiano (con Agilent Technologies), el Centro de Investigación Cooperativa del Consejo de Investigación Médica, el banco de cerebros de estilo victoriano, Nacional de Salud y de Australia para la Salud Mental y el Neuroproteomics instalaciones.

1. Preparación de tampones y muestras <ol><li> Preparar 500 ml de tampón, 200 mM de nitrato de amonio de pH 7.6 a 7.8 (pH ajustado con hidróxido de amonio (NH 4 OH)) con cesio (Cs) y antinomia (Sb) a una concentración final de 10 ppb. Utilice cesio y antinomia como patrones internos para controlar cualquier desviación en la respuesta de ICP-MS. tampón de filtro antes de su uso a través de un filtro de 0,22 micras. </li><li> Preparar la muestra en función del tipo de muestra: líquido, tejido o cultivo celular. <ol><li> Para las muestras que requieren la homogeneización (por ejemplo, tejido o células), asegurarse de que no contienen detergente. Utilizar tampones Tris para la preparación de la muestra. Como alternativa, utilizar tampones de fosfato pero pueden afectar negativamente a la metalloproteome con el tiempo o con los ciclos de congelación y descongelación 12. </li><li> Homogeneizar de tejido o cultivo de células de las muestras por Dounce manual o sonicación durante 5 min usando Tris solución salina tamponada (50 mM Tris pH 8,0, cloruro de sodio 150 mM(NaCl) + ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) inhibidores de la proteasa libres). </li><li> Aclarar homogeneizados por centrifugación a 16.000 xg durante 5 min. Recoger el sobrenadante resultante. Mantener las muestras a 4 ° C. Nota: Todas las muestras deben ser centrifugadas antes de cargar en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) viales para evitar que las partículas de bloquear la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). </li></ol></li><li> Normalizar la cantidad total de proteína cargada en la columna a través de las muestras. Determinar las concentraciones de proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV micro volumen 13. De carga entre 20 y 150 g de proteína. Utilice volúmenes de inyección típicos que van desde 2 hasta 80 l dependiendo de la concentración de la muestra. <ol><li> Limpiar el brazo de muestra del espectrofotómetro UV micro volumen con agua destilada antes de la carga de la muestra. El brazo de muestra es donde se cargan las muestras de proteínas. </li><li> En blanco el instrumento frente a 2 l de THtampón de muestra e. Entonces, la carga 2 l de cada muestra en el brazo y medir la absorbancia a 280 nm. </li><li> Determinar las concentraciones. Para las muestras de proteína cruda, utilizar un coeficiente de extinción de 1 Abs = 1 mg / ml. Para determinar la concentración de proteína en las muestras, utilizar la ley de Beer-Lambert, A = ε xlxc, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, l es la longitud de la trayectoria en centímetros y c es la concentración. </li></ol></li></ol> 2. Análisis de las Normas granel metalloprotein El uso de plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas <ol><li> Calentamiento y afinar el instrumento utilizando los protocolos del fabricante. </li><li> Una vez instrumento se calienta y afinado, realice mayor ICP-MS. Nota: Las soluciones madre de metaloproteínas purificados generalmente necesitan ser diluidas antes de la medición. La concentración de metal de la norma puede estimarse a partir de la proteína conocida: stochiometries de metal y la concentración de proteína estimadación. Esta información se puede utilizar para determinar la dilución que será apropiado para caer dentro del rango de la curva estándar generada. <ol><li> Diluir normas metaloproteínas, tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y vitamina B 12, para asegurar que caen dentro del rango de 0 - 500 g / L, usando ácido nítrico 1%. Para alcanzar los estándares dentro de este rango, no utilice diluciones superiores a 1 en 20. Realizar diluciones seriadas en agua para diluir las existencias antes de esto, si es necesario. </li><li> Configurar el orden de las inyecciones. En primer lugar, analizar los siete niveles de calibración, concentraciones que van desde 0 hasta 500 g / L, seguidos por los estándares de metaloproteínas. Los siete niveles de calibración son 0, 1, 5, 10, 50, 100 y 500 g / L. </li><li> Seleccionar elementos de interés. A continuación, utilice Fe, Cu, Zn, Co y yo, ya que son los elementos que los patrones de proteínas están obligados a. Seleccionar los elementos en el método de adquisición mediante la apertura de la pestaña selector de elementos y agregando el eleme<html> NTS y ​​sus respectivas masas de isótopos que se van a analizar. </li><li> Realizar análisis de la muestra con el instrumento y el software del instrumento crea automáticamente las curvas de calibración para cada uno de los elementos que se analiza. Las curvas de calibración son creados por el software mediante el trazado de la cuentas / s del metal detectado en contra de la cantidad de metal que la norma está destinado a contener, en mg / l. Usar las curvas de calibración para determinar la concentración de metal en las muestras desconocidas. Nota: El uso de la curva de calibración, el software determina la concentración de metal en cada una de las normas de metaloproteínas. </li><li> De los resultados del análisis a granel, generar normas metaloproteínas que incluyen los tres elementos traza más abundantes en los tejidos de mamíferos usando una mezcla de Cu, Zn superóxido dismutasa (SOD) se diluyó a 200 mg / L de cobre y zinc y ferritina (FTN) en una final concentración de 2,000 mg / L de hierro. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Configuración del sistema HPLC de exclusión por tamaños y cromatografía en columna de equilibrado Nota: Esta sección debe realizarse de forma paralela a la anterior, ya que ambos requieren cerca de 1 - 1,5 horas para completar. <ol><li> Bombas de purga HPLC con tampón realizada en el paso 1.1 y purgar las bombas para 5 min a una velocidad de flujo de 5 ml / min. </li><li> Una vez que el sistema se purga, establecer la velocidad de flujo de 0,1 ml / min y conectar la columna de exclusión de tamaño (4,6 x 300 mm, 3 m, 150 Å). Nota: Una conexión húmedo entre el tubo y la columna evita las burbujas de aire están atrapadas durante la conexión de la columna. </li><li> Conectar el extremo opuesto de la columna para el detector UV fijado para medir la absorbancia a 280 nm usando un tubo de PEEK. </li><li> Gradualmente aumentar la velocidad de flujo de la columna en incrementos de 0,05 a 0,1 ml / min hasta una velocidad de flujo final de 0,4 ml / min se alcanza. Mientras esto ocurre, compruebe las conexiones de la tubería a la columna que no haya fugas. Monitorear la presióndel sistema para asegurar que no supere los requisitos de columna mediante la observación de la traza de la presión en el cromatograma en el software. </li><li> Deja la columna equilibrar a la velocidad de flujo requerida de más de 5 - 10 volúmenes de columna. Después de que se equilibra, conectar los instrumentos que permiten el análisis de la muestra que se produzca. </li><li> Configurar el método de HPLC hasta la bomba tampón A sobre la columna a 0,4 ml / min durante 15 min. </li></ol> 4. Configuración y ejecución de exclusión por tamaños - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Nota: Los procedimientos operativos pueden variar entre los instrumentos y modelos. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para aprender más acerca de cómo configurar el ICP-MS está utilizando. <ol><li> Coloque el ICP - MS en modo de espera antes de cambiar la configuración de hardware. <ol><li> Una vez en el modo de espera, apagar la comunicación para el muestreador automático y cambiar la introducción de la muestra al &quot;otro&quot;. Nota: Dependiendo del software y duroArtículos de configuración seleccionando &quot;HPLC&quot; como fuente de introducción de muestras se puede utilizar. