Name: Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a analizar el transcriptoma de embriones bovinos preimplantacionales mediante microarrays de dos colores con bajas cantidades de ARN total. Este método optimizado permite evaluar la calidad embrionaria y mejorar las tecnologías reproductivas en ganado lechero.

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Investigación apoyada por la Agencia de Ganadería y Carne de Alberta, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, y la Rama de Investigación Ganadera, Alberta Agriculture and Forestry.

La parte animal de este estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación Metabólica de la Universidad de Alberta, Edmonton, Canadá, con todos los procedimientos experimentales animales aprobados (Protocolo # AUP00000131) por la Universidad de Alberta Cuidado de Animales y el empleo, y los animales atendidos de acuerdo al Consejo canadiense de manejo de estos animales (1993). 1. Embriones producción, aislamiento de ARN total y tratamiento con DNasa <ol><li> Para los protocolos experimentales animales y recogida de embriones consulte en nuestras publicaciones anteriores 17, 18. </li><li> Piscina y congelamiento rápido embriones etapa similar de cada vaca en nitrógeno líquido y luego mantener a -80 ° C hasta la extracción de RNA. </li><li> Extraer el ARN total a través de un kit de extracción de ARN basado en columnas, que permite extraer el ARN de muestras de pico-escala (kit de información está disponible en la lista de materiales). NOTA: Se recomienda kit contiene: Tampón acondicionado, extracción Buffer, etanol al 70%, tampón de lavado 1, el tampón de lavado 2, tampón de elución, columnas de purificación de ARN con tubos de recogida y tubos de microcentrífuga. </li><li> Añadir 10 l tampón de extracción de embriones que contienen los tubos e incubar durante 30 minutos a 42 ° C. Tubo de centrífuga a 800 xg durante 2 min para recoger extracto de células en el tubo de microcentrífuga. </li><li> Pipetear 250 l acondicionado Buffer sobre la membrana de filtro de la columna de purificación. Incubar la columna de purificación de ARN con acondicionado Buffer durante 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna de purificación en el tubo de recogida a 16.000 xg durante 1 min. </li><li> Pipeta de 10 l de 70% de etanol en la mezcla de tampón de extracción de ARN y embriones. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. mezcla de la pipeta en la columna de purificación previo de adaptación. </li><li> Para enlazar ARN, centrífuga de la columna de purificación de 2 min a 100 xg y seguir inmediatamente por una centrifugación a 16.000 xg durante 30 s para eliminar el flujo a través. </li><li> Pipetear 10081; L de tampón de lavado 1 en la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g. Se recomienda DNasa tratamiento si la realización de la transcripción inversa o amplificación después de aislamiento de ARN: NOTA. </li><li> Digerir el ADN genómico de la derecha después del paso 1.8. NOTA: Se recomienda DNasa kit está disponible en la lista de materiales. Set recomendado contiene: DNasa I y solución madre de tampón. </li><li> Preparar la mezcla de incubación ADNasa mediante la mezcla de 5 l DNasa I de solución madre con 35 l de tampón. Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Pipetear la mezcla de incubación 40 l de DNasa directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Pipeta de 40 l de tampón de lavado 1 en la membrana de la columna de purificación y centrifugar a 8000 xg durante 15 s. </li><li> Pipetear 100 l de tampón de lavado 2 a la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g. </li><li> Pipetear otros 100 l de tampón de lavado 2 en la columna de purificación y centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g. </li><li> Transferir la columna de purificación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Pipetear 11 l de tampón de elución directamente sobre la membrana de la columna de purificación. Para asegurar la máxima absorción de tampón de elución en la membrana, toca suavemente la punta de la pipeta a la superficie de la membrana mientras dispensa el tampón de elución. </li><li> Incubar la columna durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampón de elución