Name: Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis in vitro mediante análisis de fluorescencia infrarroja. Este método permite evaluar factores experimentales en neurociencia.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante varias se...

conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural 1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico 2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante población de los OPC que están dispersos en toda la sustancia gris y blanco que comprende aproximadamente el 5-8% de todas las células 3. Luego de una lesión desmielinizante, los OPC migran al sitio de la lesión, proliferan y se diferencian para sustituir a las vainas de mielina perdidos o dañados en los axones expuestos. Sin embargo, en algunos lugares la enfermedad / lesión, este proceso se encuentra para ser ineficaz o puede fallar por completo 4. Mientrasdesmielinización crónica se cree que añadir a la carga de morbilidad, la remielinización oligodendrogenesis y eficiente puede aliviar los síntomas 5. Por ello, ha sido de interés para estudiar los OPC in vitro para determinar el efecto de los factores experimentales sobre oligodendrogenesis. La comprensión de las diferentes fases de la diferenciación de oligodendrocitos ha sido posible gracias a la identificación de marcadores específicos de células de la etapa. Auto-renovación de células progenitoras tempranas se definen por su expresión de alfa derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento (PDGFR), el antígeno neuronal / glía 2 (NG2) y A2B5 6 - 8. Como OPCs inician su programa de diferenciación y se retiran del ciclo celular, que regulan negativamente la expresión de estos marcadores y comienzan a expresar proteínas indicativas de premielinizantes oligodendrocitos incluyendo cíclico de nucleótidos 3&#39;-fosfodiesterasa (CNPase) y O4. Por último, su diferenciación en oligodendroc más maduroytes se caracteriza por la expresión de proteínas asociados a la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), proteína proteolipídica (PLP), y la proteína básica de la mielina (MBP). MBP es una proteína de membrana periférica intracelular y un componente principal de la vaina de mielina. Los ratones que carecen MBP desarrollan un fenotipo grave en el que la mielinización del SNC está disminuida significativamente dando lugar a temblores, convulsiones y muerte temprana 9,10. Este importante papel de la MBP en la mielinización ha llevado a su uso como un marcador de la diferenciación de oligodendrocitos in vitro e in vivo 11. La cuantificación de MBP se puede lograr usando varias metodologías diferentes. RT-PCR y análisis de transferencia Western permiten la cuantificación de los niveles de MBP bajo diferentes regímenes de tratamiento. La inmunocitoquímica es un enfoque cualitativo común que también puede ser cuantitativa cuando se usan enfoques de microscopía basados ​​en cámaras. Aunque estos sistemas son fiables y fundamental parael estudio de la diferenciación de oligodendrocitos, cada uno de ellos tiene sus propias desventajas que limitan su uso en la detección de drogas. En primer lugar, la cantidad de OPCs principales que se necesitan para RT-PCR y análisis de transferencia Western reduce el número de variables que se pueden examinar simultáneamente. Mientras que el requisito para inmunocitoquímica de células es mucho más bajo, un tiempo considerable se debe dedicar a cada experimento si la cuantificación es la meta. Numerosas imágenes deben ser capturados y luego cuantificados para facilitar el análisis experimental. Estas advertencias se convierten en obstáculos importantes a tener en cuenta para los estudios que requieren una evaluación de alto rendimiento. Aquí se describe un método que utiliza aspectos fundamentales tanto de la inmunocitoquímica y metodologías de Western blot para la cuantificación de la mielina, mientras que reduce significativamente tanto el número de células requeridas y el tiempo para completar el análisis cuantitativo.

<table><tbody><tr><td><Materiales > disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Placas de Petri de Poliestireno</td><td></td><td></td> Microscopio de disección de luz Fisherbrand 0857512 <td></td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Disociación Materiales</fuerte></td>Rotador de tubo Miltenyi Biotec 130-090-753 Rotador de tubo de disociación Kit de disociación de tejido neural (P)Miltenyi Biotec 130-092-628 Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>disociación enzimática</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de celdas</td><td>Corning</td><td>352340<</td><td></td></tr><tr><td>fuerte>A2B5 Purificación de columnas&nbsp; Microperlas </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td> Columnas LS de <td>anticuerpos A2B5 unidas a perlas</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Columnas de selección magnética</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV 1x</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Materiales de cultivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triyodotironina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Sal de fumarato de clemastina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Sal de hemifumarato de quetiapina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505 16</td><td>&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Selenito de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Oligoelementos B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td> Life <td>Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Visiplate negro de 24 pocillos con tapa</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Grado de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td><fuerte>Inmunocitoquímica y cuantificación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>monoclonal de ratón anti-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1.000 Dilución</td></tr> conejo <tr><td>policlonal anti-Actina</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Dilución</td></tr><tr><td>conejo policlonal anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610 1</td><td>:1.000 Dilución</td></tr><tr><td>cabra anti-ratón 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Dilución</td></tr><tr><td>cabra anti-conejo 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Prolong Gold antidecoloración con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Sistema de Imagen por Infrarrojos</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de oligodendrogenesis uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico de una serie de áreas de investigación, como la lesión de la médula espinal, la hipoxia neonatal y las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple y la mielitis transversa. La mielinización es necesaria no solo para facilitar la rápida propagación de los impulsos dentro del sistema nervioso central, sino también para proporcionar soporte trófico a los axones subyacentes. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) se pueden estudiar in vitro para ayudar a identificar factores que pueden promover o inhibir la diferenciación de oligodendrocitos. Hasta la fecha, muchos de los métodos disponibles para evaluar este proceso han requerido un gran número de células, lo que limita el número de condiciones que se pueden investigar en un momento dado, o métodos de cuantificación intensivos en mano de obra. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de un gran número de OPCs de alta pureza junto con un método rápido y fiable para determinar la oligodendrogénesis a partir de múltiples condiciones simultáneamente. Las OPC se aíslan de cortezas de ratas neonatales P5-P7 y se cultivan in vitro durante tres días antes de la diferenciación. Cuatro días después de la diferenciación, la oligodendrogénesis se evalúa mediante un ensayo de fluorescencia infrarroja dual para determinar la expresión de la proteína mielina.

