Name: Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende a analizar la retrotransposición LINE-1 a nivel de núcleo único en células HepG2 mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Este método permite evaluar con precisión las tasas y patrones de retrotransposición.

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Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (ES014443 y ES017274) y AstraZeneca a KSR.

NOTA: Todas las etapas debe llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Por favor refiérase a la sección Reactivos para obtener más información sobre cómo preparar reactivos individuales. 1. Etiquetado L1 Sondas NOTA: Las sondas pueden marcarse mediante marcaje químico o PCR. <ol><li> etiquetado químico <ol><li> Hacer 0,7-1% en gel de agarosa en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE), el calor en el microondas hasta que se derrita, permita que el gel se enfríe, y luego añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Vierta la mezcla en la bandeja de gel, añadir peines y permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente. </li><li> Marcar la sonda SNEO (1-2 mg) con Cy3 o FITC a 37 ° C durante 1 hora, según el protocolo del fabricante. NOTA: SNEO denota el gen S pliced ​​micina Neo expresado después de un ciclo completo de retrotransposition. La sonda es de ~ 1000 pb de tamaño. SNEO puede PCR amplificado a partir de cualquier vector o genoma deADN ic. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre estreptavidina con Cy3 / FITC reactivos de marcaje. </li><li> Mezclar la solución de la sonda marcada con SNEO tampón de carga de ADN 1x, la carga en cada pocillo y se ejecutan a 75-100 voltios durante 15-20 min. </li><li> Visualizar la banda sonda usando un Ultra Violeta-iluminador (UV). Tenga en cuenta que el tamaño de la sonda SNEO se puede ajustar y que el ácido núcleos Lock (LNA) también se puede añadir (Figura 2). </li><li> Cut sonda marcada SNEO a partir del gel con una hoja limpia, solubilizar y purificar la sonda SNEO del gel usando un kit de PCR Clean-Up de acuerdo con el protocolo del fabricante. PRECAUCIÓN: Cubierta de todas las partes expuestas del cuerpo con escudos de protección (es decir, batas de laboratorio y mascarilla clara UV) durante la visualización y cortando el gel. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para la información de gel de purificar los productos de PCR. </li><li> Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO sonda marcada con una sonda marcada con SNEO ONU en un gel de agarosa al 0,7% (véase el punto 1.1.1) para conaumento de tamaño de la empresa y la pérdida de intensidad de la señal (Figura 2). </li><li> Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO midiendo la absorbancia a 260 nm y se diluye la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H 2 O. almacenar alícuotas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Etiquetado PCR (método alternativo para el marcaje de la sonda) <ol><li> Combinar cebadores específicos SNEO (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;y 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) con reactivos de PCR en un solo tubo: 13,6 l de nucleasa libre de H 2 O; 0.1 dATP l, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 l dTTP (10 nM); 0,05 l dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 l Ir Tag 5x tampón; 0,4 l Ir Tag polimerasa; 1 l plantilla SNEO (10 ng). Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre los reactivos de PCR. </li><li> Ajustar la cantidad de cada reactivo mediante la multiplicación por el número total de muestras. </li><li> Utilice el siguiente parámetro ciclo de PCRs para amplificar y etiquetas SNEO sondas: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; 72 ° C durante 2 min; Mantener a 4 ° C por tiempo indefinido. NOTA: La temperatura de recocido se puede ajustar o PCR gradiente puede ser completado para determinar la temperatura óptima de recocido para otras sondas. </li><li> Hacer gel de 0,7-1% que en la sección 1.1.1, la carga y visualizar la banda de la sonda como en la sección 1.1.4. </li><li> Cortar y purificar la sonda SNEO etiquetada como en la sección 1.1.5. </li><li> Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO etiquetados sonda con sonda SNEO ONU marcado aumento para confirmar el tamaño y la pérdida de intensidad de la señal (ver Figura 2). </li><li> Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO por absorbancia a 260 nm medir y diluir la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H 2 O. </li></ol></li></ol> 2. Preparar las extensiones de cromosomas <ol><li> Generar clones estables que expresan cadena principal del vector (control) o retrotransposition L1 competente utilizando metodologías de selección estándar. 