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para saber si esta opción está disponible. </li></ol></li><li> Utilice PEEK tubo (ID 0,13 mm) para conectar el flujo de salida desde el detector de UV directamente al nebulizador en la ICP-MS. </li><li> El poder una copia de seguridad del ICP - MS y deje que el instrumento se caliente durante 10 - 20 min. </li><li> Después de que el plasma ha encendido, conecte el cable alejado de la ICP - MS de la parte posterior del inyector automático HPLC. Para ello, una vez que el plasma se ha encendido; de lo contrario el sistema de HPLC se apagará automáticamente desde el ICP - MS no está encendida. </li><li> Cambiar el método ICP-MS para recopilar datos para LC-ICP-MS. <ol><li> Alterar el método de adquisición de espectro para la adquisición de tiempo de resolución (TRA). </li><li> Seleccionar los elementos a analizar, Fe, Cu, Zn, Co, I, así como cualesquiera otros elementos de interés, y establecer tiempos de integración (típicamente entre 0,05 a 0,3 seg). Después de que los elementos de interés de unare elegido, ajustar el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo de ejecución para la cromatografía (por ejemplo, 900 segundos para una carrera de cromatografía 15 min). </li><li> Sintonización manual de la ICP - MS para el helio sensibilidad y la colisión de células (He) las tasas de flujo de gas con el tampón de cromatografía que fluye usando Cs y Sb incluyen en la memoria intermedia. Las velocidades de flujo Él son típicamente ~ 1 ml / min menos que los utilizados para el análisis a granel. Una vez que los recuentos de iones metálicos se han estabilizado y valores de la desviación estándar relativa (RSD) están por debajo de 5%, el sistema está listo para usar. </li></ol></li><li> Hacer listas de conductos de muestra tanto en la HPLC y los programas de software de ICP-MS. La lista de ejemplos de ejecución contiene el orden en que cada una de las muestras se ha de inyectar, así como el nombre con el que se guardarán los datos. Compruebe que el número total de muestras en el partido de la lista entre los dos programas. </li><li> Iniciar el lote de muestra de la ICP-MS antes de la HPLC, como la inyección de la muestra por el HPLC dará lugar a la ICP - MS para comenzar a recogerdatos. Si esto no se hace en el orden correcto que dará lugar a los datos que faltan. </li><li> Generar puntos de la curva de calibración mediante la inyección de volúmenes variables de la SOD y estándar mezclado FTN de 200 mg / l a 6.000 g / L inyecta en la columna para Cu y Zn y 2.000 mg / l hasta 60.000 mg / l para el Fe. Los volúmenes de inyección oscilan de 1 a 30 l. Nota: Estos intervalos de concentración abarcan las concentraciones de Fe, Cu y Zn típicamente observados en homogeneizados de complejos. Para muestras que contienen sólo proteínas purificadas el rango máximo de la curva debe ajustarse en consecuencia. A medida que la cantidad de metal asociado con la proteína puede requerir un rango más pequeño o más grande ya que hay menos contaminación en la muestra de otros factores. </li><li> Analizar cada uno de los cultivos de tejidos muestras desconocidas, plasma o célula. </li></ol> 5. Análisis de datos, manipulación y visualización <ol><li> Almacenar los datos en el valor separados por comas (CSV) formato de archivo y cargar into programas de procesamiento según sea necesario. </li><li> Con el fin de controlar la deriva del instrumento, dividir las cuentas por segundo para cada elemento de las cuentas por segundo, ya sea para Cs o Sb. </li><li> Generar curvas de calibración para cada uno de los elementos. <ol><li> Determinar el área bajo el pico de metal que corresponde a la metalloprotein que está obligado a para cada una de las inyecciones mediante la realización de la integración de picos en el software de análisis de datos preferida. </li><li> Trazar el área bajo el pico de metal frente a la cantidad total del metal que fue inyectado en la columna en cada ejecución, 200 - 6000 g / L de Cu y Zn y 2000 - 60.000 mg / L de Fe. Realizar un análisis de regresión lineal de acuerdo con el protocolo de software. </li><li> Utilizar los resultados de pendiente a partir del análisis de regresión lineal como un factor para convertir cuentas por segundo a pg / seg. Divide cada una de las cuentas por segundo puntos de datos en todo el cromatograma por el gradiente de la línea de valor. </li></ol></li><li> Graficar los datos enpg / seg para el tiempo cromatograma. Determinar el área bajo los picos de interés. El área bajo el pico representa la cantidad total de metal que la proteína se une a, en pg. </li><li> Generar una calibración basado en el peso molecular de las metaloproteínas conocida y la hora a la que se eluyen. Use esto para estimar el tamaño de los picos de proteínas en muestras complejas. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Asegurar el estado nativo de la proteína significa una atención especial a los tampones y es necesario efectuar el almacenamiento de la muestra. No se pueden emplear todas las técnicas de cromatografía o técnicas de preparación de muestras. Es importante que los tampones utilizados en la preparación de muestras y la cromatografía están desprovistas de quelantes de metales y tampones de uso que imitan pH y concentraciones de sal fisiológicas. Otras condiciones a evitar incluyen el calentamiento de la muestra o la adición de agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, urea). Es crítico para reducir al mínimo el número de ciclos de congelación y descongelación. La capacidad de la memoria intermedia elegida para unir metales divalentes también es importante y es una razón que Tris o de amonio tampones nitrato se eligen entre topes basados ​​en fosfato. La capacidad de baja resolución y pico de la cromatografía de exclusión de tamaño en relación con otras formas de cromatografía es una limitación importante de esta técnica. Sin embargo, la naturaleza suave de tamaño chromatogra exclusiónphy es importante mantener el estado nativo de la proteína y por lo tanto preservar los enlaces metal-proteína relativamente débiles. El requisito para mantener el estado natural de las proteínas requiere especial atención al tratamiento de las muestras, incluyendo la limitación del número de ciclos de congelación y descongelación, evitando quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) o sales y detergentes caotrópicos. Esta baja resolución de este impactos técnica de la capacidad de cuantificar la cantidad de metal asociado con una proteína específica si se encuentra en una muestra compleja como los picos observados contendrá más de una proteína. Por lo tanto, la cantidad de metal se determina utilizando el pico de la integración sería una indicación de la cantidad total de metal asociado con todas las proteínas que eluye a este punto de tiempo y no sólo una proteína específica. Con el fin de superar esta limitación la proteína de interés tendría que purificarse adicionalmente en condiciones nativas. Esto permitiría la cuantificación deel metal asociado con esta proteína que se informó con un mayor grado de certainity. Otra limitación potencial de esta técnica sería la pérdida de proteína debido a la unión reversible no a la columna. Con el fin de determinar si esto está ocurriendo un experimento de recuperación debe ser llevado a cabo mediante el cual se analiza la cantidad de proteína de elución de la columna para determinar si este coincide con la cantidad inyectada. El mismo se puede hacer mediante la medición del contenido de metal del material de elución y el material de partida por mayor ICP-MS. La recuperación de la columna puede variar dependiendo de las condiciones usadas, pero se ha demostrado que la recuperación completa de proteínas a partir de una columna de exclusión por tamaño es posible 9. Por lo tanto, es importante comprobar si hay o no hay ninguna pérdida en las condiciones de operación que se utiliza. Las modificaciones en el protocolo pueden estar relacionados con las normas metaloproteínas que se utilizan, así como los elementos analizados. El tipo de norma metaloproteına nosotrosed será diferente dependiendo de los elementos que son de interés. Para los elementos tales como Cu, Fe y Zn proteínas, se emplean SOD y ferritina. Cualquier otro metalloprotein que tienen stoichometries conocidos también se pueden utilizar y algunos ejemplos se han mostrado aquí. Una de las principales complicaciones que pueden surgir de la utilización de esta técnica es la acumulación de cristales de sal en la antorcha del ICP-MS. Para evitar la acumulación de cristales de sal, la antorcha se lava con agua destilada después de cada 500 - 1000 ml de tampón que se ha transmitido a través del sistema o cuando se determina mediante inspección visual de que el soplete se debe lavar. Otro problema que puede surgir es un descenso más rápido de la limpieza de los conos y extracción de muestras. Estos deben ser limpiados con regularidad siguiendo los protocolos del fabricante. La preparación de la muestra inicial es el paso más crítico en el protocolo. Si hay algún cambio en la proteína - complejo de metal de la información generado no será válida. Esta es una de las principales limitaciones de la técnica; Además el uso de la baja resolución, columna de exclusión por tamaño se obtiene una vista de detalle limitado de la verdadera complejidad de metaloproteínas de la biología. La técnica descrita aquí permite la expansión del conocimiento de la metalloproteome de un organismo. El análisis a granel sólo da una indicación aproximada de los cambios a la cantidad de metal dentro de una muestra. Además de las consideraciones generales que deben tenerse en cuenta, esta técnica proporciona una herramienta que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de metal asociado con proteínas, así como la identificación de metaloproteínas que difieren mediante la comparación de las trazas obtenidas. El uso de esta técnica se puede emplear para identificar las diferencias entre los estados de enfermedad. Los metaloproteınas identificados a continuación, pueden investigarse más a fondo para ayudar a determinar el papel que desempeñan en los procesos de enfermedad. La aplicación de un guión ICP-MS tiene un crecimientofuturo para determinar el papel de los fármacos que tienen un heteroátomo tal como el platino, el yodo o el cobre como el ICP-MS se puede utilizar para identificar las proteínas que se une el fármaco.

