Name: Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis in vitro mediante análisis de fluorescencia infrarroja. Este método permite evaluar factores experimentales en neurociencia.

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<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante varias se...

conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural 1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico 2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante población de los OPC que están dispersos en toda la sustancia gris y blanco que comprende aproximadamente el 5-8% de todas las células 3. Luego de una lesión desmielinizante, los OPC migran al sitio de la lesión, proliferan y se diferencian para sustituir a las vainas de mielina perdidos o dañados en los axones expuestos. Sin embargo, en algunos lugares la enfermedad / lesión, este proceso se encuentra para ser ineficaz o puede fallar por completo 4. Mientrasdesmielinización crónica se cree que añadir a la carga de morbilidad, la remielinización oligodendrogenesis y eficiente puede aliviar los síntomas 5. Por ello, ha sido de interés para estudiar los OPC in vitro para determinar el efecto de los factores experimentales sobre oligodendrogenesis. La comprensión de las diferentes fases de la diferenciación de oligodendrocitos ha sido posible gracias a la identificación de marcadores específicos de células de la etapa. Auto-renovación de células progenitoras tempranas se definen por su expresión de alfa derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento (PDGFR), el antígeno neuronal / glía 2 (NG2) y A2B5 6 - 8. Como OPCs inician su programa de diferenciación y se retiran del ciclo celular, que regulan negativamente la expresión de estos marcadores y comienzan a expresar proteínas indicativas de premielinizantes oligodendrocitos incluyendo cíclico de nucleótidos 3&#39;-fosfodiesterasa (CNPase) y O4. Por último, su diferenciación en oligodendroc más maduroytes se caracteriza por la expresión de proteínas asociados a la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), proteína proteolipídica (PLP), y la proteína básica de la mielina (MBP). MBP es una proteína de membrana periférica intracelular y un componente principal de la vaina de mielina. Los ratones que carecen MBP desarrollan un fenotipo grave en el que la mielinización del SNC está disminuida significativamente dando lugar a temblores, convulsiones y muerte temprana 9,10. Este importante papel de la MBP en la mielinización ha llevado a su uso como un marcador de la diferenciación de oligodendrocitos in vitro e in vivo 11. La cuantificación de MBP se puede lograr usando varias metodologías diferentes. RT-PCR y análisis de transferencia Western permiten la cuantificación de los niveles de MBP bajo diferentes regímenes de tratamiento. La inmunocitoquímica es un enfoque cualitativo común que también puede ser cuantitativa cuando se usan enfoques de microscopía basados ​​en cámaras. Aunque estos sistemas son fiables y fundamental parael estudio de la diferenciación de oligodendrocitos, cada uno de ellos tiene sus propias desventajas que limitan su uso en la detección de drogas. En primer lugar, la cantidad de OPCs principales que se necesitan para RT-PCR y análisis de transferencia Western reduce el número de variables que se pueden examinar simultáneamente. Mientras que el requisito para inmunocitoquímica de células es mucho más bajo, un tiempo considerable se debe dedicar a cada experimento si la cuantificación es la meta. Numerosas imágenes deben ser capturados y luego cuantificados para facilitar el análisis experimental. Estas advertencias se convierten en obstáculos importantes a tener en cuenta para los estudios que requieren una evaluación de alto rendimiento. Aquí se describe un método que utiliza aspectos fundamentales tanto de la inmunocitoquímica y metodologías de Western blot para la cuantificación de la mielina, mientras que reduce significativamente tanto el número de células requeridas y el tiempo para completar el análisis cuantitativo.

