Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

El objetivo general de este video es proporcionar un procedimiento técnico optimizado utilizando una matriz bovina de dos colores hecha a medida utilizando una baja cantidad de ARN total de embriones bovinos del séptimo día. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la pérdida embrionaria en vacas lecheras de alta producción y preguntas sobre la calidad embrionaria en relación con la expresión génica en el embrión en desarrollo antes de la implantación. La ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la expresión génica utilizando el nivel de picogramos del ARN total extraído de embriones individuales.

Este método puede proporcionar información sobre el factor que afecta a la supervivencia de los embriones bovinos producidos in vivo antes de la implantación. Esto también puede ayudar a mejorar las tecnologías reproductivas, como la producción de embriones in vitro. Para comenzar el procedimiento, prepare embriones bovinos congelados en un tubo de microcentrífuga a partir de un kit de extracción de ARN a escala pico basado en columna.

Agregue 10 microlitros de tampón de lisis al tubo e incube los embriones a 42 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante dos minutos a 800 veces G.Pipetear 250 microlitros de tampón acondicionador en la membrana del filtro de la columna de purificación e incubar la columna durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el tubo colector a 16.000 veces G durante un minuto para terminar de preacondicionar la columna.

Añadir 10 microlitros de etanol al 70% a la mezcla de tampón de lisis y embriones y mezclar bien. A continuación, cargue la mezcla en la columna de purificación. Centrifugar la columna durante dos minutos a 100 veces G y luego a 16.000 veces G durante 30 segundos.

Agregue 100 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante un minuto. Usando un kit de DNasa, mezcle cinco microlitros de solución madre con 35 microlitros de tampón y mezcle invirtiendo suavemente el tubo cerrado. A continuación, cargue la mezcla de DNasa en la membrana de la columna de purificación e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Agregue 40 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante 15 segundos. A continuación, añade 100 microlitros del segundo tampón de lavado y centrifuga durante un minuto. Agregue otra porción del segundo tampón de lavado a la columna y centrifugue durante dos minutos a 16, 000 veces G. Transfiera la columna de purificación a otro tubo de microcentrífuga y cargue 11 microlitros de tampón de elución en la membrana de la columna.

Incubar la columna durante un minuto a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante un minuto a 1.000 veces G, y luego durante otro minuto a 16.000 veces G.Verifique la calidad y cantidad del ARN eluido y luego almacene la muestra en menos 80 grados Celsius. Con un kit de amplificación, amplifique 100 picogramos de ARN de alta calidad.

Evalúe el rango de tamaño del ARNa amplificado con cuantificación basada en fluorescencia. A continuación, determine la concentración de ARNa por espectrofotometría. Prepare dos microgramos del ARNa amplificado para el marcaje fluorescente con un kit estándar.

Instale una caja de ozono en un cuarto oscuro y espere hasta que el nivel de ozono disminuya a 0,001 partes por millón. Coloque un filtro de cuarto oscuro sobre la luz. Luego, lleve la muestra a la caja de ozono y agregue dos microlitros de tinte de cianina cinco y tampón de etiquetado.

Con la muestra bajo una luz segura, agregue agua libre de RNasa para lograr un volumen total de 20 microlitros. Mezcle suavemente la muestra y luego incube el tubo en un termociclador a 85 grados Celsius durante 15 minutos. Enfríe la muestra en hielo durante un minuto y, a continuación, gire la muestra.

Limpie el ARNa marcado y amplificado con un kit de extracción de ARN. Utilizando el tipo de espectrómetro adecuado, determine la concentración de ARNa amplificado y marcado. Prepare una segunda muestra de ARNa amplificado marcado con colorante de tres cianinas.

Almacene las muestras de ARNa a 80 grados centígrados negativos durante un máximo de tres días. Combine 825 nanogramos de Cy3 y ARNa marcado con 5. A esto hay que añadir el búfer de bloqueo y el búfer de fragmentación.

Incuba la mezcla a 60 grados centígrados durante 15 minutos y luego enfríe en hielo durante un minuto. Añadir 55 microlitros de tampón de hibridación, y mezclar bien sin introducir burbujas de aire. Centrifugar la mezcla a 11.300 veces G durante un minuto.

Cargue 100 microlitros de muestra en el portaobjetos de la matriz y selle el portaobjetos en la cámara de hibridación. Hibridar la muestra durante 17 horas a 65 grados centígrados mientras gira a 10 rotaciones por minuto. Prepare una solución estabilizadora y secante que elimine la capa de ozono.

Lave los conjuntos, tomando precauciones para minimizar la exposición al ozono, y luego sumérjalos en la solución estabilizadora y secadora durante 30 segundos. Asegúrese de que la superficie de la matriz esté seca y libre de polvo. Almacene las matrices en un lugar oscuro.

Encienda el escáner de microarrays y espere hasta que esté listo para escanear. A continuación, cargue la matriz con el código de barras a la izquierda. Realice un análisis puntual y guarde los datos como un archivo GPR.

En el software de análisis estadístico, normalice y analice los datos. Calcule el umbral de selección de punto positivo y vea el gráfico de las señales hibridadas y de fondo. Realice una normalización de Loess dentro de la matriz y, a continuación, una normalización de cuantil entre matrices.

Exporte los datos normalizados a un archivo de hoja de cálculo. Utilice todas las señales positivas en un repositorio de datos de microarrays para crear una lista de identificación de genes únicos seleccionados. Cargue la lista de ID en una base de datos de clasificación y análisis de proteínas, eligiendo bos taurus como organismo, y realice una prueba de sobrerrepresentación estadística predeterminada.

Después de una amplificación de dos rondas, los fragmentos son muy similares en tamaño y de buena calidad. La amplificación exitosa por este método debería producir al menos un aumento de mil veces del ARNa. Una imagen de microarray de alta calidad tiene una alta intensidad de punto y una baja intensidad de fondo en ambos canales.

Si la intensidad del fondo es demasiado alta, la resolución de la señal será pobre. Alrededor del 46% de las manchas estaban por encima del fondo, de las cuales se aislaron 6.765 transcripciones únicas de ARN expresadas en el blastocisto. Una prueba de sobrerrepresentación estadística indicó que los 10 términos principales de la ontología genética representaban procesos activos de división celular.

El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores en el área de la reproducción animal explorar la expresión génica embrionaria y evaluar cómo diversos factores afectan al embrión en desarrollo. Esta técnica también se ha desarrollado en otras especies importantes, como el cerdo. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la PCR cuantitativa, para validar los resultados de los microarrays.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer ARN de embriones, así como cómo amplificar y etiquetar ARN para realizar análisis de micromatrices de dos colores.