12,16 Aunque se utilizaron reporteros no episomales para correlacionar los resultados con los estudios de la transcripción, también se podrían utilizar vectores episomales. Se cultivan las células que expresan de forma estable el control vectorial o L1 (1 x 10 6 células por placa de 10 cm, con ajustes en el tamaño de la placa hechas según sea necesario) en medio de crecimiento completo. Para las células HepG2, utilice RPMI-1600, 10% de FBS y 200 g / ml de higromicina. Los cultivos deben mantenerse a 70% de confluencia a 37 ° C y 5% de CO2. NOTA: La elección del medio de crecimiento depende del tipo de célula. Dado que los plásmidos usados ​​aquí llevan casetes de selección tanto para higromicina y neomicina, la selección de clones estables también se podría hacer con neomicina después de la selección en higromicina, pero la cantidad de neomicina necesita ser optimizado para establecer los niveles de tolerancia para cada tipo de célula. </li><li> Añadir colcemida (0,4 g / ml) al medio de cultivo y se incuba durante 90 minutos para detener las células en metaphPlaza bursátil norteamericana. Si el uso de diferentes tipos de células, determinar la concentración óptima de colcemid y tiempo de exposición (60, 90, y 120 min) para la detención de la metafase óptima empíricamente. </li><li> Lavar las células 2 veces con 10 ml de PBS de Dulbecco 1x (DPBS), trypsinize mediante la adición de 3 a 5 ml de 0,25% de solución de tripsina a las células y se incuba durante 5 min para separar las células. Inactivar tripsina con una cantidad igual de medio que contiene 10% de FBS. </li><li> Centrifugar las células durante 2 min a 1000 xg a 4 ° C, aspirar el medio del sedimento celular y se lavan las células con DPBS. Aspirar todos DPBS, dejando 200 l de DPBS para volver a suspender las células. Asegurar células se mezclan bien y que todos los grumos se dispersan. Utilice el parpadeo o pipeteo suave para mezclar y dispersar aglomeraciones y evitar vórtex. </li><li> Añadir 5 ml de solución hipotónica (es decir, 75 mM KCl) que se pre-calienta a 37 ° C gota a gota mientras se gira el tubo de 15 ml en horizontal y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Véase la Tabla de Materiales y Reagenct para obtener información sobre cómo obtener y hacer una solución hipotónica. </li><li> centrifugar las células a 120 xg durante 5 min a 4 ° C y repita los pasos 2.4 hasta 2.5 3x dejando aproximadamente 200 l de solución hipotónica para volver a suspender las células después de cada lavado. Asegúrese de que al final de los 3 lavados, el sedimento es visiblemente blanco e hinchado. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 200 l de solución de fijador Carnoy y hacer 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluciones en solución de Carnoy fijador. Caída de 10 l de cada dilución en un portaobjetos limpio y seco de aproximadamente 1 cm por encima y exponer inmediatamente el lado libre de la propagación de vapor caliente de agua hirviendo durante 30 segundos. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener una solución de fijador Carnoy. </li><li> Secar los diferenciales a temperatura ambiente, mancha con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 por inmersión durante 15-20 min en Coplin Jar y lavar 3 veces con DPBS. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo hacer que la solución Hoechst-33342. </li> &lt;li&gt; Ver extiende en microscopio de fluorescencia / contraste de fase en un aumento de 40X. Después de optimizar la preparación de propagación, los diferenciales no necesitan ser teñidas con Hoechst-33342. Ver extiende en el microscopio de contraste de fase en un aumento de 10X para determinar la calidad de la propagación y la separación como se indica en la sección Resultados (ver Figura 3). </li><li> Seleccione y el círculo buenos para untar con un punto de rotulador diamante en el lado opuesto de la corredera (es decir, difundir libre lateral). </li><li> Tienda se extiende a -20 ° C durante un máximo de un mes. Evitar la exposición a la humedad. </li></ol> 3. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) <ol><li> La estabilización de los diferenciales y deshidratando NOTA: Equilibrar el cromosoma en metafase se propaga a temperatura ambiente si se almacena a -20 ° C. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos. <ol><li> Incubar cromosoma en metafase se extiende con 200 l de RNasa A para1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en tampón 2x-SSC dos veces durante 5 minutos cada una, seguidas de un enjuague con una solución de HCl 10 mM. </li><li> Incubar diferenciales con 1% de pepsina durante 10 min a 37 ° C, enjuague con H2O desionizada y se lava dos veces con tampón 2x-SSC durante 5 minutos cada uno. </li><li> Incubar diferenciales con 4% de paraformaldehído durante 10 min y se lava en tampón SSC 2x dos veces durante 5 min cada uno. </li><li> Deshidratar extendido por incubación durante 2 min en serie de etanol: 70%, 80% y 95% de etanol. </li><li> diapositivas secar al aire. </li></ol></li><li> La hibridación se propaga con sondas L1 retrotransposition marcada con (es decir, SNEO) PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos. <ol><li> Añadir 30 ng de SNEO a tampón de hibridación, el calor a 72 ° C durante 10 min y enfriar durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 30 l de solución de sonda SNEO aeada propagación, cubrir con cubreobjetos y sellar los bordes con cemento de goma. Asegurar que no la formación de burbujas. </li><li> Calentar el portaobjetos a 72 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor, deje caer gradualmente la temperatura hasta 37 ° C, y de incubar durante la noche en una cámara húmeda oscuridad a 37 ° C. </li></ol></li><li> Lavado y Visualización (o adición de anticuerpo secundario) PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento. NOTA: Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo prepararse. Se recomienda el uso de un volumen suficiente para cubrir toda la extensión de cromosomas. Recuerde que el exceso de volumen se pierde cuando se añade cubreobjetos. <ol><li> Sumerja los portaobjetos en tampón SSC 2x para eliminar cubreobjetos. </li><li> Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón 2x-SSC a 45 ° C durante 5 min. </li><li> Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón de lavado a 45 ° C durante 5 minutos, 2 veces. </li><li> Lavado de los portaobjetos por inmersión en tampón 0,1 x SSC a 45 ° C durante 10 min. </li><li>Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón SSC 2x a 45ºC durante 10 min. NOTA: Coloque un vaso de Coplin que contiene tampón recomendado en un baño de agua, ajustar la temperatura a 45 ° C. </li><li> Super diapositivas a temperatura ambiente y se equilibran los portaobjetos en tampón de detección. </li><li> Para sondas marcadas directos, vaya al paso 3.4.10. </li><li> Para sondas marcadas indirectos, bloque en tampón de bloqueo durante 20-30 minutos y lavar 3 veces en DPBS. </li><li> Incubar con 50 l de anticuerpo secundario (por ejemplo, 5 mg / ml de estreptavidina-FITC, o αCY3 en tampón de bloqueo) durante 1 hr. </li><li> Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos dos veces. </li><li> Contratinción con solución de Hoechst-33342 (0,1 mg / ml) durante 10 min. NOTA: esta tinción se realiza para teñir cromosomas para co-localización con la sonda. </li><li> Lavar 3 veces en DPBS, añadir una gota de medio de montaje, colocar un cubreobjetos y sellar los bordes con esmalte de uñas. </li><li> Analizar L1 retrotransposition usando microscopio de fluorescencia a 40X magnification. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses en competencia potenciales.

Metodologías como la secuenciación del genoma completo, PCR inversa y transferencia de Southern se han empleado para estudiar L1 retrotransposition. A pesar de estas metodologías son extremadamente valiosos en la localización donde se producen L1 inserciones dentro de los genomas, un desafío de confusión para todos ellos es la necesidad de la programación en silico para volver a montar secuencias. La metodología FISH aquí descrito está diseñado para complementar estos métodos, especialmente en...

