Name: RNAi gatillo en la entrega Anopheles gambiae Las pupas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a inyectar ARN de doble cadena en pupas de Anopheles gambiae para inducir silenciamiento génico durante el desarrollo. Este protocolo permite estudios funcionales rápidos en biología de vectores.

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Nos gustaría agradecer a la Dra. Flaminia Catteruccia y a su grupo de investigación (Escuela de Salud Pública de Harvard, Boston, MA) por proporcionar a nuestro laboratorio la colonia G3 utilizada en esta investigación y por el ADN plantilla de LacZ. Agradecemos a Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) por su ayuda en el mantenimiento del insecto. El Departamento de Biología del Boston College financió generosamente la investigación asociada con el desarrollo de esta técnica.

1. Síntesis y Preparación dsRNA <ol><li> Identificar una región de derribo 200-800 pb (para generar el correspondiente ARN de doble cadena) dentro del gen de interés que se prevé que no tienen efectos fuera de la meta identificables (por ejemplo, hay una homología de secuencia ≥18 pb dentro de otro gen) y un control negativo (por ejemplo, , una secuencia heteróloga que no está presente dentro del genoma de insectos objetivo, tal como el gen lacZ de Escherichia coli (GenBank gene ID: 945006). como alternativa, utilizar un control positivo (por ejemplo, que produce un fenotipo fácilmente observado, como SRPN2 21,22 , GenBank gene ID:. 1270169) la secuencia de la SRPN2 orientación dsRNA se define en Michel et al (2005) 21.. Nota: E-ARNi es un recurso bioinformático de código abierto que es útil para la identificación de estas regiones y para el proceso de diseño de cebadores de oligonucleótidos 23. </li><li> realizar samplificación tandard PCR (es decir, realizada con la Taq ADN polimerasa usando 30-35 ciclos) utilizando un ADN genómico o cDNA plantilla para obtener la síntesis de plantilla de dsRNA flanqueado por una secuencia de promotor T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) y proceder con la preparación de dsRNA y limpiar-up utilizando un kit comercial transcripción in vitro según las instrucciones del fabricante. Uso SRPN2 PCR condiciones de amplificación y cartilla de información que se presenta en An et al. (2011) 22. </li><li> Cuantificar el rendimiento de ARN de amplicón purificado por espectroscopia de absorción ultravioleta a longitud de onda de 260 nm y ajustar a la concentración deseada (por ejemplo, 3 g / l) en agua libre de RNasa. <ol><li> Para solucionar los problemas bajas concentraciones de ARN, reducir el volumen de líquido haciendo girar las muestras en una centrífuga de vacío a temperatura ambiente o por liofilización de muestras y la reconstitución en volúmenes más pequeños de agua. El tiempo necesario para la liofilización de la muestra variará dependiendoen los volúmenes iniciales de la muestra y las concentraciones de ARN de doble cadena. </li></ol></li><li> Comprobación de la calidad y la longitud del dsRNA en un gel de agarosa al 2% preparada con 1x TBE o tampón TAE y se tiñeron con bromuro de etidio (EtBr), junto con la plantilla de ADN utilizado para la reacción de transcripción. El dsRNA migrará más lentamente que la plantilla de ADN. Calidad y la duración pueden ser evaluados al asegurar que no hay productos no específicos y ARN de doble cadena mediante la comparación de productos con un marcador de ADN estándar, respectivamente. Nota: EtBr es un potente mutágeno y debe ser manejado en consecuencia. Nota: A una concentración dsRNA de 3 g / l, 0,5 l de la muestra es más que suficiente para la visualización en el gel de agarosa EtBr-manchado. </li><li> Almacenar dsRNA a -20 ° C hasta que se necesite. ciclos de congelación / descongelación múltiples pueden causar la degradación, por lo alícuotas deben estar preparados para grandes volúmenes de ARN de doble cadena. </li></ol> 2. Preparar Fast Green FCF Dye tubos (FGD) <ol><li> Diluir rápida de tinte verde FCFa partir de la solución madre (≥85% de contenido de colorante) a 0,1% (v / v) (solución de trabajo) en agua libre de RNasa. </li><li> Pipeta de 1 l de medio de contraste en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Colocar los tubos en un bloque de calor a 65 ° C durante aproximadamente 3 horas para evaporar, luego coloque los tubos de líquidos a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, enfriar antes de usar. Este colorante sólido seco se reconstituirá en solución de resuspensión ARN de doble cadena. </li></ol> 3. Tire las agujas de inyección <ol><li> Tire de agujas de vidrio de borosilicato con un extractor de aguja calentada a un diámetro de la punta de 10-30 micras. Tire ajustes corresponden a: el ajuste del calentador no. 1 = 100, el ajuste del calentador no. 2 = 70. </li><li> Para evitar daños a la fina punta de la aguja, colocar todas las agujas tirados horizontalmente en una placa de Petri en una tira de masilla de moldeo. Nota: Información adicional de la aguja capilar tirando métodos se puede encontrar con más detalle en el Reactivo de Investigación y Referencia del Centro de Recursos malaria MR4 manual de 24. </li></ol> 4. Preparar