Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis en respuesta a factores experimentales. La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico en numerosas áreas de investigación, incluida la lesión de la médula espinal, la hipoxia neonatal y las enfermedades desmielinizantes como la mielitis transversa y la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que combina un protocolo para el aislamiento de un gran número de OPCs con un método rápido y fiable para determinar la oligodendrogénesis en múltiples condiciones experimentales simultáneamente.

Para comenzar este procedimiento, esterilice todo el equipo de disección con un esterilizador de perlas calentado. Luego, agregue de 15 a 20 mililitros de PBS a un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque el tubo cónico en hielo y úselo para sostener el tejido de la corteza cortado en cubitos durante la disección.

A continuación, agregue PBS frío a una placa de Petri de 10 centímetros que se utilizará para la disección bajo el microscopio óptico. Después de sacrificar a las crías de rata, corta la piel detrás de las orejas a lo largo de la línea media con unas tijeras pequeñas. Y pelar los colgajos de la piel hacia atrás.

A continuación, corta el cráneo a lo largo de la línea media desde el tronco encefálico hasta los ojos. Y tenga cuidado de no cortar demasiado profundo para preservar la estructura de la corteza subyacente. Después de eso, haga dos cortes laterales inferiores al cerebelo insertando pequeñas tijeras quirúrgicas en el foramen magnum.

Haz un corte adicional entre los ojos anterior a los bulbos olfatorios. Pela con cuidado cada mitad del cráneo. Retire todo el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros llena de PBS frío.

Bajo un microscopio óptico de disección, extraiga los bulbos olfativos y el cerebelo con pinzas quirúrgicas finas. Voltea el cerebro para que la superficie ventral sea visible. Luego, usando pinzas rectas finas, realice una disección roma colocando las puntas de las pinzas cerradas entre la corteza y el hipotálamo a una profundidad de aproximadamente dos tercios del cerebro.

Abra las pinzas una vez que estén en su lugar, luego repita el procedimiento para el otro hemisferio. Después de eso, saca la corteza de las regiones del hipotálamo y el mesencéfalo. Extirpa el hipotálamo, el tálamo y el mesencéfalo sosteniendo el mesencéfalo en su superficie posterior y pelándolo hacia el extremo anterior del encéfalo.

Posteriormente, corte las conexiones anteriores. Con pinzas de disección dobladas finas, extirpa el hipocampo y corta su conexión con la corteza. Luego, retira el cuerpo estriado restante raspándolo de la corteza subyacente con un movimiento diagonal hacia afuera.

Limpiar los vasos sanguíneos y las meninges de la superficie ventral de la corteza. A continuación, voltea el cerebro para que la superficie dorsal sea visible. Pela las meninges de la corteza subyacente donde se encuentra el bulbo olfatorio.

Repita los procedimientos para un total de tres a cuatro cachorros de rata. Y coloque todas las cortezas disecadas en una placa de Petri. Córtalos con una cuchilla de afeitar esterilizada hasta lograr trozos de milímetro por milímetro.

A continuación, recoge los pañuelos enjuagando el plato con PBS antes de volver a colocarlo en hielo. Ahora, usando una pipeta Pasteur de vidrio conectada a un controlador de pipeta, disocie mecánicamente el tejido pipeteando de diez a quince veces o hasta que las piezas de tejido se reduzcan de tamaño y la solución se haya vuelto turbia. A continuación, devuelva la muestra a la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante 15 minutos con rotación continua.

Después de eso, agregue 10 mililitros de PBS a cada muestra y filtre el homogeneizado a través de un filtro de poros de 40 micrómetros colocado sobre un tubo de 50 mililitros. Luego, enjuague el filtro con uno o dos mililitros adicionales de PBS. Agrupe todas las muestras homogeneizadas en un tubo cónico de 50 mililitros y obtenga un recuento total de células.

Después de realizar el recuento de células, divida el homogeneizado uniformemente en los tubos cónicos de 15 mililitros y centrifugue durante 10 a 12 minutos a 300 gs. Prepare cada columna LS agregando cinco mililitros de búfer de columna. Y recoger el caudal a través de un tubo cónico de 15 mililitros.

