RNAi gatillo en la entrega

El objetivo general de este método es la administración de desencadenantes de interferencia de ARN en Anopheles gambiae para iniciar la reducción de la expresión génica que comienza durante la etapa de pupa del desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de vectores y revelar genes que desempeñan un papel durante las etapas de desarrollo preadultas o tempranas de adultos. La principal ventaja de esta técnica es que brinda a los investigadores la oportunidad de realizar estudios funcionales genómicos rápidos, comenzando la reducción génica durante el intervalo de desarrollo, la etapa de pupa, cuando en el pasado no se habían implementado protocolos de inyección de interferencia de ARN.

La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de inyección pueden ser difíciles de dominar debido a la precisión requerida y a la naturaleza delicada de las pupas durante esta etapa de desarrollo. Después de seleccionar el gen de interés, identifique una región de 200 a 800 pares de bases que se prediga que no tenga efectos fuera del blanco y realice la amplificación estándar por PCR para obtener una plantilla para la síntesis de ARN bicatenario, flanqueada por una secuencia promotora T7. Luego, sintetice el ARN bicatenario y purifique los productos utilizando un kit comercial in vitro.

Ajuste la concentración final de ARN a tres microgramos por microlitro. A continuación, utilice un gel estándar de agarosa al 2% para comparar una media microlitro del ARN bicatenario con el ADN molde y marcadores estándar. Una vez finalizada la electroforesis, verifique la calidad y la longitud de la banda de ARN bicatenario.

No debe haber productos no específicos visibles. El ARN bicatenario migrará más lentamente que el ADN molde. Para el almacenamiento, prepare alícuotas de ARN bicatenario y guárdelas a menos 20 grados Celsius.

Comience preparando el colorante Fast Green FCF. En primer lugar, diluya el colorante al 0,1 % en volumen en agua libre de RNasas. A continuación, transfiera volúmenes de un microlitro de la preparación a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros.

Caliente los tubos cargados a 65 grados Celsius durante aproximadamente tres horas para evaporar el agua. Luego, enfríe los tubos durante al menos 30 minutos antes de usar los sólidos del colorante. A continuación, prepare agujas de inyección de vidrio estiradas a partir de tubos de vidrio borosilicatado.

Configure el extractor de agujas para un diámetro de punta de 10 a 30 micrones. Para un extractor de capilares NARISHIGE, ajuste el primer calentador a 100 y el segundo calentador a 70. Luego sujete la aguja capilar y continúe con el estirado.

Ahora, prepare la estación de inyección. Seleccione una plataforma que pueda manipularse fácilmente bajo el microscopio. Sobre la plataforma, primero sujete con cinta un papel filtro grueso.

Luego, sobre el papel de filtro grueso, sujete con cinta un papel de filtro delgado. A continuación, agregue 10 microlitros de cada ARN bicatenario que se va a inyectar a los tubos con el colorante en estado sólido y re-suspenda el colorante. Almacene estos tubos en hielo.

Ahora, recolecte las pupas que se van a inyectar. Llene una placa de Petri de 60 milímetros con 10 mililitros de agua desionizada y transfiera aproximadamente 50 pupas de color pálido a la placa, utilizando una pipeta plástica de transferencia. Utilice únicamente pupas ligeramente pigmentadas, ya que las pupas que ya han alcanzado niveles medios a oscuros de curtido sufrirán daños en el cutículo y tendrán tasas de supervivencia bajas.

El primer paso para la microinyección consiste en abrir la aguja. Bajo el microscopio, rompa la punta más distal de la aguja utilizando pinzas finas. Luego, rellene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja de calibre 30 y una jeringa.

Una vez llenado, expulse el exceso de aceite utilizando el microinyector. Configure el microinyector para aspirar volúmenes de 69 nanolitros. Luego, llene la aguja por delante con el ARN de inyección preparado.

Pruebe la dispensación de ARN bicatenario para detectar problemas. La obstrucción en la punta y las agujas mal fijadas son las principales causas de problemas. Una vez preparado el inyector, seleccione una a tres pupas y transfiéralas al soporte de papel de filtro.

Con un pincel, coloque la pupa de manera que la cutícula dorsal quede accesible. Al presionar sobre el papel, se absorberá el exceso de agua presente en las pupas. Manteniendo la pupa inmóvil con un pincel húmedo, utilice un movimiento de anterior a posterior para insertar la aguja en su cutícula dorsal entre el abdomen y el tórax, aproximadamente a un ángulo de 30 grados.

