Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores
30 de enero de 2017
La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.
El objetivo general de este video es proporcionar un procedimiento técnico optimizado utilizando una matriz bovina de dos colores hecha a medida utilizando una baja cantidad de ARN total de embriones bovinos del séptimo día. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la pérdida embrionaria en vacas lecheras de alta producción y preguntas sobre la calidad embrionaria en relación con la expresión génica en el embrión en desarrollo antes de la implantación. La ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la expresión génica utilizando el nivel de picogramos del ARN total extraído de embriones individuales.
Este método puede proporcionar información sobre el factor que afecta a la supervivencia de los embriones bovinos producidos in vivo antes de la implantación. Esto también puede ayudar a mejorar las tecnologías reproductivas, como la producción de embriones in vitro. Para comenzar el procedimiento, prepare embriones bovinos congelados en un tubo de microcentrífuga a partir de un kit de extracción de ARN a escala pico basado en columna.
Agregue 10 microlitros de tampón de lisis al tubo e incube los embriones a 42 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante dos minutos a 800 veces G.Pipetear 250 microlitros de tampón acondicionador en la membrana del filtro de la columna de purificación e incubar la columna durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el tubo colector a 16.000 veces G durante un minuto para terminar de preacondicionar la columna.
Añadir 10 microlitros de etanol al 70% a la mezcla de tampón de lisis y embriones y mezclar bien. A continuación, cargue la mezcla en la columna de purificación. Centrifugar la columna durante dos minutos a 100 veces G y luego a 16.000 veces G durante 30 segundos.
Agregue 100 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante un minuto. Usando un kit de DNasa, mezcle cinco microlitros de solución madre con 35 microlitros de tampón y mezcle invirtiendo suavemente el tubo cerrado. A continuación, cargue la mezcla de DNasa en la membrana de la columna de purificación e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Agregue 40 microlitros del primer tampón de lavado a la columna y centrifugue a 8.000 veces G durante 15 segundos. A continuación, añade 100 microlitros del segundo tampón de lavado y centrifuga durante un minuto. Agregue otra porción del segundo tampón de lavado a la columna y centrifugue durante dos minutos a 16, 000 veces G. Transfiera la columna de purificación a otro tubo de microcentrífuga y cargue 11 microlitros de tampón de elución en la membrana de la columna.
Incubar la columna durante un minuto a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante un minuto a 1.000 veces G, y luego durante otro minuto a 16.000 veces G.Verifique la calidad y cantidad del ARN eluido y luego almacene la muestra en menos 80 grados Celsius. Con un kit de amplificación, amplifique 100 picogramos de ARN de alta calidad.
Evalúe el rango de tamaño del ARNa amplificado con cuantificación basada en fluorescencia. A continuación, determine la concentración de ARNa por espectrofotometría. Prepare dos microgramos del ARNa amplificado para el marcaje fluorescente con un kit estándar.
Instale una caja de ozono en un cuarto oscuro y espere hasta que el nivel de ozono disminuya a 0,001 partes por millón. Coloque un filtro de cuarto oscuro sobre la luz. Luego, lleve la muestra a la caja de ozono y agregue dos microlitros de tinte de cianina cinco y tampón de etiquetado.
Con la muestra bajo una luz segura, agregue agua libre de RNasa para lograr un volumen total de 20 microlitros. Mezcle suavemente la muestra y luego incube el tubo en un termociclador a 85 grados Celsius durante 15 minutos. Enfríe la muestra en hielo durante un minuto y, a continuación, gire la muestra.
Limpie el ARNa marcado y amplificado con un kit de extracción de ARN. Utilizando el tipo de espectrómetro adecuado, determine la concentración de ARNa amplificado y marcado. Prepare una segunda muestra de ARNa amplificado marcado con colorante de tres cianinas.
Almacene las muestras de ARNa a 80 grados centígrados negativos durante un máximo de tres días. Combine 825 nanogramos de Cy3 y ARNa marcado con 5. A esto hay que añadir el búfer de bloqueo y el búfer de fragmentación.
Incuba la mezcla a 60 grados centígrados durante 15 minutos y luego enfríe en hielo durante un minuto. Añadir 55 microlitros de tampón de hibridación, y mezclar bien sin introducir burbujas de aire. Centrifugar la mezcla a 11.300 veces G durante un minuto.