la estación de inyección <ol><li> Recoger los materiales necesarios: agujas microcapillary vidrio sacaron a punta fina, microinyector, papel de filtro fino y papel de filtro grueso, placas de Petri, pipetas de transferencia, pincel y el microscopio de disección luz. </li><li> Preparar el microinyector como se indica en el manual microinyector, y establecer el volumen de inyección al volumen deseado por pulso (por ejemplo, máximo de 69 nl por pulso). </li><li> En una plataforma que es fácil de maniobrar bajo el microscopio (por ejemplo, el lado plano de un bastidor de tubo de espuma de poliestireno), apilar las dos hojas de papel filtro con el papel de filtro delgado en la parte superior, y seguro con cinta adhesiva alrededor de los bordes. </li><li> Resuspender 10 l de cada solución de ARN de doble cadena en tubos de teñir de colores distintos, y el lugar en el hielo. </li></ol> 5. Recoger pupas para Inyección <ol><li> Llenar una pequeña de 60 mm x 15 mm placa de Petri con 10 ml de agua desionizada, y recoger ~ 50 pupas pálido (During de la primera 24 horas después de la fase de pupa) de una bandeja insectario con una pipeta de transferencia de plástico desechable. </li><li> Eliminar cualquier pupas que tienen medio de bronceado oscuro de la cutícula. Nota: Una vez que la cutícula comienza a broncearse, se hace más difícil de penetrar la cutícula, y los resultados de inyección en mucho mayor letalidad. </li></ol> 6. inyección de dsRNA <ol><li> Bajo el microscopio de disección, rompa la punta distal de la aguja de inyección con un par de pinzas finas. </li><li> Preparar la aguja de inyección por el relleno de la aguja con aceite mineral (usando una jeringa con una 3 pulgadas, aguja de calibre 30), y expulsar el exceso de aceite con el microinyector. </li><li> Frente llenar aguja de inyección con la máxima cantidad de ARN de doble cadena, y expulsar un pulso bajo el microscopio, asegurar la distribución del líquido. En el caso de que ningún líquido es absorbido y / o expulsado, compruebe la punta distal de la aguja en busca de obstrucciones y asegurarse de que la aguja está bien colocada en el microinjector. </li><li> Escoja 1-3 pupas, y colocarlos en el papel de filtro. </li><li> Utilizando el pincel, la posición de las pupas en el papel de filtro con la cutícula dorsal accesible, y utilizar el pincel para empujar sobre papel de filtro y absorber cualquier exceso de agua. </li><li> Estabilizar la pupa con la punta del pincel, e inserte la aguja en la cutícula dorsal entre el tórax y el abdomen en un ángulo de aproximadamente 30 ° en relación con la superficie dorsal de la pupa. La inyección debe ser dirigido hacia el extremo posterior de la pupa y la aguja se debe mover en una dirección anterior-a-posterior. </li><li> Inyectar dos impulsos (69 nl por impulso) de solución de 3 g / l ARN de doble cadena en la hemolinfa, y comprobar la distribución del color en todo el cuerpo. Si no se identifica el color, cambiar la posición de la aguja de inyección ligeramente para vaciar la punta de la obstrucción y repetir de suministro de líquido. </li><li> Con el pincel humedecido para mover suavemente las crisálidas de la aguja en el agua para el cultivo. Tpupa que debe atenerse a la brocha al entrar en contacto la luz. </li></ol> 7. Condiciones después de la inyección <ol><li> Coloque placa de Petri con pupas se inyecta en una jaula de mosquitos con el flujo de aire adecuado (por ejemplo, la jaula de malla o un recipiente con tapa de malla). condiciones de cría de pupas deben permanecer constantemente a 27 ± 3 ° C de temperatura, 75 ± 5% de humedad y estar bajo un ciclo de luz: oscuridad de 16: 8 h. </li><li> Preparar una solución de glucosa al 10% (w / v), y colocar una bola de algodón solución saturada en la jaula de malla de mosquitos para la alimentación de adultos. </li></ol> 8. Evaluar Derribo <ol><li> Al momento de punto (s) deseada, evaluar fenotipos en experimentales insectos inyectados con ARN de doble cadena, en comparación con los controles. <ol><li> Evaluar dsSRPN2 y dsLacZ insectos diaria enfriando hasta adultos durante aproximadamente 2-3 minutos a -20 ° C, transferirlos a un plato frío entre 2 ° C y la identificación de cualquier formación de pseudo-tumor mediante la utilización de un microscopio de disección a 15Xaumento con iluminación de campo claro. Después de la evaluación, los adultos a las condiciones de insectario (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% de humedad) de regreso. Nota: Los dsRNAs experimentales y de control utilizados en este protocolo son dsSRPN2 y dsLacZ, respectivamente. Hay muchas opciones para los controles adecuados; sin embargo, se sugiere que un control positivo para la que se visualiza fácilmente fenotipo y / o la expresión (por ejemplo, mediante la disección de la microscopía) y / o cuantificado [por ejemplo, cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR), Western blot] se debe utilizar cuando el aprendizaje de esta técnica. SRPN2 proteína y cuantificación transcripción a través de Western blot y QRT-PCR, respectivamente, se describen en Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
</ol>