en la columna, y luego girar durante 1 min a 16.000 xg para eluir el ARN. </li><li> Utilice instrumento Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar la calidad y la cantidad 19 de ARN. </li><li> Almacenar la muestra de ARN a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. La amplificación de ARN y etiquetado de los análisis de microarrays NOTA: Para el usuario por primera vez que trabaja con procedimientos de amplificación de ARN y etiquetado, utilizar cinco ng de ARN espiga-en along con las muestras reales ARNa para supervisar la medición de control de calidad de la amplificación del ARN y la hibridación. La espiga-en la mezcla de ARN contiene diez sintetizados, polyadenylated transcripciones in vitro en relaciones predeterminadas. Cuando el procedimiento se realiza correctamente, los transcritos marcados se hibridan específicamente sólo para sondas de control complementarios en las matrices y los datos pueden ser escaneados para realizar un seguimiento de garantía de control de calidad con auto mínima o la hibridación cruzada. Más detalles sobre el procedimiento descripción de pinchos-en intensidades de control y normalización después de escanear la matriz y el análisis de datos se refiere a las publicaciones anteriores 20, 21. El siguiente procedimiento se da a los usuarios de microarrays de rutina. <ol><li> Preparar (valor de número de RNA de Integridad (RIN) al menos&gt; 7,0) 100 pg de alta calidad de la muestra de ARN en un volumen total de 10 - 11 l. </li><li> Amplificar las muestras de ARN con un kit de amplificación de podertrabajar con muestras de pico-escala (tan poco como 100 pg). NOTA: Se recomienda kit de amplificación de la información está disponible en la lista de materiales y sigue las instrucciones del fabricante, sin ninguna modificación. </li><li> Utilice una cuantificación basada en fluorescencia para evaluar el perfil de la gama de tamaños de la ARNa amplificado. </li><li> Utilizar el aparato espectrofotómetro (basado en la absorbancia a 260 y 280 nm) para medir la concentración del ARNa amplificado. </li><li> Almacenar el ARNa amplificado a -80 ° C hasta que esté listo para el etiquetado. </li><li> Utilizar 2 g de ARN amplificado para el marcaje fluorescente de acuerdo con ULS Arna guía de usuario del equipo de etiquetado. NOTA: Desde Cyanine 547 y 647 de tinte de cianina son sensibles a la fotodegradación y Cyanine 647 colorante se degrada fácilmente por el ozono, el procedimiento se lleva a cabo el etiquetado en una cantidad mínima de luz y bajo un ambiente libre de ozono. </li><li> Encienda la caja de ozono (Figura 1A) hasta que el nivel de ozono es de 0.001 ppm. </li><li&gt; do la configuración de la reacción dentro de la caja de ozono (Figura 1B) mediante la adición de 2 l de Cyanine 547 o Cyanine 647, 2 l de tampón de etiquetado, y luego ajustar a un volumen final de 20 l con agua libre de RNasa bajo la luz de seguridad. Añadir filtro de cuarto oscuro para la fuente de luz. </li><li> Mezclar suavemente y se incuban los tubos en un termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar las muestras en hielo durante al menos 1 min. Centrifugar para recoger el contenido de los tubos antes de proceder con el kit de extracción de ARN, excepto pasos relacionados con el tratamiento de DNasa (1,9 a 1,11), para limpiar el ARN amplificado marcado con Cy-tinte. </li><li> Utilizar el aparato espectrofotómetro para medir y determinar la concentración de ARN amplificado marcado y mantener el ARNa marcado a -80 ° C como máximo durante 3 días antes de su uso. </li></ol> 3. microarrays de hibridación y lavado NOTA: Los siguientes pasos importantes se adaptan de acuerdo a protocolo de análisis de dos colores basados ​​en microarrays de expresión de genes (versión6.5, mayo de 2010). <ol><li> Añadir la misma cantidad de 825 ng de cada Cyanine 547- 647 y Cyanine marcado con Arna y mezclar con 25x 10x fragmentación y tampones de bloqueo. </li><li> Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 15 minutos y dejar enfriar sobre hielo durante 1 min. </li><li> Añadir la misma cantidad de tampón de hibridación 2x ​​y mezclar bien. </li><li> Centrifugar a 13.000 rpm, a continuación, la mezcla está lista para la hibridación. </li><li> Cargar 100 l de la mezcla sobre el portaobjetos