Name: Aislamiento de CD146 + Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a aislar células estromales mesenquimales CD146+ de pulmón de rata mediante digestión enzimática, separación por gradiente de densidad y selección con microesferas magnéticas. Este protocolo eficiente permite estudiar la biología pulmonar y las enfermedades respiratorias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JJPC cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). MAM recibe una beca al mérito de la Fundación Académica Nacional Alemana - Studienstiftung des Deutschen Volkes y cuenta con el apoyo de una subvención de la EFCNI (Fundación Europea para el Cuidado del Recién Nacido). BT cuenta con el apoyo del CIHR, la Asociación Canadiense del Pulmón, la Red de Células Madre y el Instituto de Investigación del Hospital Infantil del Este de Ontario.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa (animal protocolo de ética OHRI-1696). cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. 1. Aislamiento de células mesenquimales de pulmón estromales <ol><li> Prepare la mezcla de enzimas en un tubo de 50 ml: se pesan en 30 U proteasa neutra, 2.500 U de colagenasa I y 500 U de DNasa I. Estas cantidades son suficientes para los pulmones de un ratón adulto o crías de rata. Preparar el día del aislamiento y se almacena a 4 ° C hasta su uso. </li><li> cachorros Sacrificio de rata en el día 13 mediante una inyección intra-peritoneal de pentobarbital de sodio (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilice el pellizco reflejo del dedo del pie para establecer la inconsciencia. La muerte del animal se garantiza mediante la apertura del pecho, como se describe a continuación. </li><li> Desinfectar la piel por pulverización al animal con 70% de etanol y abrir con cuidado la caja torácica utilizando tijeras quirúrgicas, a partir de la membrana y de corte hacia el lado rostral, siendo muy cuidado de nodañar los pulmones. Corre la caja torácica abierta usando pinzas hemostáticas, o alternativamente cortar la caja torácica para proporcionar acceso al tórax. </li><li> Exsanguinate el animal mediante la eliminación del corazón. Para quitar el corazón, captar el timo y corazón con pequeñas pinzas y cortar éstos con tijeras quirúrgicas. Inmediatamente después, absorber la sangre con una gasa hasta que no sale sangre de la aorta y la arteria pulmonar cortada. </li><li> Retire los pulmones desde el tórax de la siguiente manera: mantener la tráquea con pequeñas pinzas, a continuación, cortar la tráquea con tijeras quirúrgicas en la parte rostral. Mientras tira suavemente el paquete de pulmón fuera del tórax, cortar y retirar cualquier tejido conectivo en la cara dorsal a lo largo de la caja torácica para liberar a los pulmones. </li><li> Sever los pulmones de la aorta y el esófago por el corte a lo largo del diafragma con tijeras quirúrgicas. Ahora que los pulmones están completamente libres de tórax eliminar la sangre restante suavemente con una gasa. </li><li> Retire la tráquea y los bronquios con el surtijeras gicas y transferir cuidadosamente los lóbulos pulmonares a un tubo de 50 ml que contiene 35 ml de 30% de citrato-fosfato-dextrosa adenina (CPDA-1) anticoagulante fría (26.30 g de citrato trisódico dihidrato, 3,27 g de monohidrato de ácido ascórbico, 2,22 g de fosfato monosódico dihidrógeno, 31,80 g de D-glucosa, 0,275 g adenina en 1 L purificó H 2 O; filtro estéril de la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y los residuos. </li><li> Después de un enjuague de 5 min en 30% CPDA-1 / PBS, transferir el pulmón a un nuevo tubo de 50 ml que contiene 35 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) (RT), invertir suavemente para eliminar el citrato. Transferir a un tubo que contiene 35 ml de PBS + de sodio-piruvato de Dulbecco + glucosa (DPBS ++) (RT). Cada etapa de aclarado debería tomar aproximadamente 5 minutos. Nota: DPBS ++ puede pedirse comercialmente o se hace de la siguiente manera 21: cloruro de calcio dihidrato 132,4 mg, cloruro de magnesio hexahidratado 100 mg, cloruro de potasio (anhidro) 200 mg, fosfato de potasio monobásico (anhidro) 200 mg, cloruro de sodio (anhidro) 8,000 mg, fosfato dibásico de sodio (anhidro) 1,144.5 mg, D-glucosa 1.000 mg, piruvato de sodio 36 mg en 1 L H purificada 2 O, pH 7,3. Filtro estéril la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso. </li><li> Disolver la mezcla de enzima por adición de 10 ml de DPBS ++ (pre-calentado a 37 ° C) y invirtiendo suavemente hasta que se disuelva. </li><li> La transferencia de los pulmones a un nuevo tubo de 50 ml y picar el pulmón en la pared del tubo utilizando un bisturí hasta que quede finamente picado. Añadir la mezcla de enzimas en el tejido (10 ml de mezcla de enzima / por ratón adulto / crías de rata de pulmón), tape el tubo y se incuba a 38 ° C con agitación suave (ya sea en una mezcladora térmica, un baño de agua con agitación, o un agua baño con agitación manual y habitual). La duración depende del tipo de tejido: el tejido fetal 60 min, juvenil / adulto tejido 90 a 120 min, tejido adulto fibrótica 120-150 min. </li><li> Detener la digestión mediante la