metales esenciales desempeñan un papel vital en las funciones biológicas normales, incluyendo las vías mensajeras secundarias, vías de metabolismo y las funciones de los orgánulos. 30% de todas las proteínas se cree que son metaloproteínas 1 y 50% de todas las enzimas 2. Metaloenzimas utilizan estos metales traza como cofactores para catalizar reacciones químicas, estabilizar la estructura de proteínas, y para las funciones de regulación, tales como mensajeros secundarios. Algunos de los elementos traza más estudiados en lo que respecta a la neurodegeneración son el cobre, el hierro y el zinc 3. Se cree que participan en muchas vías de la enfermedad, donde por dyshomeostasis puede tener efectos adversos. Por ejemplo el estado de metal de la superóxido dismutasa (SOD) directamente afecta a la duración de la vida y el fenotipo de los modelos de ratones transgénicos de tipo familiar de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) 4. En la enfermedad de Alzheimer, metalloproteomics técnicas se han utilizado para descubrir una disminución en el estado de metal de transferrina en pLasma 5. Estos estudios ponen de relieve las metaloproteínas importante papel que pueden desempeñar en la enfermedad. El estudio de metaloproteínas directamente de los tejidos biológicos es un campo en desarrollo. Aunque algunos metaloenzimas se han caracterizado, la mayoría todavía permanecen sin caracterizar o desconocido 6. Uno de los principales retos en metaloproteínas de medición es el requisito para mantener el estado natural de la proteína 7. Classical abajo arriba técnicas proteómicas se basan en la digestión de las proteínas en péptidos. Este proceso altera la interacción no covalente de metales y sus proteínas. Por lo tanto, se obtiene ninguna información sobre el estado de metal de una proteína. Una forma de superar este problema es mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño se combina con plasma acoplado inductivamente - 8,9 espectrometría de masas (SEC-ICP-MS). Esto genera información sobre el tamaño aproximado de la proteína, así como de todos los metales que son Associated con él 10. Además, la exclusión de tamaño es una técnica cromatográfica suave que puede preservar el estado natural de un complejo de enzima o proteína-proteína. Una de las ventajas de la utilización de plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (ICP-MS) es la naturaleza cuantitativa de la tecnología. El uso de un conjunto de normas de metaloproteínas es posible proporcionar la cuantificación absoluta de metaloproteínas de muestras biológicas 9,11. Esto se logra mediante la generación de una curva estándar mediante la inyección de metaloproteínas conocidos en un intervalo de concentraciones de metales. Este protocolo muestra un ejemplo de cómo esto puede lograrse por una variedad de normas de metaloproteínas. En este trabajo pretendemos crear las curvas de calibración para los metales que son investigados en gran medida en los campos biológicos, incluyendo el hierro (Fe), cobre (Cu), zinc (Zn), yodo (I) y cobalto (Co).