matriz y sellar la diapositiva dentro de la cámara de hibridación. </li><li> Carga de la cámara montada en el horno de hibridación durante 17 horas a 65 ° C que gira a 10 rpm en el horno. </li><li> Se lavan las matrices de acuerdo con el protocolo de tratamiento con la protección del ozono mediante la sumersión en la estabilización y la solución de secar durante 30 s. </li><li> Retire las matrices de la solución y asegúrese de que la superficie de la matriz es seco, sin partículas de polvo </li></ol> 4. Digitalización de microarrays de diapositivas <ol><li> Mantenga las matrices en un lugar oscuro y encienda scanner hasta que está listo para usar (15 min tiempo de espera). </li><li> Cargar el código de barras de matriz a la izquierda, en el escáner y comenzar a escanear. Hacer el análisis in situ conforme a la guía de usuario del software y guardar los datos como (GPR) formato de archivo. </li></ol> 5. Análisis estadístico <ol><li> Descargar el software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Haga clic en &quot;datos en bruto de importación&quot; y cargar los archivos gpr en FlexArray. </li><li> Realizar la normalización y el análisis estadístico si es necesario siguiendo las instrucciones. Nota: Se calcula el umbral para la selección punto positivo en este estudio, ya que se ha descrito previamente 22. </li><li> Seleccione el menú desplegable manual desde el visor gráfico de la FlexArray para ver todos los puntos híbridas, y las señales de fondo. Nota: Un cuadro similar de pinchos en los controles después de la hibridación de la micromatriz se puede ver en estudio previo 8. </li><li> Seleccione unloess normalización dentro de la matriz siguiente por un cuantil entre el proceso de normalización de las matrices de la FlexArray desplegable manual de consecuencia. </li><li> Exportar todos los datos normalizados de FlexArray en un archivo Excel para su posterior uso. </li></ol> 6. Análisis de Bioinformática La anotación original de las secuencias de la sonda a partir de transcritos específicos de embrión bovino (BESTv1) microarray se ha descrito previamente 8. En este estudio, se obtuvieron 20.403 símbolos de genes únicos (GS) ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Suplemento archivo1</a> ) a través de la información de laboratorio Sistema de Gestión de EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Una lista de los 6.765 genes únicos ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Suplemento archivo2</a> fue seleccionado) y correspondió a las señales positivas después de todo proceso de normalización de microarrays (paso 50.5) de bovino Día 7 gen embriones perfil de expresión. Umbral de señal positiva se calculó basándose en la publicación permeable 16 de la intensidad de la señal de un valor A. <ol><li> Para realizar el análisis funcional con PANTHER (análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas) Clasificación del Sistema 23, 24, abra el siguiente enlace (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li> Sube una lista de 6.765 GS específicos del embrión para identificar los procesos biológicos específicos durante el desarrollo embrionario mediante la prueba estadística excesiva y utilizar configuración predeterminada de Bos taurus (todos los genes en la base de datos) como lista de referencia 25. NOTA: Esto permite la identificación de los procesos relacionados con el desarrollo de la GO términos que son estadísticamente excesiva o insuficiente expresado mediante una prueba binomial. </li><li> Establecer el umbral de valor P a &lt;0,05 como valor predeterminado del software. Los datos pueden descargarse y exposiciónrted en un archivo de Excel para su posterior selección 16. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El primer problema para llevar a cabo el análisis de microarrays utilizando Día 7 embriones bovinos no está recibiendo cantidades suficientes de ARN de alta calidad para el estudio de la expresión génica. Tradicional fenol / cloroformo extracción de RNA y método de precipitación con etanol, no se recomienda para el día 7 embriones, lo que resulta en un bajo rendimiento y la posible inhibición de fenol restos de reacción de amplificación de ARN. En lugar de ello, un método basado en la columna estándar es mejor para aisl...