quelación de los cationes bivalentes wITH 200 l de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Filtro estéril la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso). </li><li> Añadir suero de 20 ml 5% fetal bovino (FBS) / PBS y pasar toda la suspensión a través de 100 micras colador celular en un nuevo tubo de 50 ml. Enjuague el filtro de tubo y de células con 10 ml 5% de FBS / PBS, con lo que el volumen total a 40 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 500 xg, RT. </li><li> Eliminar el sobrenadante (pellet debe ser claramente visible), se vuelve a suspender en 40 ml de FBS al 5% / PBS y repetir el paso de centrifugación 1.13. </li><li> Resuspender en 4 ml 5% de FBS / PBS (RT) y la capa cuidadosamente sobre 3 ml de medio de gradiente de densidad (1,073 g / cm 3) en un tubo de 15 ml 14. Para obtener una buena interfase, es crucial que las capas de la suspensión de células individuales se produce en un ángulo °&gt; 45 a muy baja velocidad. </li><li> Centrifugar 20 minutos a 900 xg, medio (5/10) de aceleración, no deceleración, 19 ° C. </li><li> Recoger las células presentes en el enterphase y los resuspender en 10 ml de PBS estéril. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml pre-calentado medio completado cultura L-MSC (mínimo medio esencial Eagle, modificación alfa (aMEM), suplementado con 2 mmol L-glutamina por 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS y 1% de penicilina vol / vol / estreptomicina / anfotericina B. </li><li> Repita el paso de centrifugación 1.18. Posteriormente, eliminar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio de cultivo fresco precalentado. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado y la placa a una densidad alta, ya que la mayoría de las células en esta etapa no son adherentes de plástico. La densidad de placas exacta depende de la especie animal y de la edad, por ejemplo, las células de un pulmón de ratón adulto se siembran a 10 5 células / cm 2, mientras que las células de un pulmón cría de rata son suficientemente densa a una densidad de siembra de 1-2 x 10 4 células / cm2 </sup&gt;. Use 0,2 ml L-MSC medio de cultivo / cm 2. </li><li> Cultura L-MSC humidificado en un 5% de O2, 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Cambie medio 24 horas después de la siembra inicial, y posteriormente cada 3 días después de enjuagar una vez con PBS. Las células deben ser cultivadas hasta 80-90% de confluencia, que toma 3-5 días en promedio en función del animal de origen. confluencia superior promoverá la diferenciación en los fibroblastos. </li></ol> 2. Selección de células CD146 + estromales mesenquimales de pulmón <ol><li> El recubrimiento de perlas magnéticas con el anticuerpo secundario <ol><li> Recubrir las perlas magnéticas con el anticuerpo secundario biotinilado, a razón de 10 mg perlas de anticuerpo secundario / 100 l magnéticos en un fondo redondo estériles de 2 ml criovial en condiciones estériles. Utilice 10 l de anticuerpo secundario por esperados células 0,5 x 10 6, y el uso de un mínimo de 100 l perlas magnéticas y 10 mg de anticuerpo. Nota: La relación de unaticuerpos utilizados por volumen de los granos pueden diferir entre fabricantes, por favor, consulte las instrucciones del fabricante para las perlas de elección. Para este protocolo, consulte la tabla 1 para los granos y los anticuerpos que se utilizaron en la optimización de este protocolo. </li><li> Incubar en un mezclador giratorio de la muestra durante 30 min a 30 rotaciones / min (rpm), a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las perlas en 1,5 ml estéril 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS y transferir a un tubo de 3 ml ronda inferior (citometría de flujo tubo). Enjuague el criovial con un 1,5 ml 0,1% adicional de BSA / PBS y transferir al tubo de 3 ml. </li><li> Se coloca el tubo en un imán adecuado y esperar 2 min hasta que todas las cuentas están unidas a la pared trasera del tubo y la solución permanece clara. Retire la escorrentía y repetir el lavado con 3 ml de 0,1% de BSA / PBS dos veces. </li><li> Volver a suspender las perlas en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz. Utilice el plazo de 5 días. </li></ol></li><li> Etiquetado CD146 + L-MSC<ol><li> Recoger las células mesenquimales después de enjuagar con PBS utilizando una solución no tripsina suave. Nota: Los volúmenes dependen del tamaño de frasco de cultivo (0,2 ml / cm 2 medio o PBS). <ol><li> Retire el medio de cultivo y enjuagar las células tres veces con PBS estéril. </li><li> Añadir el volumen adecuado de solución no tripsina suave (ver Tabla 1). Incubar a 37 ° C en la incubadora hasta que las células han individual, de aproximadamente 10 min cuando se utiliza la solución en la Tabla 1. </li><li> Inactivar la enzima mediante la adición de medio de cultivo L-MSC, y centrifugar durante 5 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Extraer el sobrenadante, Resuspender las células en 0,1% de BSA / PBS y contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Nota: El volumen de 0,1% de BSA / PBS depende del tamaño de frasco de cultivo: objetivo de 5 o 10 ml 