<table><tbody><tr><td>Bomba binaria Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Automuestreador</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1200 Series Termostato Agilent</td><td></td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Compartimento de columna termostatizado</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Detector de longitud de onda variable</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Base de metal traza de hidróxido de amonio&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Nitrato de amonio&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Prepare una solución fresca de 200 mM el día del experimento</td></tr><tr><td>&nbsp; Antinomia&nbsp;</td><td>Analítica de elección&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ceruloplasmina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cesio&nbsp;</td><td>Analítica de elección&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inhibidores completos de la proteasa sin EDTA&nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Conalbúmina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Concanavalina A de Canavalia ensiformis (frijol jack)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cu, Zn superóxido dismutasa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ferritina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Patrones de calibración multielemental ICP-MS&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Elaborado hasta las concentraciones requeridas en ácido nítrico al 1</td></tr><tr><td>%&nbsp; Espectrofotómetro UV de microvolumen&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 65% Ácido nítrico&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>Diluido al 1% para su uso</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de espionaje &nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Columna de exclusión de tamaño BioSEC-3 PLC. columna, 4,6 x 300 mm, 3 &mu; m, 150 y Aring; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cloruro de sodio &nbsp;</td><td>Suministro de productos químicos</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Clorhidrato de Tris &nbsp;</td><td>ICN Biomedicals inc.&nbsp;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tiroglobulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vitamina B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