Cargue 100 microlitros de muestra en el portaobjetos de la matriz y selle el portaobjetos en la cámara de hibridación. Hibridar la muestra durante 17 horas a 65 grados centígrados mientras gira a 10 rotaciones por minuto. Prepare una solución estabilizadora y secante que elimine la capa de ozono.
Lave los conjuntos, tomando precauciones para minimizar la exposición al ozono, y luego sumérjalos en la solución estabilizadora y secadora durante 30 segundos. Asegúrese de que la superficie de la matriz esté seca y libre de polvo. Almacene las matrices en un lugar oscuro.
Encienda el escáner de microarrays y espere hasta que esté listo para escanear. A continuación, cargue la matriz con el código de barras a la izquierda. Realice un análisis puntual y guarde los datos como un archivo GPR.
En el software de análisis estadístico, normalice y analice los datos. Calcule el umbral de selección de punto positivo y vea el gráfico de las señales hibridadas y de fondo. Realice una normalización de Loess dentro de la matriz y, a continuación, una normalización de cuantil entre matrices.
Exporte los datos normalizados a un archivo de hoja de cálculo. Utilice todas las señales positivas en un repositorio de datos de microarrays para crear una lista de identificación de genes únicos seleccionados. Cargue la lista de ID en una base de datos de clasificación y análisis de proteínas, eligiendo bos taurus como organismo, y realice una prueba de sobrerrepresentación estadística predeterminada.
Después de una amplificación de dos rondas, los fragmentos son muy similares en tamaño y de buena calidad. La amplificación exitosa por este método debería producir al menos un aumento de mil veces del ARNa. Una imagen de microarray de alta calidad tiene una alta intensidad de punto y una baja intensidad de fondo en ambos canales.
Si la intensidad del fondo es demasiado alta, la resolución de la señal será pobre. Alrededor del 46% de las manchas estaban por encima del fondo, de las cuales se aislaron 6.765 transcripciones únicas de ARN expresadas en el blastocisto. Una prueba de sobrerrepresentación estadística indicó que los 10 términos principales de la ontología genética representaban procesos activos de división celular.
El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores en el área de la reproducción animal explorar la expresión génica embrionaria y evaluar cómo diversos factores afectan al embrión en desarrollo. Esta técnica también se ha desarrollado en otras especies importantes, como el cerdo. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la PCR cuantitativa, para validar los resultados de los microarrays.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer ARN de embriones, así como cómo amplificar y etiquetar ARN para realizar análisis de micromatrices de dos colores.
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Descripción general
Este protocolo describe un procedimiento técnico optimizado que utiliza una matriz bovina personalizada de dos colores para analizar la expresión génica en embriones bovinos del día siete. El método permite el uso de pequeñas cantidades de ARN total, proporcionando información sobre la calidad embrionaria y los factores que afectan la supervivencia del embrión.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Embriología
- Expresión génica
Antecedentes
- La tecnología de microarreglos permite el perfilado de la expresión génica a nivel del genoma completo.
- Comprender la pérdida embrionaria en vacas lecheras es fundamental para mejorar las tecnologías reproductivas.
- Los métodos con baja cantidad de ARN de entrada pueden mejorar los estudios en embriones individuales.
- El análisis de la expresión génica puede orientar las prácticas en la producción in vitro de embriones.
Objetivo del estudio
- Demostrar la viabilidad de utilizar pequeñas cantidades de ARN total de embriones bovinos.
- Investigar la expresión génica relacionada con la calidad embrionaria antes de la implantación.
- Proporcionar información sobre los factores que afectan la supervivencia de los embriones bovinos en etapa preimplantacional.
Métodos Utilizados
- Preparación de embriones bovinos congelados rápidamente.
- Uso de un kit de extracción de ARN a escala pico basado en columnas.
- Implementación de un arreglo bovino personalizado de dos colores.
- Medición cuantitativa de la expresión génica a niveles de ARN en picogramos.
Resultados principales
- Perfilado exitoso de la expresión génica utilizando ARN mínimo.
- Información sobre la calidad embrionaria y los factores que influyen en la supervivencia.