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Los métodos actuales para inducir el ARNi no transgénico en los mosquitos implican la inyección directa de ARN de doble cadena en el hemocoel adulto 12,13 o alimentación de las larvas de RNAi nanopartículas recubiertas de activación 14-17 o ARN de doble cadena a base de microalgas moléculas 18. Apuntando al mosquito adulto, aunque es extremadamente valiosa, puede excluir a un gran número de genes que funcionan durante los períodos anteriores del desarrollo. Caída iniciada por alimentación de las larvas puede producir fenotipos inconsistentes durante la etapa adulta, debido, en parte, a la posibilidad de la persistencia de proteínas a través de la variable de estado de pupa. Por lo tanto, se introduce un método adicional que se dirige específicamente a iniciar RNAi durante el desarrollo de pupa proporcionará un medio para evaluar más a fondo las funciones de genes durante las etapas de desarrollo pre-adultos, así como capacidades mejoradas para evaluar la función génica durante la etapa adulta. Como con enfoque de genes desmontables basado en la inyección de dsRNA o expresión, la persistencia del gen desmontablesno se puede predecir. Por lo tanto, los niveles de transcripción o proteínas deben ser evaluados para el gen de interés durante períodos de desarrollo de interés. Aunque se observa una continuación de la disminución de los niveles de proteína en el día 5 después de la inyección para SRPN2 en los animales inyectados con ARN de doble cadena SRPN2, factores como el recambio de proteínas y la vida media pueden ser diferentes para diferentes objetivos. Es fundamental para garantizar, además, que el ARN de doble cadena que se utilizará para la inyección es bien concentrado y parece intacto en un gel de agarosa. Recomendamos experimentadores reevaluar estos factores si los resultados no son suficientes desmontables, y pueden necesitar ser probado empíricamente para objetivos de genes específicos respectivas concentraciones de ARN de doble cadena. Se describe un método para la iniciación de la interferencia de ARN durante la fase de pupa de An. desarrollo gambiae. Este método se basa en la introducción a través de microinyección de dsRNA directamente en el hemocoel de pupas temprano y permite la evaluación de la calidad de la inyección por elutilizar de dsRNA marcado con colorante. La capacidad de visualizar la calidad de inyección constituye una mejora fundamental para garantizar knockdown éxito y constituye un aspecto de la caída génica basada en la inyección que no se ha considerado en los protocolos basados ​​en dsRNA más informes anteriores se centran en la etapa adulta. Al dirigirse a la pupa en el inicio de este periodo de desarrollo, los genes que podrían desempeñar un papel durante este intervalo crítico del desarrollo, o durante las primeras etapas de la edad adulta se puede evaluar funcionalmente. Además, este método puede permitir la entrega dsRNA a las células, y el establecimiento de la interferencia de ARN en las células que son accesibles durante la metamorfosis, pero menos accesibles en mosquitos adultos completamente formados. Un análisis de microarrays reciente de Harker et al. (2012) identificó 560 An. gambiae transcripciones que fueron hasta reguladas o hacia abajo-regulados por al menos 4 veces durante las etapas de desarrollo distintas, que van desde el embrión a adulto. De los 560 transcripciones identificado, un conjunto de 309 fue hasta reguladas durante el desarrollo de pupa 27. Estos hallazgos sugieren que hay muchos requisitos para la expresión diferencial de genes en todo el desarrollo de mosquitos, incluyendo aquellos que se producen durante la fase de pupa, un intervalo durante el cual el organismo sufre metamorfosis. En muchas especies de insectos, incluyendo An. gambiae, genes implicados en procesos tales como el desarrollo (es decir, cuticular de pupa y proteínas de unión a quitina) 27-31 y la respuesta inmune (es decir, las proteínas similares al receptor de tipo Toll) 27,32-34 son altamente expresado durante la fase de pupa. Una vez que ha surgido un adulto completamente formado, no se continúa la expresión génica en respuesta a ambiental y fisiológica cambia 35. Cabe destacar que, durante el desarrollo adulta temprana, hay un aumento en la expresión de genes del desarrollo (es decir, cuticular de adultos y proteínas sarcoplásmicas) 36, así como otros genes clave (es decir, </em&gt;, La proteína específica del esperma y del citocromo P450 enzimas del metabolismo) 27,36. El control positivo utilizado en el desarrollo de este protocolo, SRPN2, es un An. gambiae inhibidor de serina proteasa (serpina). SRPN2 juega un papel importante en la regulación negativa de la melanización de insecto, una respuesta inmune innata amplio espectro en insectos 21,22. Desmontables de SRPN2 en mosquitos adultos en los resultados de la formación de pseudo-tumor 21,22, un fenotipo que se observa fácilmente mediante el uso de microscopía de luz. Dado que este fenotipo distinto puede ser fácilmente anotó en insectos vivos, se utilizó para las inyecciones SRPN2 fase de pupa RNAi iniciales. Además, SRPN2 se expresa durante todas las etapas de desarrollo 37, proporcionando de este modo