estándares para el análisis cuantitativo de metalloproteomic uso de exclusión por tamaños icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Los metales son esenciales para la función de las proteínas como cofactores para catalizar reacciones químicas. La alteración de la homeostasis de los metales está implicada en una serie de enfermedades, como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, pero el papel exacto que desempeñan estos metales aún no se ha dilucidado por completo. La identificación de metaloproteínas se enfrenta a muchos retos y dificultades. Aquí reportamos un enfoque que permite cuantificar metaloproteínas en muestras complejas. Esto se logra utilizando cromatografía de exclusión por tamaño junto con plasma acoplado inductivamente - espectrometría de masas (SEC-ICP-MS). Utilizando seis metaloproteínas conocidas, se puede calibrar la columna de exclusión de tamaño y se pueden utilizar los respectivos oligoelementos (hierro, cobre, zinc, cobalto, yodo) para la cuantificación. Se presentan trazas de cerebro y plasma humano de SEC-ICP-MS. El uso de estos patrones de metaloproteína proporciona los medios para comparar cuantitativamente las abundancias de metaloproteína entre muestras biológicas. Esta técnica está preparada para ayudar a arrojar luz sobre el papel de las metaloproteínas en las enfermedades neurodegenerativas, así como en otras enfermedades en las que están implicados desequilibrios en los oligoelementos.