La pérdida embrionaria temprana en vacas lecheras de alta producción es uno de los principales retos en la industria láctea 1, 2. Bovina se ha convertido en un modelo interesante para estudiar el desarrollo de preimplantación de embriones humanos debido a su proceso de desarrollo similares 3, 4. Sin embargo, se requiere más investigación para tener una mejor comprensión acerca de los genes implicados en el desarrollo embrionario temprano bovina. Después de veinte años desde la primera tecnología de microarrays desarrollaron en 1995 5, el desarrollo de más sofisticada tecnología de sonda de fabricación reducidos errores de impresión y la variabilidad de los chips de matriz dentro y entre las diferentes plataformas de microarrays 6. La tecnología de microarrays mejorada dio como resultado una amplia aplicación de esta tecnología en la investigación clínica 7 y, más recientemente, en embrión temprano qevaluación uality 8. La gran cantidad de material necesario para la tecnología de microarrays es la razón principal por la que la tecnología de microarrays inicialmente no introduzca un número de campos de investigación tales como el desarrollo embrionario temprano. Más recientemente, los métodos de amplificación de ARN se han mejorado para amplificar linealmente ARN hasta el nivel de microgramos de sub-nanogramos material de partida 9 ARN. Hay varios kits de amplificación de ARN comerciales disponibles en el mercado; sin embargo, las más populares kits bien desarrollados están relacionados con Ribo-cebador único amplificación isotérmica 10 y 11 impulsadas promotor T7 métodos. El más popular de amplificación del ARN antisentido utiliza la transcripción in vitro con un cebador oligo dT que une a un promotor de T7 en el extremo 5 12. Esta tecnología permite mantener la mayor parte de las transcripciones antisentido representativas después de la amplificación lineal fo matrices de hibridación 13. Este método ha sido adaptado para amplificar el nivel de picogramos de ARN total extraído de embriones bovinos 8. Sistema de elevador universal (ULS) es el método de marcaje que incorpora directamente el ADN o ARN amplificado con colorante fluorescente de platino ligado ya sea Cyanine 547 o Cyanine 647, formando un enlace de coordinación en la posición N7 de la guanina 14. Este método fue adaptado en la investigación de embriones para generar más estable amplificada Arna sin modificaciones en comparación con el aminoallyl modificó Arna generado por el método enzimático 15. Ambos métodos único colorante y etiquetado dos colorantes se han adaptado utilizando Sistema de Enlace Universal de microarrays. Un amplio estudio de microarrays comparaciones fue que existe una buena correlación entre la calidad de datos entre las plataformas de gama de uno y de dos colores 6. Recientemente, tanto en coche T7 promotormétodos n RNA antisentido de amplificación y etiquetado ULS se han desarrollado para proporcionar un protocolo más fiable para generar una cantidad suficiente de materiales de alta calidad marcado ARNa para microarrays de hibridación 8, 16. Por lo tanto, este estudio proporciona un protocolo para demostrar algunas de las etapas importantes de la extracción de ARN para el análisis de datos de microarrays involucrado en dos colores usando Día 7 embriones bovinos como un ejemplo.