un buen objetivo para la fase de pupa inyección RNAi y evaluación de la función a principios del adulto. Se demuestra que el método que hemos desarrollado es capaz de inducir pseud melanótica adulta similares<html> la formación de o-tumor como consecuencia de las inyecciones de dsRNA realizadas durante la fase de pupa de desarrollo. En el desarrollo de este protocolo, hemos observado que la inyección durante el desarrollo temprano de pupa (es decir, las primeras 24 horas después de la muda larval-pupal) es fundamental para la obtención de emergencia de los adultos óptima. En el caso de que los pobres emergencia se obtiene después de la inyección, se recomienda la estadificación larvas con mayor precisión, para obtener pupas con menos extensa endurecimiento cutícula y asegurar la inyección se consigue fase de pupa temprano. Además, minimiza el daño a los resultados de la cutícula en tasas de emergencia óptimos y aumentando la ampliación durante la inyección puede ayudar a asegurar que sólo la región que el animal está pinchada. Si la aguja debe perforar a través de la cutícula ventral, puesta en común de líquido marcado con colorante será evidente en el exterior de la pupa o saturará el papel de filtro. Es muy recomendable para descartar cualquier pupas que tienen más de una punción de la cutícula. jove_content &quot;&gt; Con las amplias experiencias de muchos laboratorios con el desempeño de las inyecciones de mosquitos adultos, los enfoques de microinyección previamente identificados se puede adaptar con modificaciones de protocolo sencillas para su uso en experimentos de RNAi pupa. En general, el objetivo de este método es proporcionar a los investigadores la capacidad de ampliar el período de tiempo durante el cual los análisis genéticos pueden llevar a cabo, lo que permite una mayor investigación que apoyará el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores inversa. Curiosamente, los experimentos en otras especies, como el Rhodnius prolixus, Spodoptera frugiperda, revelan que el gen efectos de silenciamiento tienden a ser mucho mayor cuando se inicia durante la pre-adulto etapas 38,39. durante todas las etapas de desarrollo, gen mediada por RNAi desmontables está sujeta a consideraciones relativas a la rapidez y la persistencia del silenciamiento de genes, y la estabilidad de las proteínas codificadas por los genes objetivo. el objetivo ideal RNAi los genes tienden a ser las que codifican una protein o ARN que tiene una vida media corta y elevada tasa de rotación 11,40. Aunque las estrategias de RNAi transgénicos también pueden ser empleados para tratar las consideraciones con respecto a la rapidez y la persistencia de la RNAi durante las etapas de pre-adultos, técnicas transgénicas tienen muchos inconvenientes (por ejemplo, tiempo requerido para la generación de líneas transgénicas, experimentales calendarios de apareamientos de mosquitos para generar insectos con la expresión de ARN de doble cadena regulada, y el mantenimiento de las poblaciones de transgénicos). Por el contrario, nuestro protocolo proporciona un método más fácil y más rápido para iniciar la precipitación génica durante el desarrollo de pupa y en tipos de células que se originan y que son accesibles durante la metamorfosis, pero son menos accesibles en los adultos. El uso de suspensiones de dsRNA marcados con colorante permite una fácil evaluación del éxito de la inyección y la dispersión del material introducido dentro de las pupas. Nuestros datos sobre la aparición de la formación de tumores en adultos de pupa inyectado, en comparación con los animales inyectados como adultos, es coherente con initiation de RNAi mediada desmontables durante la fase de pupa. El uso de nuestra línea G3 mosquitos y bajo nuestras condiciones de insectario, se observa la formación de pseudo-tumor melánico adulta a los 10 días después de la inyección de adultos inyectó tres a cinco días después del brote. Mediante la realización de la inyección temprana de pupa-etapa, se observa la formación de melanotic pseudo-tumor visible ya en cinco días después de la inyección (es decir, de tres a cuatro días después del brote). Estos datos implican que este método permite la iniciación de knockdown de genes durante un período de desarrollo anteriormente con-estudiado (es decir, el desarrollo de pupa). Nuestro método de etiquetado de tinte también puede resultar útil para el desarrollo de nuevos protocolos de inyección de larvas, debido a la naturaleza translúcida de la cutícula durante todos los estadios larvales. Mientras que el control utilizado en este estudio requiere progresión en la etapa adulta para mostrar un fenotipo desmontables, futuros experimentos para evaluar fenotipos pupa etapa específica después de la inyección de pupas temprano proporcionaráinformación valiosa con respecto a la expansión de este método en unos periodos de desarrollo adicionales, tales como el desarrollo de pupa tarde. En resumen, este método proporciona un protocolo de ARNi valiosa para la iniciación de la fase de pupa gen desmontables mediante RNAi y amplía las herramientas de genómica funcional para su uso dentro de la comunidad de investigación insecto vector.