<table><tbody><tr><td><Materiales > disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Placas de Petri de Poliestireno</td><td></td><td></td> Microscopio de disección de luz Fisherbrand 0857512 <td></td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Disociación Materiales</fuerte></td>Rotador de tubo Miltenyi Biotec 130-090-753 Rotador de tubo de disociación Kit de disociación de tejido neural (P)Miltenyi Biotec 130-092-628 Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>disociación enzimática</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de celdas</td><td>Corning</td><td>352340<</td><td></td></tr><tr><td>fuerte>A2B5 Purificación de columnas&nbsp; Microperlas </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td> Columnas LS de <td>anticuerpos A2B5 unidas a perlas</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Columnas de selección magnética</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV 1x</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Materiales de cultivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triyodotironina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Sal de fumarato de clemastina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Sal de hemifumarato de quetiapina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505 16</td><td>&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Selenito de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Oligoelementos B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td> Life <td>Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Visiplate negro de 24 pocillos con tapa</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Grado de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td><fuerte>Inmunocitoquímica y cuantificación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>monoclonal de ratón anti-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1.000 Dilución</td></tr> conejo <tr><td>policlonal anti-Actina</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Dilución</td></tr><tr><td>conejo policlonal anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610 1</td><td>:1.000 Dilución</td></tr><tr><td>cabra anti-ratón 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Dilución</td></tr><tr><td>cabra anti-conejo 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Prolong Gold antidecoloración con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Sistema de Imagen por Infrarrojos</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de oligodendrogenesis uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico de una serie de áreas de investigación, como la lesión de la médula espinal, la hipoxia neonatal y las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple y la mielitis transversa. La mielinización es necesaria no solo para facilitar la rápida propagación de los impulsos dentro del sistema nervioso central, sino también para proporcionar soporte trófico a los axones subyacentes. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) se pueden estudiar in vitro para ayudar a identificar factores que pueden promover o inhibir la diferenciación de oligodendrocitos. Hasta la fecha, muchos de los métodos disponibles para evaluar este proceso han requerido un gran número de células, lo que limita el número de condiciones que se pueden investigar en un momento dado, o métodos de cuantificación intensivos en mano de obra. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de un gran número de OPCs de alta pureza junto con un método rápido y fiable para determinar la oligodendrogénesis a partir de múltiples condiciones simultáneamente. Las OPC se aíslan de cortezas de ratas neonatales P5-P7 y se cultivan in vitro durante tres días antes de la diferenciación. Cuatro días después de la diferenciación, la oligodendrogénesis se evalúa mediante un ensayo de fluorescencia infrarroja dual para determinar la expresión de la proteína mielina.

OPC A2B5-positivas se aislaron mediante selección celular positiva utilizando un sistema de separación magnética de columna. Antes del procedimiento de aislamiento, todo el cerebro se elimina de crías de rata que se encuentran entre P5 y P7. Una vez que todo el cerebro se separa con éxito desde el cráneo, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas finas (Figura 1A). Con el fin de aislar el tejido cortical cerebral el hipotálamo, tála...

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis en respuesta a factores experimentales. La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico en numerosas áreas de investigación, incluyendo lesión de la médula espinal, hipoxia neonatal y enfermedades desmielinizantes como la mielitis transversa y la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que combina un protocolo para el aislamiento de grandes cantidades de COPs con un método rápido y confiable para determinar la oligodendrogénesis en múltiples condiciones experimentales simultáneamente.Para comenzar este procedimiento, esterilice todo el equipo de disección utilizando un esterilizador de perlas calentado. Luego, agregue de 15 a 20 mililitros de PBS a un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque el tubo cónico en hielo y úselo para mantener el tejido cortical picado durante la disección.A continuación, agregue PBS frío a una placa de Petri de 10 centímetros que se utilizará para la disección bajo el microscopio óptico. Después de sacrificar las crías de rata, corte la piel detrás de las orejas a lo largo de la l

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales...

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Este video muestra el procedimiento para aislar neuronas ganglionares de la retina (RGNs) de la retina de una rata y cocultivarlas con células de glía de envoltura olfativa (OEG). Este método permite estudiar el potencial neuro-regenerativo de los OEG después de una lesión neuronal.

Coculturación de neuronas ganglionares de la retina con glía de envoltura olfativa

El video muestra un protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en oligodendrocitos e inducir mielinización en un cocultivo con neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG). Las OPC se transducen con vectores lentivirales que codifican una proteína de señalización que regula la mielinización. Las OPC transducidas se cocultivan con neuronas DRG para evaluar la diferenciación en oligodendrocitos y la mielinización inducida por proteínas de señalización.

Ensayo de mielinización inducida por transducción in vitro para células precursoras de oligodendrocitos

Fuente: Schott, J. T., et al. Preparación de cultivos progenitores de oligodendrocitos de rata y cuantificación de la oligodendrogénesis mediante escaneo de fluorescencia infrarroja dual. J. Vis. Exp. (2016).  Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia dual para evaluar la diferenciación de oligodendrocitos de células precursoras (OPC) aisladas del cerebro de una cría de rata. El proceso incluye la fijación de las células, el marcaje de marcadores específicos con anticuerpos...

Imágenes de fluorescencia dual para identificar oligodendrocitos diferenciados

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones...

Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Aprende a aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis in vitro mediante análisis de fluorescencia infrarroja. Este método permite evaluar factores experimentales en neurociencia.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo (Video) | JoVE Journal

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

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