Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y analizar las tasas y patrones de retrotransposición de L-1 a nivel de un solo núcleo utilizando hibridación fluorescente in situ, o FISH. La mayor ventaja de esta metodología es el hecho de que permite al experimentador evitar la sobreestimación o subestimación de las tasas y patrones de retrotransposición, y cuando se complementa con otras metodologías, permite el estudio de la retrotransposición de L-1 a nivel de núcleos individuales. Quien realiza este procedimiento hoy en día es el Dr. Pasano Bojang, investigador principal en el laboratorio.

Para empezar, después de preparar un gel de agarosa del 0,7% al 1% en tampón TAE según el protocolo de texto, utilice CY3 o FITC para etiquetar la sonda SNeo e incubar a 37 grados centígrados durante una hora según el protocolo del fabricante. Mezcle la solución de sonda SNeo marcada con tampón de carga de ADN 1X y cárguela en los pocillos del gel de agarosa. A continuación, haga funcionar el gel de 75 a 100 voltios durante 15 a 20 minutos.

Con un iluminador UV, visualice la banda de la sonda. Y con una cuchilla limpia, corte la sonda SNeo etiquetada del gel. A continuación, utilice un kit de limpieza de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante para solubilizar y purificar la sonda SNeo.

Después de la purificación, vuelva a ejecutar cinco microlitros de sonda SNeo marcada con una sonda SNeo sin marcar en un gel de agarosa al 0,7% para confirmar el aumento de tamaño y la pérdida de intensidad de la señal. Para cuantificar la cantidad de sonda SNeo marcada, mida la absorbancia a 260 nanómetros y diluya la sonda SNeo a 10 nanogramos por alícuotas de microlitro en agua libre de nucleasas. Guarde las alícuotas a menos 20 grados centígrados.

Después de generar clones estables que expresen L-1 competente para la retrotransposición, o columna vertebral del vector, crezcan células HepG2 que expresen de manera estable el vector de control, o L-1. Añadir 0,4 microgramos por mililitro de colcemida al medio de cultivo. E incubar durante 90 minutos para detener las células en la metafase.

Use 10 mililitros de PBS o DPBS de 1X Dulbecco para lavar las celdas dos veces. A continuación, añada la solución de tripsina al 0,25% e incube durante cinco minutos. Se añadieron medios que contenían un 10%FBS para inactivar la tripsina.

A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 Gs y cuatro grados centígrados durante dos minutos. A continuación, aspire el medio del gránulo de la célula y utilice DPBS para lavar las células. Aspire todos menos 200 microlitros de DPBS y utilícelo para resuspender las células mediante un movimiento rápido o un pipeteo suave para asegurarse de que las células se mezclen bien y no contengan grumos.

Mientras gira el tubo horizontalmente, gota a gota, agregue cinco mililitros de solución hipotónica precalentada e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Centrifugar las células a 120 Gs y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, retire todo menos 200 microlitros de solución hipotónica.

Lavar con solución fijadora tres veces, dejando aproximadamente 200 microlitros de solución fijadora en las células entre lavados. Después de los tres lavados, compruebe que el pellet esté visiblemente blanco e hinchado. Luego, con 200 microlitros de solución fijadora de Carnoy, vuelva a suspender el pellet y use el fijador para hacer las siguientes diluciones de las células resuspendidas.

Deje caer 10 microlitros de cada dilución en un portaobjetos seco y limpio desde aproximadamente un centímetro por encima, e inmediatamente exponga el lado libre de untar del portaobjetos al vapor caliente del agua hirviendo durante 30 segundos. Después de secar las pastas para untar a temperatura ambiente, tiña con un medio de montaje que contenga DAPI y monta un cubreobjetos. Después de la incubación, use DPBS para lavar los portaobjetos tres veces.

Para ver las propagaciones, utilice un microscopio de contraste basado en fluorescencia con un aumento de 40X. Después de optimizar la preparación de los pastos, no es necesario mancharlos. Para marcar los márgenes buenos, use un marcador de punta de diamante en el lado opuesto de la diapositiva.

Para estabilizar y deshidratar las dispersiones cromosómicas en metafase, aplique 200 microlitros de RNasa A a las muestras e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Con 2X SSC, lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada uno y use 10 milimolares de HCl para enjuagar las muestras. A continuación, añada un 1% de pepsina a las pastas para untar e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de usar agua desionizada para enjuagar los portaobjetos, use 2X SSC para lavar las muestras dos veces durante cinco minutos cada una. A continuación, añada un 4% de paraformaldehído a las pastas para untar e incube durante 10 minutos, antes de realizar dos lavados adicionales con tampón SSC 2X. Después de los lavados con SSC, deshidrate las pastas para untar incubando las muestras durante dos minutos cada una en la siguiente serie de etanol.