Humana largos períodos de actividad nuclear Elemento-1 (Line-1 o L1) es un elemento móvil autónomo que se propaga dentro del genoma a través de un &quot;copiar y pegar&quot; mecanismo de retrotransposition. A L1 humana típica es ~ 6 kb de largo y consiste en una 5&#39;UTR (región no traducida) que sirve como un promotor, dos marcos de lectura abierta (ORFs): L1 y L1 -ORF1 -ORF2, y una 3&#39;UTR con un polyA . cola de la proteína L1 -ORF1 tiene tres dominios distintos: un dominio de bobina de la bobina, el reconocimiento de ARN motivo y dominio C-terminal, mientras que la proteína L1 -ORF2 tiene endonucleasa, la transcriptasa inversa y la cisteína dominios ricos en 1.2.3.4.5. L1 -ORF1 exhibe actividad chaperona de ácidos nucleicos, mientras que L1 -ORF2 ofrece actividades enzimáticas, con las dos proteínas necesarias para retrotransposition 1,2,6. Un ciclo de L1 retrotransposition comienza con la transcripción de la 5&#39;UTR de L1 </em&gt; mRNA bicistrónico por la ARN polimerasa II, la translocación en el citoplasma, y ​​la traducción. En el citoplasma, L1 -ORF1 exposiciones cualquiera de unión a cis donde los paquetes de su propio ARN o unión a trans donde los paquetes de otros ARN (es decir, de seno / EASV / pseudogenes) para formar una partícula de ribonucleoproteína (RNP) con L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocan en el núcleo donde la actividad de endonucleasa de nicks L1 -ORF2p DNA genómico (gDNA) para exponer un OH - grupo 9, que es a su vez usada por la transcriptasa inversa para cebar y revertir RNA sintetizar al ADN a partir del extremo 3 &#39;. Durante la síntesis inversa, la segunda cadena de ADN se mella 7-20 pb desde el sitio original nick para crear pausas escalonadas que están llenos para formar las secuencias de inserción L1 de firma (por ejemplo, TTTTAA) llamados objetivo sitio duplicaciones (TSD) 9,10. Este proceso se conoce como la transcripción inversa objetivo prioritario (TPRT) y conduce a insertien de copias completas o truncadas de L1 / otros ADN con DTE en ambos extremos de la secuencia insertada. L1 retrotransposition También se ha demostrado que es mediado a través de TPRT-como unión de extremos en algunos tipos de células 11 no homóloga. El vector de L1 retrotransposition empleado en nuestros estudios es no episomales y consta de etiquetado L1 -ORF1 y 2p impulsada por los promotores de CMV-L1-5&#39;UTR combinados (Figura 1) 12. Las versiones anteriores de esta construcción se han descrito en los estudios que utilizan levadura y cultivos de células humanas 13,14,15. Dos promotores CMV distintos situados en el 5 &#39;y 3&#39; del vector, con el extremo 3 &#39;colocado en orientación inversa para conducir la expresión de la neomicina después de empalme y la integración. El casete indicador de retrotransposición en el extremo 3 &#39;se compone de un gen insertado antisentido neomicina a L1 -ORFs y vuelve inactivo por separación en dos mitades por una globen el intrón con donante empalmado (SD) y sitios aceptores de corte y empalme (SA) (Figura 1). Tras la integración en un cromosoma, L1 es transcrito a partir del promotor común para producir un mRNA que consiste en un mRNA bicistrónico y mRNA neomicina inactivo. Durante el procesamiento del ARN, el intrón de globina se empalma fuera del gen de la neomicina para restaurar un gen de la neomicina totalmente funcional. El ARNm híbrido se empaqueta en un RNP en cis y transloca en el núcleo cuando se integre en el genoma, ya sea como de longitud completa o truncadas inserciones utilizando TPRT. Aquí se describe una metodología que utiliza hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas dirigidas específicamente al gen de la neomicina empalmado (SNEO) para rastrear los patrones -retrotransposiition L1 y las tasas de inserción a nivel de núcleo único. La eficiencia y la especificidad de la detección se confirmó usando retrotransposition competente y construcciones incompetentes y sondas para detect SNEO o la neomicina y globina intrón 16. Esto explica la metodología para algunas de las deficiencias de los ensayos de retrotransposición base de cultivo de células, tales como inserciones múltiples, resistencia a la colonia y la expansión clon favorable.