Luego, inyecte uno o dos pulsos de ARN bicatenario en el hemolinfa. Debe ser visible la dispersión del colorante a lo largo del cuerpo si la inyección ha tenido éxito. Durante la inyección de la pupa, es fundamental que la aguja atraviese únicamente la cutícula dorsal.

Si la punción con la aguja atraviesa la cutícula ventral, será evidente la acumulación de líquido marcado con colorante en el exterior de la pupa, o el colorante se transferirá al papel de filtro. En tales casos, la pupa debe descartarse. Si el colorante no se distribuye por todo el hemolinfa, es muy probable que la punta esté obstruida.

Mueva ligeramente la punta y determine si se ha producido alguna liberación de ARN y colorante. Si no hay indicios de liberación del colorante, deseche la pupa. Luego, evalúe la punta de la aguja y realice otra inyección en una pupa nueva.

Después de inyectar con éxito una pupa, utilice un pincel húmedo para liberarla suavemente de la aguja y trasládela al recipiente con agua donde completará su desarrollo. Coloque el recipiente con las pupas inyectadas en una jaula para mosquitos o en un contenedor bajo condiciones normales de cría. Como fuente de alimento para los adultos, proporcione glucosa en una solución al 10% peso por volumen absorbida en una bola de algodón.

Después de que los adultos hayan emergido, compárelos con los controles. Por ejemplo, los insectos con ARN de doble cadena para SRPN2 deben evaluarse diariamente para detectar la formación de pseudotumores. Para ello, enfríe los adultos durante dos o tres minutos a menos 20 grados Celsius y transfiéralos a una placa fría de dos grados Celsius para su observación.

Después de observar a los adultos, devuélvalos al área de cría de insectos. Una vez dominada la técnica, las pupas inyectadas emergieron con una frecuencia de aproximadamente el 70%. En un subconjunto de las pupas inyectadas, ocurrió una emergencia parcial de la cápsula pupal, lo que provocó mosquitos no viables. No hubo retraso en las tasas de emergencia entre mosquitos inyectados y no inyectados, y los efectos de la inyección no variaron según el sexo.

Diez días después de la emergencia, no hubo un cambio notable en la supervivencia de los mosquitos inyectados en comparación con los controles no inyectados. El inhibidor de serina proteasa, SRPN2, se utilizó como control positivo, y el LacZ de doble cadena se utilizó como control negativo para las inyecciones de ARN de doble cadena. A los tres días posteriores a la emergencia, los pseudotumores en los adultos inyectados con SRPN2 de doble cadena fueron evidentes mediante microscopía óptica.

Después de ocho días, los seudotumores fueron muy prominentes. En mosquitos en estadio adulto, se pudieron observar seudotumores melanóticos a través de la cutícula en la mayoría de los animales inyectados con ARN bicatenario de SRPN2, mientras que no se observaron seudotumores en los controles. Cinco días después de la inyección, los niveles de la proteína SRPN2 fueron significativamente más bajos en los mosquitos inyectados con ARN bicatenario de SRPN2, en comparación con los controles inyectados con ARN bicatenario de LacZ y los controles no inyectados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la entrega de un inductor de interferencia de ARN en pupas de Anopheles gambiae, utilizando este protocolo de inyección recién desarrollado. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al movimiento impredecible de la pupa. Sin embargo, practicar la posición y estabilización correctas de la pupa mejora considerablemente la tasa de inyecciones exitosas, así como la calidad de la inyección.

Una vez que domine la técnica, estas inyecciones requieren aproximadamente 30 segundos por pupa. Con el desarrollo de esta técnica, hemos allanado el camino para que los investigadores en el campo de la biología de vectores exploren y evalúen la función génica durante las etapas de desarrollo preadultas y tempranas del adulto en el vector de la malaria Anopheles gambiae. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis por inmunotransferencia (Western blot) o la PCR cuantitativa, para determinar el grado de silenciamiento del gen diana a nivel de expresión proteica o de transcritos, respectivamente.

En última instancia, esta técnica puede ayudar a identificar genes que son fundamentales para la transmisión del parásito por los mosquitos, y este enfoque nos ayudará a identificar nuevos objetivos y a obtener nuevas perspectivas sobre cómo podemos crear estrategias más efectivas de control de vectores.