La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos que afecta a muchos millones de personas cada año. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que en 2013 había aproximadamente 584.000 muertes debidas a la malaria, el 78 por ciento de los cuales ocurrieron en niños menores de cinco años 1. Los patógenos que causan la malaria humana son parásitos apicomplejos dentro del género Plasmodium y se transmiten entre sus huéspedes humanos por los mosquitos Anopheles hembra. La transmisión se produce cuando el mosquito ingiere sangre de un individuo que está infectado, y luego los depósitos parásitos infecciosos en un individuo no infectado en una comida de sangre posterior. Dentro del género Anopheles, Anopheles gambiae es la especie de mayor capacidad vectorial y es el vector de la malaria más prominente en el África subsahariana 1-3. Actualmente, mosquito vector de control por el despliegue de insecticidas continúa a be el principal método empleado para reducir la carga de la malaria humana. Aunque el uso de insecticidas desde 1960 ha demostrado ser un gran éxito, el aumento de la resistencia a los insecticidas ha conducido una necesidad para el desarrollo de nuevos insecticidas y estrategias de control de vectores alternativa 4-7. Durante el año 2010, un total de 49 de los 63 países que comunicaron a la OMS indica la aparición de resistencia a los insecticidas en los vectores de la malaria 1. Además, la herramienta IR Mapper, que utiliza la literatura revisada por expertos para evaluar los datos de resistencia en las regiones de África tropical, informa que entre 2001 y 2012 hubo 46% y el 27% aumento de la resistencia a los piretroides y diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente 7. La interferencia de ARN (RNAi) fue identificado en la década de 1990 como una técnica que se podrían emplear para inactivar genes en la planta Petunia 8,9 y en el hongo Neurospora crassa 9,10. Poco después,en 1998, el ARNi se documentó por primera vez en Caenorhabditis elegans como un medio de reducir la expresión génica en un modelo animal mediante la introducción de antisentido o ARN de doble cadena (dsRNA) a través de inyección o métodos de alimentación 9,11. Desde su descubrimiento, el ARNi ha revolucionado la búsqueda de la genómica funcional, permitiendo a los investigadores utilizan la genética inversa para investigar rápidamente el papel funcional de los genes de interés a través de un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional altamente selectiva. En algunos organismos, tales como Drosophila melanogaster, el uso de los organismos transgénicos que expresan constructos de ARN de interferencia ha sido ampliamente exitosa para gen desmontables (KD). Aunque el uso de transgenes en An. gambiae de ARNi se ha utilizado y puede resultar útil para pantallas de gran escala, la generación de cepas de mosquitos transgénicos es tanto trabajo y tiempo intensivo, generalmente toman de dos a tres meses para pasar de la identificación de un gen de interés para los Generatien planta de un almacén transgénica apropiada 12. Actualmente, el método primario de KD gen en An. gambiae es por inyección en la hemolinfa, durante la etapa de adulto, de dsRNA específico para un gen dado 12,13. Este proceso generalmente tarda aproximadamente un mes para ir desde la identificación de un gen de interés a la evaluación de KD gen, demostrando ser mucho más rápida que los métodos transgénicos 12. Los métodos para larvas en etapa de ARNi se han establecido recientemente en una. ARN de doble cadena a base de microalgas gambiae y Aedes aegypti a través de la alimentación de nanopartículas 14-17 o mediante la administración oral de moléculas 18, ofreciendo oportunidades para llevar a cabo el análisis genómico funcional durante las primeras etapas de desarrollo. En la inyección directa, la alimentación, y los métodos de liberación de nanopartículas, dsRNA se recoge de forma autónoma por la célula diana y se escinde por la enzima Dicer en 21-25 nucleótidos de longitud &quot;corto de interferencia ARN&quot; (siRNAs) 19,20. Estos siRNAs son entonces incorado en el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), de la que se descartará una hebra, permitiendo que el complejo RISC ARN unido para unirse y escindir el ARNm objetivo y por lo tanto reducir su nivel e inhiben su traducción 19,20. Muchas de las características intrínsecas de la biología básica de mosquitos modulan la capacidad vectorial, incluyendo la preferencia de acogida (por ejemplo, el olfato, gustation), el apareamiento, la reproducción y la inmunidad. Dada la importancia de estos procesos biológicos, es probable que su modulación a nivel genético o farmacológico ofrecerá nuevas oportunidades para el control de vectores, incluyendo la elusión de resistencia a los insecticidas, y proporcionar nuevas herramientas para enfoques más ampliamente integrados para el manejo de vectores. El uso de la genómica funcional para evaluar las funciones de los genes que subyacen a estas características biológicas intrínsecas permitirá la identificación de nuevas dianas y proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo podemos crear efectivamente nuevos, strateg control más efectivoIES. Se describe el desarrollo y el uso de un método de inyección rápida para iniciar RNAi durante la fase de pupa de An. gambiae. Observamos que la inyección estado de pupa de un disparador de ARNi permite la observación de los fenotipos resultantes en adultos en fase inicial, es decir, cuanto antes después de la emergencia de lo que se observaría si gen desmontables se iniciaron en adultos después del brote. Este método permite gen desmontables que comienza durante el intervalo del desarrollo de pupa y que se extiende en etapas adultas, tales principios adultos tipos de células de la hemolinfa de ruedas que desmontables gen iniciado durante el desarrollo pupal puede persistir y afectar, así como los tipos de células que son más hemolinfa de ruedas durante la metamorfosis que en el adulto, como las neuronas sensoriales que se encuentran en apéndices adultos siguientes emergencia.

<table><tbody><tr><td>Kit de ARNi MEGAscript</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Inyector Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pedal Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas de vidrio</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF colorante</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Puede sustituirse por un colorante alimentario no tóxico.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>1371150&frac14; pulgadas cortadas desde la punta para crear una abertura más amplia.</td></tr><tr><td>¿Qué? delgado" papel de filtro&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>Este es de 9 cm de diámetro Grado 1, pero puede modificarse según el tamaño de la almohadilla de inyección.</td></tr><tr><td>Western blot " grueso" papel de filtro</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>Este es el papel de filtro generalmente utilizado para las manchas occidentales.</td></tr><tr><td>Placas de Petri (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pincel (tamaño 0)</td><td>Michael' El</td> tamaño y la marca del pincel Art <td>10474940</td><td>Brush pueden variar según la disponibilidad y las preferencias del usuario.</td></tr><tr><td>Microscopio óptico de disección</td><td>&nbsp;----&nbsp;</td><td>-----</td><td>Esto puede variar en función de la disponibilidad y las preferencias del usuario.</td></tr></tbody></table>

rnai gatillo en la entrega<em&gt; anopheles gambiae</em&gt; las pupas

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

La interferencia de ARN (RNAi), un fenómeno natural en los organismos eucariotas, es una herramienta extremadamente valiosa que se puede utilizar en el laboratorio para estudios genómicos funcionales. La capacidad de eliminar genes individuales de forma selectiva a través de esta técnica de genética inversa ha permitido a muchos investigadores descubrir rápidamente las funciones biológicas de numerosos genes dentro de muchos organismos, mediante la evaluación de fenotipos con pérdida de función. En el principal vector del paludismo humano, Anopheles gambiae, el método predominante utilizado para reducir la función de los genes objetivo consiste en la inyección de doble cadena (dsRNA) en el hemocelo del mosquito adulto. Si bien este método ha sido exitoso, la eliminación de genes en adultos excluye la evaluación funcional de los genes que se expresan y potencialmente desempeñan funciones durante las etapas preadultas, así como los genes que se expresan en un número limitado de células en mosquitos adultos. Describimos un método para la inyección de dsRNA del inhibidor de la serina proteasa 2 (SRPN2) durante la etapa temprana de la pupa y validamos la eliminación de la proteína SRPN2 mediante la observación de la disminución de los niveles de proteína diana y la formación de pseudotumores melanóticos en mosquitos adultos con eliminación de SRPN2. Este fenotipo evidente se ha descrito previamente para el knockdown de la función de SRPN2 en la etapa adulta, y hemos recapitulado este fenotipo adulto mediante el knockdown de SRPN2 iniciado durante el desarrollo de la pupa. Cuando se utiliza junto con una solución de dsRNA marcada con colorante, esta técnica permite una fácil visualización mediante microscopía óptica simple de la calidad de la inyección y la distribución del dsRNA en el hemocel.