<table><tbody><tr><td>Kit de aislamiento de ARN PicoPure</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>juego de DNasa libre de ARNasa (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Biosystems Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de cribado de ARN</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado fluorescente ULS</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Micromatrices de expresión génica personalizadas</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F Tampón</td><td></td></tr> de <tr><td>lavado de expresión génica Agilent 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado de expresión génica Agilent 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón de hibridación de altas RPM</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Pieza #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Tampón de fragmentos</td><td>Agilent Technologies Parte</td><td>#5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x Agente de bloqueo GE</td><td>Agilent Technologies Parte</td><td>#5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Solución de estabilización y secado</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Pieza #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de juntas habilitados por Agilent SureHyb tecnología</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Paquete de 20 portaobjetos de juntas, 4 microarrays/portaobjetos</td></tr><tr><td>Kit de espiga de ARN de dos colores</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Cat # 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de matriz GenePix 4000B</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>GENEPIX 4000B-U Caja</td><td></td></tr><tr><td>sin ozono</td><td>Bandeja de biobandeja</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>archivo GAL</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptoma de perfiles de in-vivo productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

La pérdida embrionaria temprana es un gran contribuyente a la infertilidad en el ganado. Además, el bovino se convierte en un modelo interesante para estudiar el desarrollo embrionario preimplantacional humano debido a su proceso de desarrollo similar. Aunque se sabe que los factores genéticos afectan el desarrollo embrionario temprano, el descubrimiento de tales factores ha sido un serio desafío. La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de los niveles de transcripción en todo el genoma. Una de las principales decisiones que hay que tomar a la hora de planificar un experimento de microarrays es si se va a utilizar un enfoque de uno o dos colores. El diseño de dos colores aumenta la replicación técnica, minimiza la variabilidad, mejora la sensibilidad y la precisión, así como permite tener diseños de bucle, definiendo las muestras de referencia comunes. Aunque los micromatrices son una poderosa herramienta biológica, existen posibles escollos que pueden atenuar su poder. Por lo tanto, en este documento técnico demostramos un protocolo optimizado para la extracción, amplificación, etiquetado, hibridación del ARN amplificado marcado a la matriz, escaneo de la matriz y análisis de datos utilizando la estrategia de análisis de dos colores.