OPC A2B5-positivas se aislaron mediante selección celular positiva utilizando un sistema de separación magnética de columna. Antes del procedimiento de aislamiento, todo el cerebro se elimina de crías de rata que se encuentran entre P5 y P7. Una vez que todo el cerebro se separa con éxito desde el cráneo, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas finas (Figura 1A). Con el fin de aislar el tejido cortical cerebral el hipotálamo, tála...

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células progenitoras de oligodendrocitos de rata y cuantificar la oligodendrogénesis en respuesta a factores experimentales. La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico en numerosas áreas de investigación, incluyendo lesión de la médula espinal, hipoxia neonatal y enfermedades desmielinizantes como la mielitis transversa y la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que combina un protocolo para el aislamiento de grandes cantidades de COPs con un método rápido y confiable para determinar la oligodendrogénesis en múltiples condiciones experimentales simultáneamente.Para comenzar este procedimiento, esterilice todo el equipo de disección utilizando un esterilizador de perlas calentado. Luego, agregue de 15 a 20 mililitros de PBS a un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque el tubo cónico en hielo y úselo para mantener el tejido cortical picado durante la disección.A continuación, agregue PBS frío a una placa de Petri de 10 centímetros que se utilizará para la disección bajo el microscopio óptico. Después de sacrificar las crías de rata, corte la piel detrás de las orejas a lo largo de la línea media utilizando tijeras pequeñas y retire los colgajos cutáneos hacia atrás.A continuación, corte el cráneo a lo largo de la línea media desde el bulbo raquídeo hasta los ojos. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo para preservar la estructura de la corteza subyacente. Después de eso, realice dos cortes laterales inferiores al cerebelo insertando tijeras quirúrgicas pequeñas en el foramen magno.Realice un corte adicional entre los ojos, anterior a los bulbos olfativos. Retire cuidadosamente cada mitad del cráneo. Extraiga todo el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros llena con PBS frío.Bajo un microscopio estereoscópico, retire los bulbos olfativos y el cerebelo con pinzas quirúrgicas finas. Gire el cerebro de modo que la superficie ventral quede visible. Luego, utilizando pinzas rectas finas, realice una disección roma colocando las puntas de las pinzas cerradas entre la corteza y el hipotálamo hasta una profundidad de aproximadamente dos tercios del cerebro.Abra la pinza una vez que esté en su lugar, luego repita el procedimiento para el otro hemisferio. A continuación, separe cuidadosamente la corteza de las regiones del hipotálamo y del mesencéfalo. Retire el hipotálamo, el tálamo y el mesencéfalo sosteniendo el mesencéfalo por su superficie posterior y desprendiéndolo hacia el extremo anterior del cerebro.Posteriormente, seccionar las conexiones anteriores. Utilizando pinzas de disección finas y dobladas, extraer el hipocampo y seccionar su conexión con la corteza. Luego, eliminar el estriado restante raspándolo desde la corteza subyacente mediante un movimiento diagonal hacia afuera.Limpie los vasos sanguíneos y las meninges de la superficie ventral de la corteza. A continuación, gire el cerebro de modo que quede visible la superficie dorsal. Retire las meninges de la corteza subyacente donde se encuentra el bulbo olfatorio.Repita los procedimientos para un total de tres a cuatro ratones. Coloque todas las cortezas disecadas en una placa de Petri. Córnelas con una cuchilla esterilizada hasta obtener trozos de un milímetro por un milímetro.Luego, recoja los tejidos enjuagando la placa con PBS antes de volver a colocarla sobre hielo. Ahora, utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio conectada a un controlador de pipeta, disocie mecánicamente el tejido pipeteando de diez a quince veces o hasta que los fragmentos de tejido se reduzcan en tamaño y la solución se vuelva turbia. A continuación, devuelva la muestra al incubador de cultivo tisular a 37 grados Celsius durante 15 minutos con rotación continua.A continuación, agregue 10 mililitros de PBS a cada muestra y filtre el homogenato a través de un filtro de poro de 40 micrómetros colocado sobre un tubo de 50 mililitros. Luego, enjuague el filtro con un mililitro adicional de uno a dos mililitros de PBS. Combine todas las muestras de homogenato en un solo tubo cónico de 50 mililitros y obtenga un recuento celular total.Después de realizar el recuento celular, divida el homogenato equitativamente en los tubos cónicos de 15 mililitros y centrifúgelos