La inyección de pupa para los rendimientos gen KD resultados óptimos cuando se realiza la inyección durante la fase de pupa temprano, cuando los niveles de bronceado de la cutícula son bajos (Figura 1A, izquierda y 1B). El aumento de bronceado y el endurecimiento de la cutícula, generalmente después de 24 horas, resulta en aumento de la muerte de pupa después de la inyección (Figura 1A, central y derecho). La tasa de desarrollo de pupa puede variar dependiendo de las condiciones de insectario y la densidad de animales 24,25; Por lo tanto, lo mejor es evaluar visualmente la pigmentación. Durante el proceso de inyección, la aguja capilar se inserta en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 ° en la zona anterior a la dirección posterior (Figura 2A). Una vez que se inserta la aguja y la dsRNA + 0,01% (w / v) se dispensa FGD, la distribución de colorante es evidente a través de la hemolinfa (Figure 2B). Evaluación de la emergencia de los adultos para pupas inyectado con 0,01% (w / v) FGD reveló una tasa promedio de 70% de emergencia, en comparación con 96,7% de emergencia de los controles no inyectados (Figura 3A). Es de destacar que se observó aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no supervivientes (Figura 3B). Animales inyectados no presentan retrasos en el tiempo de la emergencia (Figura 4A) o sesgada de impacto en ambos sexos (Figura 4B). La evaluación adicional de la supervivencia de adultos lleva a cabo hasta el día 10 después del brote revela que no hay impacto evidente en post-emergencia de supervivencia de adultos (Figura 4C). La validación de la calidad de KD se evaluó por el pseudo-tumor melanotic (cluster tejido pigmentación oscura) fenotipo asociado con SRPN2 desmontables 21,22 como un control positivo para knockdown y la<html> ausencia de fenotipos asociados con la inyección dsLacZ como control negativo. Los mosquitos adultos que emergieron fueron anotados en el día 8 después de la inyección (día 6-7 post-emergencia). Se observaron pseudo-tumores melánicos (Figura 5A y 5B) a través de la cutícula del 93,5% de la dsSRPN2 vs. 0% de los mosquitos dsLacZ adultos (Figura 6A). Agrupaciones de tejido oscuro melanizados se identificaron en la disección de los parches pigmentados (Figura 5C). Pseudo-tumores eran visibles en la cutícula de adultos ya en el día 3 post-emergencia y también estaban presentes en un subconjunto de dsSRPN2 hemolinfa y los tejidos intestinales (datos no mostrados). A las 5 de post-inyección (etapa adulta temprana), disminuyó significativamente los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no se observó dsLacZ o aislados de proteína no inyectados hemolinfa (Figura 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: puesta en escena del Desarrollo para la inyección de dsRNA inyección de pupa pupa temprana de los resultados de ARN de doble cadena en la supervivencia y la progresión óptima en la etapa adulta.. Los bajos niveles de pigmentación de la cutícula (A, a la izquierda, y B) se pueden observar dentro de la primera 0-24 horas después de la fase de pupa. Curtido de la cutícula precedente inyección de pupa resultados (derecha A, centro y) de moderada a baja supervivencia. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Figura 2:. Posición de inyección y la distribución de inyección de la aguja dsRNA (A) marcado con colorante capilar de dsRNA marcado con colorante en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 °, en dirección anterior a posterior. (B) El medio de contraste se distribuye de forma visible en la hemolinfa de pupa. volumen de inyección de dsRNA de 138 nl, marcado con 0,01% FGD (w / v). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Figura 3:. Post-inyección emergencia del adulto (A) 70% de pupas inyectado con 0,01% FGD (w / v) emergió con éxito (n = 60), en comparación con 96,7% de los controles no inyectados (n = 60). Se realizaron tres réplicas biológicas. Se observó (B) aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no sobrevivir. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Figura 4: la tasa de emergencia, la evaluación sexo y adultos supervivencia (A) se observaron tiempos de emergencia comparables después de la inyección de pupa con 0,01% FGD (24 hr = 80% y 48 hr = 20%), en comparación con pupas no inyectado (24. HR = 83% y 48 hr = 17%). (B </strong&gt;) se observó Aproximadamente igual hombres y mujeres adultos surgimiento de 0,01% FGD pupas inyectado (mujer = 48% y hombres = 52%) y pupas no inyectado (mujer = 52% y hombres = 48%). Análisis (C) Supervivencia revela que la inyección con 0,01% FGD no afecta la supervivencia de adultos, evaluada hasta 10 días después del brote. Los resultados representan datos de tres experimentos independientes con 0,01% FGD inyectado (n = 60) y pupas no inyectado (n = 60) (igual número de machos y hembras). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Figura 5: Pseudo-tumoral fenotipo control positivo refleja caída éxito se observaron pseudo-tumores en el abdomen (A) y (B) de la cutícula torácica de dsSRPN2: se inyecta, pero no dsLacZ mosquitos adultos inyectadas en el día 8 después de la inyección..(C) aumento mayor (400X) de formación de imágenes (a) de la cutícula y la disección de los parches pigmentadas (b) revela grupos de células oscuramente melanized. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Figura 6: La cuantificación de la formación de pseudo-tumor y la disminución de los niveles de proteína SRPN2 (A) inyecciones fase de pupa resultan en la formación de pseudo-tumor en 93,5% de los adultos dsSRPN2 (n = 21) en comparación con 0% de los controles dsLacZ (n = 19). . Los resultados obtenidos el día 8 después de la inyección. (B) Western blot (izquierda) muestra una disminución en los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no dsLacZ o aislamientos no inyectados proteínas hemolinfa (día 5 después de la inyección). Resultados basados ​​en tres experimentos independientes. Anti-SRPN2 21 y anti-SRPN3 diluciones 26 anticuerpos utilizados fueron 1: 1.000 y 1: 2.000, respectivamente. Cabra anti-raBBIT IgG-HRP (Producto sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) se utilizó a 1: 5000. Todos los niveles de proteína se cuantificaron (derecha) por la intensidad de banda (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalizado a SRPN3, y estadísticamente comparado con la prueba t no pareada. P &lt;0,05: *, P ≥0.05: ns (no significativo). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

El objetivo general de este método es la administración de desencadenantes de interferencia de ARN en Anopheles gambiae para iniciar la reducción de la expresión génica que comienza durante la etapa de pupa del desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de vectores y revelar genes que desempeñan un papel durante las etapas de desarrollo preadultas o tempranas de adultos. La principal ventaja de esta técnica es que brinda a los investigadores la oportunidad de realizar estudios funcionales genómicos rápidos, comenzando la reducción génica durante el intervalo de desarrollo, la etapa de pupa, cuando en el pasado no se habían implementado protocolos de inyección de interferencia de ARN.La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de inyección pueden ser difíciles de dominar debido a la precisión requerida y a la naturaleza delicada de las pupas durante esta etapa de desarrollo. Después de seleccionar el gen de interés, identifique una región de 200 a 800 pares de bases que se prediga que no tenga efectos fuera del blanco y realice la amplificación estándar por PCR para obtener una plantilla para la síntesis de ARN bicatenario, flanqueada por una secuencia promotora T7. Luego, sintetice el ARN bicatenario y purifique los productos utilizando un kit comercial in vitro.Ajuste la concentración final de ARN a tres microgramos por microlitro. A continuación, utilice un gel estándar de agarosa al 2% para comparar una media microlitro del ARN bicatenario con el ADN molde y marcadores estándar. Una vez finalizada la electroforesis, verifique la calidad y la longitud de la banda de ARN bicatenario.No debe haber productos no específicos visibles. El ARN bicatenario migrará más lentamente que el ADN molde. Para el almacenamiento, prepare alícuotas de ARN bicatenario y guárdelas a menos 20 grados Celsius.Comience preparando el colorante Fast Green FCF. En primer lugar, diluya el colorante al 0,1 % en volumen en agua libre de RNasas. A continuación, transfiera volúmenes de un microlitro de la preparación a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros.Caliente los tubos cargados a 65 grados Celsius durante aproximadamente tres horas para evaporar el agua. Luego, enfríe los tubos durante al menos 30 minutos antes de usar los sólidos del colorante. A continuación, prepare agujas de inyección de vidrio estiradas a partir de tubos de vidrio borosilicatado.Configure el extractor de agujas para un diámetro de punta de 10 a 30 micrones. Para un extractor de capilares NARISHIGE, ajuste el primer calentador a 100 y el segundo calentador a 70. Luego sujete la aguja capilar y continúe con el estirado.Ahora, prepare la estación de inyección. Seleccione una plataforma que pueda manipularse fácilmente bajo el microscopio. Sobre la plataforma, primero sujete con cinta un papel filtro grueso.Luego, sobre el papel de filtro grueso, sujete con cinta un papel de filtro delgado. A continuación, agregue 10 microlitros de cada ARN bicatenario que se va a inyectar a los tubos con el colorante en estado sólido y re-suspenda el colorante. Almacene estos tubos en hielo.Ahora, recolecte las pupas que se van a inyectar. Llene una placa de Petri de 60 milímetros con 10 mililitros de agua desionizada y transfiera aproximadamente 50 pupas de color pálido a la placa, utilizando una pipeta plástica de transferencia. Utilice únicamente pupas ligeramente pigmentadas, ya que las pupas que ya han alcanzado niveles medios a oscuros de curtido sufrirán daños en el cutículo y tendrán tasas de supervivencia bajas.El primer paso para la microinyección consiste en abrir la aguja. Bajo el microscopio, rompa la punta más distal de la aguja utilizando pinzas finas. Luego, rellene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja de calibre 30 y una jeringa.Una vez llenado, expulse el exceso de aceite utilizando el microinyector. Configure el microinyector para aspirar volúmenes de 69 nanolitros. Luego, llene la aguja por delante con el ARN de inyección preparado.Pruebe la