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labeling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polimerasa</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x tampón incoloro</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Ajuste la concentración de dATP, dGTP, dCTP a 2&nbsp; mM y dTTP a 1.5&nbsp; mM en agua libre de nucleasas.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotina (0.5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado MIRUS FISH Kit</td> de etiquetado <td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Kit</td><td></td> de limpieza de PCR <td>MIRUS</td> MIR3225 <td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Se puede utilizar cualquier reactivo de limpieza de PCR en lugar de la máquina</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>PCR</td> del kit de limpieza de PCR NucleoSpin <td>Cualquier máquina termocicladora se puede utilizar para amplificar el producto de etiqueta.</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparando Spreads de cromosomas</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Añada Colcemid directamente al medio de crecimiento hasta una concentración final de 0,4&nbsp; y micro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Diluido 1&nbsp; M Solución de KCl a 75&nbsp; mM solución para hacer solución hipotónica</td></tr><tr><td>Solución fijadora Carnoy Mezcle</td><td></td><td></td><td>3 volúmenes de metanol y 1 volumen de ácido acético para hacer la solución fijadora Carnoy. Hazlo fresco cada vez.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma 320099</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Disuelva Hoechst-33342 en PBS hasta una concentración final de 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marcador de punta de diamante</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos esmerilados</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Para destechar las células, incubar la célula en tripsina durante 5 min e inactiva con el mismo volumen de medio completo.</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Cualquier bloque de calor se puede utilizar para este fin, aunque se recomiendan los bloques instalados para calentar los bloques.</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados (600&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Llene el vaso de precipitados con agua, caliente hasta hervir, use el vapor caliente para reventar los cromosomas.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Nikon</td><td>125690</td><td>Se puede utilizar cualquier microscopio para observar la calidad de la propagación.</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos y materiales para FISH</citrato</td></tr> <tr><td>trisódico</td> fuerte> <td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Cromido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfato</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SDS Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida de ADN de esperma de salmón</td><td>&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma 322415</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Disolver Hoechst-33342 en PBS hasta una concentración final de 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Cemento de caucho/sellador Cytobond&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Siete frascos Coplin</td> Cámara humidificada <td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Dark</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cubierta</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor digital seco</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>de fluorescencia</tr><tr><td>20x Citrato de sodio salino (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Combine 175 g de NaCl y 88.2&nbsp; g de citrato trisódico con 800 ml de H2O. Remover ajustando a pH 7. Una vez que todas las sales se disuelvan, ajuste el volumen a 1 L y filtre a través de 0.22 &micro; m Papel de filtro. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml de Rnasa A</td><td></td><td></td><td>Diluya 20x tampón SSC a 2x tampón SSC. Disuelva la RNasa A en tampón SSC 2x hasta una concentración final de 1&nbsp; mg/ml. Prepare una solución nueva cada vez.</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td></td><td></td> al 1% <td>Disuelva la pepsina (W/V) en 10 mM de HCl hasta una concentración final de solución al 1%. Hazlo fresco cada vez.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Pesar 4,0 g de PFA en la campana extractora, agregar 50 ml de 1xPBS, calentar a 60&nbsp; &deg; C mientras remueve y ajuste el pH con gotas de NaOH hasta que todo el PFA se disuelva y la solución se vuelva clara. Ajuste el volumen a 100 &nbsp; ml, filtro a través de 0.22 y micro; m Papel de filtro y almacene alícuotas de 5 ml a -20&nbsp; &deg;C. Descongelar la alícuota de PFA en 37 &deg; C durante 10-15 min para usos posteriores. Ajuste el tamaño del filtro en función de la cantidad de paraformaldehído.</td></tr><tr><td>Combine</td><td></td><td></td><td>100 ml de formamida (20%) con 2,5 ml de SSC 20x, ajuste a pH 7 con 1,0 M HCl y lleve el volumen a 500 ml con grado molecular H2O.</td></tr><tr><td>Combine</td><td></td><td></td><td>50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS y 300 ng/ml de ADN de esperma de salmón en 2x tampón SSC. La cantidad de formamida determina qué tan enfocadas están las cromátidas; Titula la cantidad.</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de detección<td>: diluya el tampón SSC 20x a 4x y agregue 0.2% Tween-20 para crear tampón de detección.</td></tr><tr><td>Combine</td><td></td><td></td> un <td>5% de albúmina sérica bovina (BSA) con un 0,2% de Tween-20 en 4 tampones SSC.</td></tr><tr><td>Solución deshidratante Prepare</td><td></td><td></td><td>soluciones de etanol al 70%, 80% y 95%.</td></tr></tbody></table>

análisis de retrotransposition line-1 en el núcleo un piso

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

elemento nuclear intercalado de largo (Línea-1 o L1) representa aproximadamente el 17% del ADN presente en el genoma humano. Si bien la mayoría de los L1s están inactivos debido a truncamientos 5', ~ 80-100 de estos elementos permanecen competentes para la retrotransposición y se propagan a diferentes lugares en todo el genoma a través de intermediarios de ARN. Si bien se cree que las L1 más antiguas se dirigen a regiones ricas en AT del genoma, los objetivos cromosómicos de las L1 más nuevas y activas siguen estando mal definidas. Aquí describimos la metodología de hibridación fluorescente in situ (FISH) que se puede utilizar para rastrear los patrones de inserción de L1 y las tasas de incorporación ectópica de L1 a nivel de núcleo único. En estos experimentos, se emplearon sondas de neomicina marcadas con isotiocianato de fluoresceína/cianina-3 (FITC/CY3) para rastrear la retrotransposición de L1 in vitro en células HepG2 que expresan L1 ectópica de manera estable. Esta metodología evita errores en la estimación de las tasas de retrotransposición planteadas por la toxicidad y tiene en cuenta la ocurrencia de múltiples inserciones en un solo núcleo.

Un diagrama esquemático del vector retrotransposition L1 se presenta en la Figura 1. El vector consiste en un gen de la neomicina en la orientación antisentido con respecto a L1 ORFs que está interrumpido por un intrón de globina en la orientación sentido y emparedada por SD y SA sitios. Cuando se integra de forma estable en un cromosoma, L1 mRNA se transcribe a partir del CMV y el promotor combinado L1-5&#39;UTR (Figura 1). Du...

Aquí empleamos la metodología FISH para realizar un seguimiento de retrotransposition LINE-1 a nivel individual en el cromosoma núcleos diferenciales de líneas de células HepG2 que expresan de forma estable LINE-1 sintético.

Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y analizar las tasas y patrones de retrotransposición de L-1 a nivel de núcleo individual mediante hibridación fluorescente in situ, o FISH. La ventaja principal de esta metodología es que permite al investigador evitar la sobreestimación o subestimación de las tasas y patrones de retrotransposición, y cuando se complementa con otras metodologías, posibilita el estudio de la retrotransposición de L-1 a nivel de núcleos individuales. Realizando este procedimiento hoy está el Dr. Pasano Bojang, investigador principal en el laboratorio.Para comenzar, después de preparar un gel de agarosa al 0,7 % al 1 % en tampón TAE según el protocolo descrito en el texto, marque la sonda SNeo con CY3 o FITC e incube a 37 grados Celsius durante una hora según el protocolo del fabricante. Mezcle la solución de la sonda SNeo marcada con tampón de carga de ADN 1X y cargue en los pocillos del gel de agarosa. A continuación, corra el gel a 75-100 voltios durante 15-20 minutos.Utilizando un iluminador UV, visualice la banda de la sonda. Y con una cuchilla limpia, corte la sonda SNeo marcada del gel. Luego, use un kit de purificación de PCR según el protocolo del fabricante para solubilizar y purificar la sonda SNeo.Después de la purificación, vuelva a correr cinco microlitros de sonda marcada con SNeo junto con una sonda SNeo no marcada en un gel de agarosa al 0,7 % para confirmar el aumento de tamaño y la pérdida de intensidad de señal. Para cuantificar la cantidad de sonda SNeo marcada, mida la absorbancia a 260 nanómetros y diluya la sonda SNeo hasta obtener alícuotas de 10 nanogramos por microlitro en agua libre de nucleasas. Almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius.Después de generar clones estables que expresen L-1 con capacidad de retrotransposición, o el vector control, cultive células HepG2 que expresen establemente el vector de control o L-1. Añada 0,4 microgramos por mililitro de colcemida al medio de cultivo e incube durante 90 minutos para detener las células en metafase.Utilice 10 mililitros de PBS 1X de Dulbecco, o DPBS, para lavar las células dos veces. A continuación, agregue la solución de tripsina al 0,25% e incube durante cinco minutos. Se agregó medio que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS) para inactivar la tripsina.A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 Gs y cuatro grados Celsius durante dos minutos. Luego aspire el medio del pellet celular y use DPBS para lavar las células. Aspire todo excepto 200 microlitros de DPBS y utilice este volumen para resuspender las células mediante golpecitos suaves o pipeteo suave, asegurándose de que las células estén bien mezcladas y no contengan grumos.Mientras se gira el tubo horizontalmente, añadir de forma gota a gota cinco mililitros de solución hipotónica precalentada e incubar a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Centrifugar las células a 120 Gs y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego, eliminar todo excepto 200 microlitros de la solución hipotónica.Lave con la solución fijadora tres veces, dejando aproximadamente 200 microlitros de solución fijadora en las células entre cada lavado. Después de los tres lavados, verifique que el precipitado sea visiblemente blanco e hinchado. Luego, con 200 microlitros de solución fijadora de Carnoy, re suspenda el precipitado y utilice la solución fijadora para realizar las siguientes diluciones de las células re suspendidas.Suelte 10 microlitros de cada dilución sobre un portaobjetos seco y limpio desde aproximadamente un centímetro por encima, y exponga inmediatamente el lado del portaobjetos sin extender al vapor caliente del agua hirviendo durante 30 segundos. Después de secar las extensiones a temperatura ambiente, tiña con medio de montaje que contenga DAPI y coloque un cubreobjetos. Tras la incubación, lave los portaobjetos tres veces con DPBS.Para observar los extendidos, utilice un microscopio con contraste de fluorescencia a 40X de aumento. Después de optimizar la preparación de los extendidos, no es necesario teñirlos. Para marcar los buenos extendidos, use un marcador de punta de diamante en el lado opuesto del portaobjetos.Para estabilizar y deshidratar las extensiones de cromosomas en metafase, aplique 200 microlitros de RNasa A a las muestras e incube a 37 grados Celsius durante una hora. Lave los portaobjetos dos veces con 2X SSC durante cinco minutos cada vez, y enjuague las muestras con HCl 10 milimolar. A continuación, agregue pepsina al 1 % a las extensiones e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Después de usar agua desionizada para enjuagar los portaobjetos, lave las muestras dos veces con SSC 2X durante cinco