durante 10 a 12 minutos a 300 gs. Prepare cada columna LS añadiendo cinco mililitros de tampón de columna. Y recoja el flujo mediante un tubo cónico de 15 mililitros.Una vez que el tampón de la columna haya pasado completamente a través de la cámara superior, aplique 1000 microlitros de la suspensión celular a cada columna y permita que las células pasen por gravedad. A continuación, retire cada columna y colóquela en un tubo cónico de 15 mililitros. Añada cinco mililitros de tampón de la columna y empuje rápidamente el tampón a través de la columna para desalojar las células retenidas y liberarlas de la columna.Para sembrar las células, dilúyalas con medio de proliferación para OPC a 60.000 células por mililitro. Pipetee 500 microlitros de células por el costado de cada pocillo negro de fondo transparente de una placa de 24 pocillos. Mezcle las células agitando la placa horizontalmente, utilizando un movimiento en forma de ocho.En este procedimiento, coloque una punta de pipeta de 200 microlitros sobre una pipeta de vidrio de Pasteur para asegurarse de que el pocillo no se dañe durante la aspiración. Luego, aspire el medio de los pocillos de cultivo, un grupo de tratamiento a la vez, para evitar que las células se sequen. A continuación, agregue lentamente 500 microlitros de la mezcla maestra de tratamiento por la pared lateral del pocillo utilizando una pipeta de un mililitro.Incube los cultivos y realice un cambio completo del medio con medio de tratamiento fresco cada dos o tres días. Al final del período de tratamiento deseado, aspire el medio. Añada lentamente 400 microlitros de PFA al costado del pocillo para fijar las células.Y incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, aspirar el PFA y añadir lentamente 500 microlitros de D-PBS estéril para lavar las células. Repetir el lavado otras dos veces y no aspirar el último lavado.Ahora, lleve la placa a temperatura ambiente, aspire los pocillos y añada 250 microlitros de PBS-D que contenga cinco por ciento de NGS y 0,1 por ciento de Triton X-100. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital suave. Prepare la solución de incubación primaria diluyendo el anticuerpo monoclonal de ratón anti MBP y el anticuerpo policlonal de conejo anti olig2 en PBS-D que contenga cinco por ciento de NGS.A continuación, incubar los anticuerpos primarios a cuatro grados Celsius durante la noche durante 16 a 18 horas con agitación orbital suave. Mientras se lava la placa, preparar la solución de incubación secundaria diluyendo los anticuerpos anti ratón 680 y anti conejo 800 en D-PBS que contiene 5 % de NGS. A continuación, aspirar la última lavada y añadir 250 microlitros de la solución de incubación secundaria.Proteja la placa de la luz e incúbela a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital suave. Después de eso, escanee la placa utilizando un sistema de imagen capaz de detectar emisiones de fluorescencia de 700 nanómetros y 800 nanómetros. Como punto inicial, ajuste el desplazamiento focal a tres y las sensibilidades a uno punto cinco para MBP, cinco punto cero para actina y tres punto cinco para olig2.Ajuste los valores de sensibilidad según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal. En este esquema, el ensayo DIFS comienza con OPCs de rata positivos para A2B5 aislados recientemente y sembrados en recipientes de cultivo codificados con PLL. Estos cultivos se proliferan durante tres días en presencia de 20 nanogramos por mililitro de PDGFAA, y luego se tratan con factores experimentales en medio fresco sin PDGF el día cero.El medio de tratamiento se reemplaza completamente el día dos. Y las células se fijan con paraformaldehído al 4 por ciento el día cuatro. Aquí, se realizó inmunocitoquímica para olig2 y MBP en cultivos representativos el día cero y el día cuatro utilizando Dapi como tinción nuclear de contraste.Estas cultivos muestran tinción constitutiva para el marcador panespecífico de la línea de oligodendrocitos, Olig2, en los días cero y cuatro. Mientras que la tinción para el marcador de oligodendrocitos maduros MBP solo fue evidente a partir del día cuatro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar, cultivar y diferenciar OPCs de rata positivos para A2B5 con el fin de cuantificar el efecto de factores experimentales sobre la oligodendrogénesis.La identificación de factores que promueven la oligodendrogénesis tiene una relevancia particular para el estudio de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple. Una vez dominadas, las técnicas descritas aquí pueden ayudar a identificar dichos factores y, en última instancia, desarrollar mejores terapéuticas.

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

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