dispensación de ARN bicatenario para detectar problemas. La obstrucción en la punta y las agujas mal fijadas son las principales causas de problemas. Una vez preparado el inyector, seleccione una a tres pupas y transfiéralas al soporte de papel de filtro.Con un pincel, coloque la pupa de manera que la cutícula dorsal quede accesible. Al presionar sobre el papel, se absorberá el exceso de agua presente en las pupas. Manteniendo la pupa inmóvil con un pincel húmedo, utilice un movimiento de anterior a posterior para insertar la aguja en su cutícula dorsal entre el abdomen y el tórax, aproximadamente a un ángulo de 30 grados.Luego, inyecte uno o dos pulsos de ARN bicatenario en el hemolinfa. Debe ser visible la dispersión del colorante a lo largo del cuerpo si la inyección ha tenido éxito. Durante la inyección de la pupa, es fundamental que la aguja atraviese únicamente la cutícula dorsal.Si la punción con la aguja atraviesa la cutícula ventral, será evidente la acumulación de líquido marcado con colorante en el exterior de la pupa, o el colorante se transferirá al papel de filtro. En tales casos, la pupa debe descartarse. Si el colorante no se distribuye por todo el hemolinfa, es muy probable que la punta esté obstruida.Mueva ligeramente la punta y determine si se ha producido alguna liberación de ARN y colorante. Si no hay indicios de liberación del colorante, deseche la pupa. Luego, evalúe la punta de la aguja y realice otra inyección en una pupa nueva.Después de inyectar con éxito una pupa, utilice un pincel húmedo para liberarla suavemente de la aguja y trasládela al recipiente con agua donde completará su desarrollo. Coloque el recipiente con las pupas inyectadas en una jaula para mosquitos o en un contenedor bajo condiciones normales de cría. Como fuente de alimento para los adultos, proporcione glucosa en una solución al 10% peso por volumen absorbida en una bola de algodón.Después de que los adultos hayan emergido, compárelos con los controles. Por ejemplo, los insectos con ARN de doble cadena para SRPN2 deben evaluarse diariamente para detectar la formación de pseudotumores. Para ello, enfríe los adultos durante dos o tres minutos a menos 20 grados Celsius y transfiéralos a una placa fría de dos grados Celsius para su observación.Después de observar a los adultos, devuélvalos al área de cría de insectos. Una vez dominada la técnica, las pupas inyectadas emergieron con una frecuencia de aproximadamente el 70%. En un subconjunto de las pupas inyectadas, ocurrió una emergencia parcial de la cápsula pupal, lo que provocó mosquitos no viables. No hubo retraso en las tasas de emergencia entre mosquitos inyectados y no inyectados, y los efectos de la inyección no variaron según el sexo.Diez días después de la emergencia, no hubo un cambio notable en la supervivencia de los mosquitos inyectados en comparación con los controles no inyectados. El inhibidor de serina proteasa, SRPN2, se utilizó como control positivo, y el LacZ de doble cadena se utilizó como control negativo para las inyecciones de ARN de doble cadena. A los tres días posteriores a la emergencia, los pseudotumores en los adultos inyectados con SRPN2 de doble cadena fueron evidentes mediante microscopía óptica.Después de ocho días, los seudotumores fueron muy prominentes. En mosquitos en estadio adulto, se pudieron observar seudotumores melanóticos a través de la cutícula en la mayoría de los animales inyectados con ARN bicatenario de SRPN2, mientras que no se observaron seudotumores en los controles. Cinco días después de la inyección, los niveles de la proteína SRPN2 fueron significativamente más bajos en los mosquitos inyectados con ARN bicatenario de SRPN2, en comparación con los controles inyectados con ARN bicatenario de LacZ y los controles no inyectados.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la entrega de un inductor de interferencia de ARN en pupas de Anopheles gambiae, utilizando este protocolo de inyección recién desarrollado. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al movimiento impredecible de la pupa. Sin embargo, practicar la posición y estabilización correctas de la pupa mejora considerablemente la tasa de inyecciones exitosas, así como la calidad de la inyección.Una vez que domine la técnica, estas inyecciones requieren aproximadamente 30 segundos por pupa. Con el desarrollo de esta técnica, hemos allanado el camino para que los investigadores en el campo de la biología de vectores exploren y evalúen la función génica durante las etapas de desarrollo preadultas y tempranas del adulto en el vector de la malaria Anopheles gambiae. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis por inmunotransferencia (Western blot) o la PCR cuantitativa, para determinar el grado de silenciamiento del gen diana a nivel de expresión proteica o de transcritos, respectivamente.En última instancia, esta técnica puede ayudar a identificar genes que son fundamentales para la transmisión del parásito por los mosquitos, y este enfoque nos ayudará a identificar nuevos objetivos y a obtener nuevas perspectivas sobre cómo podemos crear estrategias más efectivas de control de vectores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

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