- Mejoras potenciales en las tecnologías reproductivas.
- Demuestra la viabilidad del método para estudios futuros.
Conclusiones
- El protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar la expresión génica en embriones bovinos.
- Los métodos con baja cantidad de ARN pueden facilitar la investigación sobre el desarrollo embrionario.
- Este enfoque podría conducir a avances en las prácticas reproductivas en la ganadería lechera.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el perfilado de la expresión génica a nivel del genoma a partir de ARN de nivel picogramo extraído de embriones bovinos individuales, abordando un cuello de botella crítico en la investigación de biología reproductiva. Al proporcionar datos transcriptómicos cuantitativos de embriones preimplantacionales producidos in vivo, el método apoya la reducción mecanicista de factores de pérdida embrionaria en ganado lechero de alto rendimiento. El enfoque ofrece valor traslacional para la validación de dianas en terapias reproductivas y confianza predictiva en los procesos de evaluación de la calidad embrionaria.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de las redes transcripcionales que regulan la supervivencia y calidad embrionaria antes de la implantación.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de objetivos al vincular los patrones de expresión génica con resultados fenotípicos en el desarrollo embrionario.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la identificación de firmas moleculares asociadas a embriones viables frente a no viables.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera perfiles transcriptómicos estandarizados y reproducibles adecuados para el descubrimiento de biomarcadores y la estandarización de ensayos.
- Escalabilidad: El diseño de microarreglos de dos colores aumenta la replicación técnica y minimiza la variabilidad, permitiendo comparaciones robustas entre muestras.
- Utilidad de la plataforma: Crea una base reutilizable para la validación posterior mediante qPCR o cribado funcional de genes candidatos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Proporciona un sistema modelo bovino con paralelismos en el desarrollo respecto a la embriogénesis humana preimplantacional para estudios mecanicistas.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de expresión génica en fase de descubrimiento con la evaluación preclínica de factores que afectan la supervivencia embrionaria.
- Avance ajustado al riesgo: Permite tomar decisiones basadas en datos sobre intervenciones con tecnologías reproductivas a partir de los perfiles de expresión de vías de desarrollo clave.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la identificación de dianas guiada por hipótesis y la validación mecanicista antes de avanzar hacia ensayos funcionales o estudios de validación in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante el aislamiento de transcritos diferencialmente expresados asociados con la calidad y supervivencia del embrión.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos de expresión normalizados que permiten comparaciones fiables de las condiciones genéticas o ambientales sobre el desarrollo embrionario.
- Análisis: Utiliza normalización por regresión Loess y cuantílica junto con pruebas estadísticas de sobrerepresentación para obtener conclusiones funcionales accionables a partir de datos de microarrays mediante ontología génica.
- Investigación Traducional: Se alinea con los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores al identificar procesos conservados, como la división celular activa, como términos funcionales principales en embriones en estadio de blastocisto.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado de ARN-a-datos aplicable a especies ganaderas y adaptable a otros modelos de embriones de mamíferos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la pérdida embrionaria al proporcionar datos de expresión a escala del genoma procedentes de etapas de desarrollo clínicamente relevantes.
- Valor operativo: Permite la detección de alta sensibilidad a partir de cantidades mínimas de ARN, estandarizando protocolos con bajo aporte de material para muestras biológicas valiosas o limitadas.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones sobre continuidad o interrupción en el desarrollo de tecnologías reproductivas al vincular perfiles moleculares con resultados de viabilidad embrionaria.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas o intervenciones basándose en el enriquecimiento de redes génicas funcionalmente coherentes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN, amplificación enzimática y técnicas de etiquetado fluorescente para prevenir la degradación de la muestra.
- Depende del acceso a escáneres de microarreglos, cámaras de hibridación y ambientes controlados para el ozono para mantener la integridad de la señal.
- Necesita la estandarización entre equipos de métricas de calidad del ARN, eficiencia de etiquetado y condiciones de hibridación para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir el protocolo a diferentes estadios embrionarios, especies o tipos de muestras con rendimientos variables de ARN.
- Las limitaciones prácticas incluyen el requisito de entrada de ARN amplificado y el posible sesgo introducido durante los pasos de amplificación en dos rondas.