El uso de estándares metaloproteínas permite la calibración de la columna de exclusión de tamaño. La Figura 1A muestra el perfil de elución para la normas tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y la vitamina B 12 basada en el metal que están obligados a (Fe, Co, Cu, Zn y I). la Figura 1B muestra la curva de calibración para la columna de exclusión de tamaño en base al peso molecular de los estándares de proteína y su tiempo de elución, se presenta en el formato de volumen de elución (Ve) dividido por el volumen vacío de la columna (Vo). Las proteínas usadas para generar esta curva estándar se concanavalina A, conalbúmina, ceruloplasmina, la ferritina, SOD y tiroglobulina. La Figura 2A muestra la elución de la ferritina en un rango de 2.000 - 60.000 pg de Fe inyectada en la columna y la Figura 2D es el análisis de regresión a cabo utilizando párea EAK. Figuras 2B y 2C son los perfiles de elución de Cu / Zn SOD para Cu y Zn y 2E y 2F son los análisis de regresión generadas usando áreas de los picos. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos en bruto en los recuentos / seg a pg / seg por lo que la cantidad de metal asociado con la proteína puede determinarse cuantitativamente. La conversión se realiza dividiendo la cuentas / s por la pendiente de la regresión lineal (por ejemplo, 334,6 (cuentas / segundo) x (seg / pg) de cobre). Como se ha indicado, esta técnica se puede utilizar para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Cerebro y plasma humano han sido sometidos a esta técnica y las figuras 3 y 4, respectivamente, muestran los resultados obtenidos. El cerebro humano separados por SEC-ICP-MS se muestra en las figuras 3A-3C, cada uno de los cuales representan un metal diferente de<html> interés (Cu, Zn o Fe). Las figuras 4A-4C muestran las trazas obtenidas cuando el plasma humano es sometida a esta técnica. La complejidad y la abundancia de la muestra tendrán un impacto en el número de picos que se ven. Como plasma esperada está dominado por unos pocos metaloproteınas incluyendo ceruloplasmina y transferrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figura 1. Calibración de cromatografía de exclusión - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Usando Conocido perfil metaloproteínas (A) La elución de las normas de las metaloproteinasas basadas en sus respectivos metales.. (B) curva de calibración de peso molecular para los estándares de proteína tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbúmina (iv), Cu / Zn SOD (v) y concanavalina A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figura 2. Uso de ferritina y Cu / Zn SOD como Normas metalloprotein para determinar la cantidad de Cu, Fe o Zn Asociado con metaloproteínas en una muestra biológica compleja (A) Perfil de elución de ferritina sobre el rango de inyección de 2.000 -. 60.000 mg / l de hierro. (B) y el perfil de elución (C) para la Cu / Zn SOD sobre el rango de inyección de 200 - 6000 g / l de cobre y zinc, respectivamente. (D), (E) y (F) muestran los resultados del análisis de regresión para el hierro metales, cobre y zinc, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Cu, Fe y Zn Metalloproteome del cerebro humano. (A) traza de cobre (B) traza hierro (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra mediante el trazo negro con su peso molecular se indica en el gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figura 4. Cu, Fe y Zn Metalloproteome de plasma humano. (A) traza traza Hierro Cobre (B) (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra por la traza negro con su peso molecular endicated debajo de la gráfica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La cromatografía de exclusión por tamaño con guiones con plasma acoplado inductivamente - espectrometría de masas (ICP-MS) es una poderosa herramienta para medir cambios en la abundancia de metaloproteínas directamente a partir de muestras biológicas. Aquí describimos un conjunto de patrones de metaloproteínas utilizados para estimar la masa molecular y la cantidad de metal asociado con proteínas desconocidas.

Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

El objetivo general de esta técnica consiste en poder cuantificar diferentes metaloproteínas en estándares complejos basándose en el uso de estándares conocidos de metaloproteínas. Este método puede responder preguntas clave sobre el papel de los metales en la biología. Por ejemplo, ¿cómo cambia el estado metálico de una proteína en una enfermedad? Una ventaja clave de esta técnica es que permite medir el estado metálico de una proteína en su estado nativo. La técnica será demostrada por Amber Lothian, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, homogenice tejido o muestras de cultivo celular mediante pulsos manuales o sonicación durante cinco minutos utilizando solución salina tamponada con Tris.Clarifique los homogenizados mediante centrifugación a 16.000 × g durante cinco minutos. Después de recolectar el sobrenadante resultante, normalice la cantidad total de proteína determinando las concentraciones de proteína según se describe en el protocolo escrito. Caliente y ajuste el espectrómetro de masas con plasma acoplado inductivamente, siguiendo los protocolos del fabricante.Diluya los patrones de metaloproteína para disfrutar del otoño dentro del rango de cero a 500 microgramos por litro, utilizando ácido nítrico al uno por ciento. Para obtener patrones dentro de este rango, no utilice diluciones superiores a una y 20. Configure el orden de las inyecciones analizando primero los siete niveles de calibración.Concentraciones que van desde cero hasta 500 microgramos por litro, seguidas por los estándares de metaloproteínas. Los siete niveles de calibración son cero, uno, cinco, diez, 50, 100 y 500 microgramos por litro. A continuación, seleccione los elementos de interés.Aquí, utilice hierro, cobre, zinc, cobalto y yodo, ya que son los elementos a los que se unen los patrones de proteínas. Seleccione los elementos en el método de adquisición abriendo la pestaña del selector de elementos y agregando los elementos y sus masas isotópicas respectivas que se van a analizar.Luego, realice el análisis de la muestra con el instrumento. El software del instrumento crea automáticamente las curvas de calibración para cada uno de los elementos analizados. Utilice las curvas de calibración para determinar la concentración de metal en las muestras desconocidas.A partir de los resultados del análisis global, genere estándares de metaloproteínas que incluyan los tres elementos traza más abundantes en los tejidos de mamíferos, utilizando una mezcla de superóxido dismutasa de cobre y zinc, y ferritina. Purifique las bombas de cromatografía rápida de alto rendimiento, o HPLC, con tampón de nitrato de amonio 200 milimolar durante cinco minutos a un flujo de cinco mililitros por minuto. Una vez que el sistema haya sido purificado, establezca el flujo a cero punto un mililitros por minuto.Y conecte la columna de exclusión lateral. Conecte el extremo opuesto de la columna al detector de UV, ajuste la medición de absorbancia a 280 nanómetros utilizando tubo capilar. Aumente gradualmente el flujo de la columna en incrementos de 0,1 mL/min, hasta alcanzar un flujo final de 0,4 mL/min.Mientras esto ocurre, revise las conexiones de los tubos a la columna en busca de fugas. Monitoree la presión del sistema para asegurarse de que no exceda los requisitos de la columna, observando el registro de presión en el cromatograma del software. Deje que la columna se equilibre al flujo requerido durante cinco a 10 volúmenes de columna.Una vez que esté equilibrado, conecte los instrumentos para permitir que ocurra el análisis de la muestra. Configure el método de HPLC para bombear el tampón A a través de la columna a 0,4 mililitros por minuto durante 15 minutos. Coloque el ICPMS en modo de espera antes de cambiar la configuración del hardware.Una vez en modo de espera, apague la comunicación del muestreador automático y cambie la introducción de la muestra a otra. Utilice un tubo de PEEK para conectar la salida del detector UV directamente al nebulizador del ICPMS. Encienda el ICPMS y permita que el instrumento se caliente durante 10 a 20 minutos.Después de que el plasma se haya encendido, conecte el cable remoto del ICPMS a la parte trasera del muestreador automático de HPLC. Haga esto una vez que el plasma se haya encendido. De lo contrario, el sistema de HPLC se apagará automáticamente, ya que el ICPMS no está encendido.Cambie el método de ICPMS para recopilar datos para LC ICPMS alterando primero el método de adquisición de espectro a adquisición resuelta en el tiempo. Luego, seleccione los elementos que se analizarán: hierro, cobre, zinc, cobalto, yodo, así como cualquier otro elemento de interés, y establezca los tiempos de integración.Después de seleccionar los elementos de interés, ajuste el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo de corrida de la cromatografía. Sintonice manualmente el ICPMS para obtener sensibilidad y tasas de flujo de gas helio en la celda de colisión, utilizando un tampón de cromatografía que fluya con cesio y antimonio incluidos en el tampón. Una vez que las cuentas de iones metálicos se hayan estabilizado y los valores de desviación estándar relativa estén por debajo del cinco por ciento, el sistema está listo para usarse.Elabore listas de ejecución de muestras en ambos programas de software, HPLC y ICPMS. La lista de ejecución de muestras contiene el orden en el que se inyectará cada una de las muestras, así como el nombre con el que se guardarán los datos.Verifique que el número total de muestras en la lista coincida entre los dos programas. Inicie el lote de muestras para el ICPMS antes que el HPLC, ya que la inyección de la muestra por parte del HPLC activará el ICPMS para comenzar a recolectar datos. Si esto no se realiza en el orden correcto, se producirá pérdida de datos.Genere puntos para la curva de calibración inyectando volúmenes variables del estándar mixto de superóxido dismutasa y ferritina. Los volúmenes de inyección oscilan entre un microlitro y 30 microlitros. Finalmente, analice cada una de las muestras desconocidas, como tejido, plasma o cultivo celular, antes de analizar los datos según se describe en el protocolo del texto.Se muestra la ilusión de la ferritina en un rango de 2000 a 60,000 picogramos de hierro inyectados en la columna. Se realizó un análisis de regresión utilizando el área del pico. Se muestran los perfiles de ilusión para el cobre, el zinc y la superóxido dismutasa, tanto para el cobre como para el zinc.También se muestran los análisis de regresión generados utilizando las áreas máximas. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos brutos en cuentas por segundo a picogramos por segundo, con el fin de determinar cuantitativamente la cantidad de metal asociada con la proteína.Esta técnica puede utilizarse para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Aquí se muestra un cerebro humano separado mediante SEC ICPMS. Cada una de las cuales representa un metal de interés diferente.Concretamente, cobre, zinc o hierro. Aquí se muestran los trazos obtenidos cuando se somete plasma humano a esta técnica. La complejidad y abundancia de la muestra influirán en el número de picos que se observan.Como era de esperar, el plasma está dominado por unas pocas metaloproteínas, incluyendo ceruloplasmina y transferrina. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo configurar un instrumento para medir el estado nativo de las metaloproteínas en muestras complejas. Una vez dominada, esta técnica puede aplicarse con éxito en tres o cuatro horas.Esto permite analizar entre 20 y 36 muestras en un solo día. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar los estándares apropiados de metaloproteínas, como la SOD de cobre y zinc si se está interesado en el cobre y el zinc. Así como también los estándares internos en el tampón, como el cesio, que permite corregir cualquier deriva del instrumento a lo largo del tiempo.Tras seguir este procedimiento, también puede implementar otras formas de espectrometría de masas para responder preguntas importantes. Por ejemplo, ¿cuáles son las metaloproteínas presentes en mi muestra? Esto puede hacerse mediante digestión estándar y secuenciación de péptidos proteicos por espectrometría de masas.O, analizando las proteínas intactas, en su estado nativo. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica comprendan el papel de las metaloproteínas en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer. No olvide trabajar con ácido nítrico concentrado y con muestras clínicas.Debe usarse el equipo de protección personal adecuado.