minutos cada vez. Luego, agregue paraformaldehído al 4% a las extensiones e incube durante 10 minutos, antes de realizar dos lavados adicionales con tampón SSC 2X. Tras los lavados con SSC, deshidrate las extensiones incubando las muestras durante dos minutos cada una en la siguiente serie de etanol.Añada 30 nanogramos de SNeo al tampón de hibridación y caliente a 72 grados Celsius durante 10 minutos, antes de enfriar a temperatura ambiente durante dos minutos. Luego, pipetee 30 microlitros de la sonda SNeo sobre cada preparación, y utilice un cubreobjetos para cubrir la muestra. Con cemento de goma, selle los bordes, asegurándose de que no se formen burbujas.Mantenga el portaobjetos en un bloque térmico a 72 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, reduzca gradualmente la temperatura a 37 grados Celsius. Incube durante la noche en la oscuridad, en una cámara humidificada a 37 grados Celsius.Para aplicar un anticuerpo secundario, comience sumergiendo los portaobjetos en tampón 2X SSC para retirar las cubreobjetos. Luego, sumerja los portaobjetos en 2X SSC a 45 grados Celsius durante cinco minutos para lavarlos, antes de transferir las muestras al tampón de lavado y realizar dos lavados a 45 grados Celsius durante cinco minutos cada uno. A continuación, sumerja los portaobjetos en tampón 0.1X SSC a 45 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, lave las laminillas en tampón SSC 2X a 45 grados Celsius durante 10 minutos. Después de enfriar las laminillas a temperatura ambiente, para sondas marcadas directamente, use SSC 2X para lavar las laminillas dos veces durante cinco minutos cada vez. Equilibre las laminillas en tampón de detección durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue el medio de montaje que contiene DAPI y contratiña las muestras durante 10 minutos.Monte un cubreobjetos y use esmalte de uñas para sellar los bordes. Finalmente, analice la retrotransposición de L-1 utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 40X. Como se muestra aquí, la densidad de los extendidos de cromosomas en metafase se determinó preparando diluciones y evaluando cada extendido en cuanto a densidad, distribución y distancia respecto al núcleo.Se seleccionaron extensiones de baja densidad con distribución uniforme para el análisis posterior. Estas imágenes representan extensiones cromosómicas teñidas con el colorante Hoechst DAPI, y la calidad de las extensiones se evaluó según la longitud de los cromosomas, la redondez de las extensiones y la distancia entre cromosomas. Si las células se incubaron durante un período corto en solución hipotónica, las extensiones cromosómicas se volvieron estrechamente enredadas y fue difícil visualizar los cromosomas individuales.Sin embargo, una incubación más prolongada en solución hipotónica provocó la ruptura de los núcleos, la dispersión de los cromosomas y/o la pérdida de cromosomas. Incubaciones más largas en colcemida aumentaron el número de células en metafase, pero provocaron la condensación de los cromosomas. Como se ilustra aquí, una incubación de 90 minutos en colcemida, 20 minutos en solución hipotónica a 37 grados Celsius y el uso de vapor caliente para romper las células resultaron ser condiciones óptimas para la obtención de preparaciones de alta calidad.En este experimento, se tiñeron extensiones cromosómicas para la retrotransposición de L-1 utilizando sondas dirigidas contra SNeo. La sonda se marcó con FITC y CY3 para demostrar que, en ambos casos, la retrotransposición de L-1 se observa únicamente en células que expresan L-1 de tipo silvestre. Una vez dominado, este experimento puede completarse en realidad en seis a ocho horas, especialmente si los tiempos de hibridación se reducen de dos a cuatro horas y la técnica se realiza adecuadamente.Al realizar la tecnología, es importante lavar minuciosamente, optimizar los tiempos de hibridación y marcar químicamente las sondas de dNTP para evitar contaminación. Para responder preguntas adicionales, como la ubicación cromosómica de la inserción, se pueden realizar tecnologías adicionales como la secuenciación de L-1 y el bandeo G. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo marcar las sondas de L-1, realizar extensiones cromosómicas y medir los patrones y tasas de retrotransposición de L-1 utilizando la tecnología de hibridación fluorescente in situ.Esta tecnología ha allanado el camino para el estudio de los patrones de retrotransposición de L-1, así como de los sitios de inserción de L-1. Es importante recordar que al trabajar con agentes tóxicos, reactivos biológicos y luz ultravioleta, son esenciales precauciones como el uso de guantes y equipo de protección.

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