Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es inmunolocalizar las proteínas que se activan en el embrión de pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo y la biología celular, como la localización y activación de proteínas fosforiladas en un embrión completo. La principal ventaja de esta técnica es que se puede localizar la señalización dependiente del calcio en un embrión entero mediante la inmunotinción de proteínas activadas por el calcio.

Después de obtener embriones de tipo salvaje o transgénicos de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 0.003% de PTU a los embriones en el agua del sistema para bloquear la pigmentación e incubar hasta la etapa de desarrollo deseada. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa correcta, agregue MESAB al plato para anestesiar al pez. Una vez que los peces estén anestesiados, retire la mayor cantidad de agua posible del sistema, luego agregue 4% de PFA y PBS frescos e incube a temperatura ambiente durante tres o cuatro horas.

Después de la incubación, retire el PFA y use metanol al 100% para reemplazarlo. Luego, almacene los embriones a menos 20 grados centígrados durante al menos 48 horas. Para llevar a cabo la inmunotinción, se coloque un mínimo de 10 embriones para cada condición experimental en tubos de microcentrífuga de 1,5 milímetros marcados.

Cuando los embriones se hayan asentado en el fondo del tubo, retire y deseche el metanol y utilice lavados progresivos de concentraciones decrecientes de etanol en PBTx para rehidratar los embriones. Retire el último lavado de PBTx y agregue 0,5 mililitros de suero de cabra normal al 10% o NGS en PBTx. Luego, incube a temperatura ambiente durante al menos una hora con un balanceo suave.

A continuación, retire la solución y añada de 0,2 a 0,5 mililitros de una dilución 1 en 5 de anticuerpo monoclonal de tubulina antiacetilada de ratón y NGS y PBTx al 10%. Incubar los embriones con un balanceo suave a temperatura ambiente durante la noche. Por la mañana, retire y deseche el anticuerpo y realice tres lavados con 0,5 mililitros de 2%NGS y PBTx con un balanceo suave durante cinco minutos cada uno.

Atenúe las luces del techo y agregue 500 microlitros a cada muestra de una dilución de 1 en 500 de anticuerpo secundario conjugado fluorescentemente en 10% de NGS y PBTx. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante cuatro horas con un balanceo suave. Después de la incubación, lavar los embriones tres veces.

A la coinmunotinción, agregue una dilución de 1 en 20 del anticuerpo antifosfo-CaMKII. Incuba en la oscuridad con un suave balanceo durante la noche. A la mañana siguiente, después de lavar los embriones con 2% de NGS y PBTx tres veces, agregue una dilución 1 en 5 de IgG anti-conejo de cabra conjugada fluorescente roja 568 y 10% de NGS y PBTx.

Después de incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante cuatro horas, lave los embriones tres veces y guárdelos en PBTx o 50% de glicerol en PBS, según el procedimiento de imagen. Para montar los embriones para la toma de imágenes, coloque de uno a cinco embriones en un portaobjetos de vidrio. Use cuatro fragmentos de cubreobjetos apilados número uno a cada lado del pez para crear una cámara.

Y coloque un cubreobjetos encima. Con la lente de inmersión en aceite 100X y la luz transmitida, enfoca un solo embrión. Apaga la luz.

Encienda el microscopio confocal con los láseres adecuados y active el enfoque remoto. Abra el programa confocal y en la barra de adquisición, seleccione el objetivo adecuado. Luego, en la barra básica XY, haga clic en el botón 1024 para establecer el tamaño de la imagen.

En la barra de láser y detector, haga clic en las casillas rojas 488 y verdes 568 para encender el detector láser para cada canal y establecer el orificio en medio. Luego, en la barra de ganancia, ajusta la ganancia de cada canal para visualizarlo. A continuación, en la barra de configuración de adquisición, haga clic en vivo para comenzar a adquirir imágenes.

En la barra de configuración de la vista, desmarque la casilla Forzar zoom integral para centrar en la ventana en vivo. En la barra de configuración de adquisición, en la pestaña Z, recorra las capas de la imagen. Después de seleccionar el número de capas que se incorporarán a la imagen, muévase a algún punto en el centro del plano Z.

En la pestaña Z, haga clic en el pequeño cuadro de referencia rojo. Esto pondrá a cero el RFA en el punto elegido como centro. En el cuadro con la etiqueta tamaño del paso, seleccione el grosor de las capas.

Preste atención al cuadro de tamaño de archivo e intente limitar los archivos a un gigabyte. Para encontrar el extremo superior de la imagen, haz clic en el círculo junto a la parte superior y desplázate por las capas Z. Ahora haga clic en el círculo junto a la parte inferior y la computadora llevará la imagen de regreso a la capa como centro.

A continuación, en el cuadro de configuración de adquisición, vuelva a hacer clic en vivo para detener la adquisición del láser. En este panel, haga clic en los cuadros rojos etiquetados como promedio y pila Z. Estas casillas se volverán verdes.

En el cuadro de configuración de adquisición, haga clic en una sola opción para adquirir toda la serie de imágenes. Supervise el progreso a medida que escanea en ambos canales y a través de toda la pila Z. Para guardar, haga clic en la ventana de volumen y haga clic en guardar como y asigne un nombre al archivo.

Para renderizar el archivo por volumen, mientras la pila Z aún está abierta, seleccione el menú desplegable de datos y haga clic en renderizar por volumen. Guarde el archivo renderizado como un archivo punto tif. Esta figura muestra la inmunotinción para P-CaMKII y tubulina acetilada, que es un marcador estándar para los cilios en la vesícula de Kuppfer o KV del pez cebra. La alimentación de los cilios primarios genera un flujo circular de líquido, lo que conduce a una elevación del calcio en las células ciliadas que recubren el KV y a la activación de CaMKII en lugares discretos, como se ve aquí.

Estas figuras muestran el P-CaMKII tal como aparece en la superficie apical de las células ciliadas que recubren regiones específicas de los conductos perinefráticos entre 24 y 72 horas después de la fertilización o HPF. En un día de desarrollo, la oreja embrionaria del pez cebra fijada con PFA y metanol conserva sus estructuras y permite la detección de tinción de CaMKII en la base y a lo largo del kinócilo. A 72 HPF, el oído interno se contratiñó con faloidina Alexa 488 y tubulina antiacetilada con Alexa 568.

La fijación de metanol PFA preservó tanto la F-actina como la tubulina. Estos 30 peces HPF expresaron una GFP dirigida a la membrana, que se perdería con la fijación de metanol. La fijación de PFA dio lugar a una disminución de la señal de P-CaMKII en comparación con la fijación con PFA y metanol.

Sin embargo, en esta etapa de desarrollo, la señal es lo suficientemente fuerte como para ser detectada sin metanol. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar embriones frescos y agentes libres frescos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo localizar las fosfoproteínas en los embriones de pez cebra.