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Investigación

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Chemistry

Química

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Este protocolo describe cómo realizar ensayos de cuantificación absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas utilizando la monitorización de reacciones seleccionadas. Se utilizó para cuantificar con precisión las proteínas de la vía de señalización de la quimiotaxis de los macrófagos de ratón. Se describe en detalle la selección de péptidos objetivo, el desarrollo de ensayos y los ensayos cualitativos y cuantitativos.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Aquí, describimos un análisis cromatográfico juntado con la separación de movilidad de iones precursores de péptidos seguida por la alta resolución (~ 30.000) MS-detección de fragmentos de péptidos para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal Digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

Se presenta un protocolo para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos complejos utilizando tecnología automatizada inmuno-MALDI (iMALDI).

Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Este protocolo describe el uso de cromatografía de intercambio iónico de alta especificidad con dispersión de la luz múltiples ángulo para una determinación de masa molar exacta de proteínas, complejos de proteínas y péptidos en una muestra heterogénea. Este método es valioso para la evaluación de la calidad, así como para la caracterización de oligómeros nativos, variantes de carga y las muestras de proteína mezclado.

Cromatografía de intercambio iónico (IEX) acoplada a la dispersión de la luz de múltiples ángulo (MALS) para caracterización y separación de proteínas

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Este método de especiación redox de hierro se basa en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar con apilamiento de muestras combinada con análisis cortos en una sola ejecución. El método analiza rápidamente y proporciona bajos límites de cuantificación para las especies de redox de hierro en una amplia gama de tejidos y muestras de biofluidos.

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica

Aprende a cuantificar metaloproteínas en muestras biológicas mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a ICP-MS. Este método permite analizar el estado metálico de proteínas en su estado nativo.

Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

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