Una vez que el tampón de la columna haya pasado completamente a través de la cámara superior, aplique 1000 microlitros de la suspensión celular a cada columna y permita que las celdas pasen por gravedad. A continuación, retire cada columna y colóquela en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón de columna y sumerja el tampón a través de la columna a una velocidad rápida para desalojar las celdas unidas y liberarlas de la columna.

Para colocar las células en un recubrimiento, dilúyalas con medios de proliferación OPC a 60.000 células por mililitro. Pipetee 500 microlitros de células a lo largo del costado de cada pocillo negro y transparente de fondo de una placa de 24 pocillos. Mezcle las celdas agitando el plato horizontalmente, usando un movimiento en forma de ocho.

En este procedimiento, coloque una punta de pipeta de 200 microlitros sobre una pipeta Pasteur de vidrio para asegurarse de que el pocillo no se dañe durante la aspiración. A continuación, aspire los medios de los pocillos de cultivo, un grupo de tratamiento a la vez, para evitar que las células se sequen. Después de eso, agregue lentamente 500 microlitros de mezcla maestra de tratamiento a lo largo del costado del pozo con una pipeta de un mililitro.

Incubar los cultivos y realizar un intercambio completo de medios con medios de tratamiento nuevos cada dos o tres días. Al final del período de tratamiento deseado, aspire el medio. Agregue lentamente 400 microlitros de PFA al costado del pocillo para fijar las celdas.

E incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, aspire PFA y agregue lentamente 500 microlitros de D-PBS estéril para lavar las células. Repita el lavado dos veces más y no aspire el lavado final.

Ahora, lleve la placa a temperatura ambiente, aspire los pocillos y agregue 250 microlitros de D-PBS que contienen cinco por ciento de NGS y 0.1 por ciento de Triton x-100. Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora con una suave agitación orbital. Prepare la solución de incubación primaria diluyendo el anticuerpo monoclonal anti MBP de ratón y el anticuerpo policlonal anti olig2 de conejo en D-PBS que contenga un cinco por ciento de NGS.

Luego, incube los anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche durante 16 a 18 horas con una suave agitación orbital. Mientras lava la placa, prepare la solución de incubación secundaria diluyendo los anticuerpos anti ratón 680 y anti conejo 800 en D-PBS que contenga un cinco por ciento de NGS. A continuación, aspire el lavado final y agregue 250 microlitros de solución de incubación secundaria.

Proteja la placa de la luz e incubela a temperatura ambiente durante una hora con una suave agitación orbital. Después de eso, escanee la placa utilizando un sistema de imágenes capaz de detectar emisiones de fluorescencia de 700 nanómetros y 800 nanómetros. Como punto de partida, establezca el desplazamiento focal en tres y las sensibilidades en un punto cinco para MBP, cinco punto cero para la actina y tres punto cinco para olig2.

Ajuste los valores de sensibilidad según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal. En este esquema, el ensayo DIFS comienza con OPC de rata A2B5 positivas recién aisladas y sembradas en recipientes de cultivo codificados con PLL. Estos cultivos se proliferan durante tres días en presencia de 20 nanogramos por mililitro de PDGFAA, y luego se tratan con factores experimentales en medios frescos libres de PDGF en el día cero.

Los medios de tratamiento se reponen por completo el segundo día. Y las células se fijan con un 4 por ciento de paraformaldehído en el cuarto día. Aquí, la inmunocitoquímica para olig2 y MBP se realizó en los cultivos representativos en el día cero y el día cuatro utilizando Dapi como contratinción nuclear.

Estos cultivos exhiben tinción constitutiva para el marcador celular del linaje de oligodendrocitos pan, Olig2, en los días cero y cuatro. Mientras que la tinción para el marcador de oligodendrocitos maduros MBP solo fue evidente al cuarto día. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar, cultivar y diferenciar OPC de rata A2B5 positivas para cuantificar el efecto de los factores experimentales en la oligodendrogénesis.

La identificación de los factores que promueven la oligodenrogénesis es de particular relevancia para el estudio de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple. Una vez dominadas, las técnicas descritas aquí pueden ayudar a identificar dichos factores y, en última instancia, a desarrollar mejores terapias.