Agregue 30 nanogramos de SNeo al tampón de hibridación y caliente a 72 grados Celsius durante 10 minutos, antes de enfriar a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, pipetee 30 microlitros de la sonda SNeo en cada pliego y utilice un cubreobjetos para cubrir la muestra. Con cemento de caucho, selle los bordes, asegurándose de que no se formen burbujas.

Mantenga la corredera en un bloque de calor a 72 grados centígrados durante cinco minutos. Luego baje gradualmente la temperatura a 37 grados centígrados. Incubar durante la noche en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados centígrados.

Para aplicar un anticuerpo secundario, comience sumergiendo los portaobjetos en un tampón SSC 2X para eliminar los cubreobjetos. A continuación, sumerja los portaobjetos en 2X SSC a 45 grados centígrados durante cinco minutos para lavarlos, antes de transferir las muestras al tampón de lavado y lavar dos veces a 45 grados centígrados durante cinco minutos cada una. A continuación, sumerja los portaobjetos en un tampón SSC 0,1X a 45 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, lave los portaobjetos en un tampón 2X SSC a 45 grados centígrados durante 10 minutos. Después de enfriar los portaobjetos a temperatura ambiente, para sondas marcadas directamente, use 2X SSC para lavar los portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada uno. Equilibre los portaobjetos en el búfer de detección durante 10 minutos en RT. A continuación, añada un medio de montaje que contenga DAPI y contratiña las muestras durante 10 minutos.

Monta un cubreobjetos y usa esmalte de uñas para sellar los bordes. Por último, analice la retrotransposición de L-1 utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 40X. Como se muestra aquí, la densidad de las dispersiones cromosómicas en metafase se determinó mediante la preparación de diluciones y la evaluación de cada dispersión para determinar la densidad, distribución y distancia de las dispersiones desde el núcleo.

Para su posterior análisis se eligieron márgenes de baja densidad con distribución uniforme. Estas imágenes representan disperas cromosómicas que se tiñeron con el colorante DAPI de Hoechst, y las cualidades de dispersión se evaluaron en función de la longitud de los cromosomas, la redondez de las disperas y la distancia entre cromosomas. Si las células se incubaban durante un corto período en solución hipotónica, las dispersiones cromosómicas se anudaban fuertemente y los cromosomas individuales eran difíciles de visualizar.

Sin embargo, una incubación más prolongada en solución hipotónica provocó la ruptura de los núcleos, la dispersión de los cromosomas y/o la pérdida de los cromosomas. Las incubaciones más largas en colcemida aumentaron el número de células en metafase, pero condujeron a la condensación de los cromosomas. Como se ilustra aquí, se encontró que una incubación de 90 minutos en colcemid, 20 minutos en solución hipotónica a 37 grados Celsius y el uso de vapor caliente para reventar las células eran condiciones óptimas para la generación de pastas de alta calidad.

En este experimento, las dispersiones cromosómicas se tiñeron para la retrotransposición de L-1 utilizando sondas que se dirigen a SNeo. La sonda se marcó con FITC y CY3 para mostrar que, en ambos casos, la retrotransposición de L-1 solo se observa en células que expresan L-1 de tipo salvaje. Una vez dominado, este experimento puede completarse en seis u ocho horas, especialmente si los tiempos de hibridación se reducen de dos a cuatro horas y la tecnología se realiza correctamente.

Durante la realización de la tecnología, es importante lavar a fondo, optimizar los tiempos de hibridación y etiquetar químicamente las sondas dNTP para evitar la contaminación. Para responder a preguntas adicionales como la ubicación cromosómica de la inserción, se pueden completar tecnologías adicionales como la secuenciación L-1 y la banda G. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo etiquetar las sondas L-1, llevar a cabo las dispersiones cromosómicas y medir los patrones y las tasas de retrotransposición de L-1 utilizando la tecnología de hibridación fluorescente in situ.

Esta tecnología ha allanado el camino para el estudio de los patrones de retrotransposición de L-1, así como de los sitios de inserción de L-1. Es importante recordar que cuando se trabaja con agentes tóxicos, reactivos biológicos, así como con luz ultravioleta, es esencial tomar precauciones como el uso de guantes y equipo de protección.