Un resultado representativo de ARN total y se amplificó ARNa desde el día 7 embriones bovinos se muestra en la Figura 3 y resume en la Tabla 1. integridad y el perfil de ARN pueden ser evaluados después de la extracción de RNA. Evaluación de la calidad del ARN podría hacerse mediante documento Bioanalyzer (Figura 3A) y sólo las muestras con valor superior a 7,0 RIN está califi...

La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

El objetivo general de este video es proporcionar un procedimiento técnico optimizado utilizando una matriz bovina de dos colores hecha a medida utilizando una baja cantidad de ARN total de embriones bovinos del séptimo día. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la pérdida embrionaria en vacas lecheras de alta producción y preguntas sobre la calidad embrionaria en relación con la expresión génica en el embrión en desarrollo antes de la implantación. La ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la expresión génica utilizando el nivel de picogramos del ARN total extraído de embriones individuales.Este método puede proporcionar información sobre el factor que afecta a la supervivencia de los embriones bovinos producidos in vivo antes de la implantación. Esto también puede ayudar a mejorar las tecnologías reproductivas, como la producción de embriones in vitro. Para comenzar el procedimiento, prepare embriones bovinos congelados en un tubo de microcentrífuga a partir de un kit de extracción de ARN a escala pico basado en columna.Agregue 10 microlitros de tampón de lisis al tubo e incube los embriones a 42 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante dos minutos a 800 veces G.Pipetear 250 microlitros de tampón acondicionador en la membrana del filtro de la columna de purificación e incubar la columna durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el tubo colector a 16.000 veces G durante un minuto para terminar de preacondicionar la columna.Añadir 10 microlitros de etanol al 70% a la mezcla de tampón de lisis y embriones y mezclar bien. A continuación, cargue la mezcla en la columna de purificación. Centrifugar la columna durante dos minutos a 100 veces G y luego a 16.000 veces G durante 30 segundos.Agregue 100 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante un minuto. Usando un kit de DNasa, mezcle cinco microlitros de solución madre con 35 microlitros de tampón y mezcle invirtiendo suavemente el tubo cerrado. A continuación, cargue la mezcla de DNasa en la membrana de la columna de purificación e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Agregue 40 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante 15 segundos. A continuación, añade 100 microlitros del segundo tampón de lavado y centrifuga durante un minuto. Agregue otra porción del segundo tampón de lavado a la columna y centrifugue durante dos minutos a 16, 000 veces G. Transfiera la columna de purificación a otro tubo de microcentrífuga y cargue 11 microlitros de tampón de elución en la membrana de la columna.Incubar la columna durante un minuto a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante un minuto a 1.000 veces G, y luego durante otro minuto a 16.000 veces G.Verifique la calidad y cantidad del ARN eluido y luego almacene la muestra en menos 80 grados Celsius. Con un kit de amplificación, amplifique 100 picogramos de ARN de alta calidad.Evalúe el rango de tamaño del ARNa amplificado con cuantificación basada en fluorescencia. A continuación, determine la concentración de ARNa por espectrofotometría. Prepare dos microgramos del ARNa amplificado para el marcaje fluorescente con un kit estándar.Instale una caja de ozono en un cuarto oscuro y espere hasta que el nivel de ozono disminuya a 0,001 partes por millón. Coloque un filtro de cuarto oscuro sobre la luz. Luego, lleve la muestra a la caja de ozono y agregue dos microlitros de tinte de cianina cinco y tampón de etiquetado.Con la muestra bajo una luz segura, agregue agua libre de RNasa para lograr un volumen total de 20 microlitros. Mezcle suavemente la muestra y luego incube el tubo en un termociclador a 85 grados Celsius durante 15 minutos. Enfríe la muestra en hielo durante un minuto y, a continuación, gire la muestra.Limpie el ARNa marcado y amplificado con un kit de extracción de ARN. Utilizando el tipo de espectrómetro adecuado, determine la concentración de ARNa amplificado y marcado. Prepare una segunda muestra de ARNa amplificado marcado con colorante de tres cianinas.Almacene las muestras de ARNa a 80 grados centígrados negativos durante un máximo de tres días. Combine 825 nanogramos de Cy3 y ARNa marcado con 5. A esto hay que añadir el búfer de bloqueo y el búfer de fragmentación.Incuba la mezcla a 60 grados centígrados durante 15 minutos y luego enfríe en hielo durante un minuto. Añadir 55 microlitros de tampón de hibridación, y mezclar bien sin introducir burbujas de aire. Centrifugar la mezcla a 11.300 veces G durante un minuto.Cargue 100 microlitros de muestra en el portaobjetos de la matriz y selle el portaobjetos en la cámara de hibridación. Hibridar la muestra durante 17 horas a 65 grados centígrados mientras gira a 10 rotaciones por minuto. Prepare una solución estabilizadora y secante que elimine la capa de ozono.Lave los conjuntos, tomando precauciones para minimizar la exposición al ozono, y luego sumérjalos en la solución estabilizadora y secadora durante 30 segundos. Asegúrese de que la superficie de la matriz esté seca y libre de polvo. Almacene las matrices en un lugar oscuro.Encienda el escáner de microarrays y espere hasta que esté listo para escanear. A continuación, cargue la matriz con el código de barras a la izquierda. Realice un análisis puntual y guarde los datos como un archivo GPR.En el software de análisis estadístico, normalice y analice los datos. Calcule el umbral de selección de punto positivo y vea el gráfico de las señales hibridadas y de fondo. Realice una normalización de Loess dentro de la matriz y, a continuación, una normalización de cuantil entre matrices.Exporte los datos normalizados a un archivo de hoja de cálculo. Utilice todas las señales positivas en un repositorio de datos de microarrays para crear una lista de identificación de genes únicos seleccionados. Cargue la lista de ID en una base de datos de clasificación y análisis de proteínas, eligiendo bos taurus como organismo, y realice una prueba de sobrerrepresentación estadística predeterminada.Después de una amplificación de dos rondas, los fragmentos son muy similares en tamaño y de buena calidad. La amplificación exitosa por este método debería producir al menos un aumento de mil veces del ARNa. Una imagen de microarray de alta calidad tiene una alta intensidad de punto y una baja intensidad de fondo en ambos canales.Si la intensidad del fondo es demasiado alta, la resolución de la señal será pobre. Alrededor del 46% de las manchas estaban por encima del fondo, de las cuales se aislaron 6.765 transcripciones únicas de ARN expresadas en el blastocisto. Una prueba de sobrerrepresentación estadística indicó que los 10 términos principales de la ontología genética representaban procesos activos de división celular.El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores en el área de la reproducción animal explorar la expresión génica embrionaria y evaluar cómo diversos factores afectan al embrión en desarrollo. Esta técnica también se ha desarrollado en otras especies importantes, como el cerdo. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la PCR cuantitativa, para validar los resultados de los microarrays.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer ARN de embriones, así como cómo amplificar y etiquetar ARN para realizar análisis de micromatrices de dos colores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.

Expresión de proteínas fluorescentes en Lanceolatum Branchiostoma Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

Reportamos la electroporación del ARN mensajero (ARNm) como un método que permite la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en el sistema modelo de embriones de codorniz. Este método se puede utilizar para etiquetar fluorescentes las células y registrar sus movimientos in vivo mediante microscopía de lapso de tiempo poco después de la electroporación.

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.

Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Aprende a analizar el transcriptoma de embriones bovinos preimplantacionales mediante microarrays de dos colores con bajas cantidades de ARN total. Este método optimizado permite evaluar la calidad embrionaria y mejorar las tecnologías reproductivas en ganado lechero.

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores (Video) | JoVE Journal

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

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