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Repita el paso 2.2.2 y volver a suspender la cantidad dedicada de células en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS (bloques de la ONUsitios de unión específicos y mantiene las células vivas). Mantener las células en hielo. </li><li> Preparar un tubo redondo de 3 ml de fondo con el anticuerpo anti-CD146 primaria, y mantener en hielo. Nota: La concentración de anticuerpo primario que se añade a la cantidad dedicado de las células depende de que el anticuerpo que se utiliza. Para un anticuerpo CD146 anti-rata sugerido véase la Tabla 1. </li><li> Añadir el volumen total de las células de la etapa 2.2.3 al tubo con el anticuerpo primario. Cerrar herméticamente y se incuba 30 min en un mezclador muestra que gira a 15 rpm, 4 ° C. </li><li> Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 xg, 4 ° C, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml 0,1% de BSA / PBS. Repita el paso de centrifugación. </li><li> Resuspender las células en la solución de 3 ml que contenía perlas recubiertas de anticuerpo secundario que se preparó de acuerdo con las instrucciones en la sección 2.1 y se incuba 30 min en un mezclador muestra que gira a 15 rpm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Selección de CD146 + L-MSC<ol><li> Se coloca el tubo que contiene la etiqueta CD146 + L-MSC en el imán. Las células positivas serán atraídos a la parte posterior del tubo. Sin mover el tubo o tocar las perlas, recoger el sobrenadante con las células negativas lentamente con una pipeta Pasteur estéril (estos pueden ser o bien recogidas o descartados basado en el diseño experimental). </li><li> Retire el tubo del imán y resuspender las células en 3 ml de 10% de BSA / PBS. Repetir el procedimiento de selección descrito en el paso 2.3.1. cuatro veces más (pasos 5 Σ selección). </li><li> Resuspender el CD146 + L-MSC en medio de cultivo pre-calentado L-MSC y volver al imán. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender en medio de cultivo L-MSC y la placa en un matraz de cultivo de tamaño apropiado (0,2 ml / cm 2). Como regla general, las células de la placa en el mismo frasco de cultivo de tamaño de la que se eliminaron las células antes de talón de selección. El número de CD146 + L-MSC, y por lo tanto la densidad de placas, sedependerá de la edad, la especie y la cepa del animal fuente. Siempre apuntar a una densidad de placas de ~ 5000 células / cm 2. Nota: Las cuentas no perturbar el crecimiento celular y desaparecerán gradualmente a medida que las células proliferan. </li></ol></li></ol> 3. Las células de congelación <ol><li> Use los siguientes medios de congelación: solución pentastarch 60% (10% pentastarch en 0,9% NaCl), 20% de FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) 22. Nota: Si no todos los ingredientes están disponibles, una solución que contiene 5% de DMSO, 30% de FBS y 65% ​​aMEM es una buena alternativa. </li><li> Resuspender las células en 0.5 x 10 6 células / ml, alícuotas en crioviales de 1 ml cada una y se congelan O / N a -80 ° C usando un recipiente de congelación. </li><li> Transferir a un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido al día siguiente. </li></ol> 4. Las células de descongelación <ol><li> Descongelar un vial de células en un baño de agua a 37 ° durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en 10 mlmedio de cultivo pre-calentado y centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo 10 ml. Sembrar las células en un cultivo celular tapa ventilada tratados matraces a 5.000 células / cm 2 en 0,2 ml de medio / cm2 (por ejemplo, 15 ml para un matraz de 75 cm2). </li><li> Células de cultivo en 5% de O 2, 5% de CO 2 hasta 80-90% de confluencia para la recolección y / o el uso experimental. El exceso de confluencia inducirá la diferenciación. Cuando la siembra a 5.000 células / cm 2, L-MSC llegará a 80-90% de confluencia dentro de 3-4 días de cultivo. </li></ol>

<ol><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Wei, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXF1+mediates+mesenchymal+stem+cell+fusion-induced+reprogramming+of+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells.</a> Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).</li>
<li>Marriott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2pos+lung+mesenchymal+stem+cells+are+a+novel+pericyte+subpopulation+that+contributes+to+fibrotic+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).</li>
<li>Collins, J. J., Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+mesenchymal+stromal+cells+in+development+and+disease%3A+to+serve+and+protect%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).</li>
<li>McQualter, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27, 623-633 (2009).</li>
<li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+stem+cell+antigen-1%3A+expression%2C+function%2C+and+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).</li>
<li>Gottschling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+non-small+cell+lung+cancer--different+from+others%3F+Insights+from+comparative+molecular+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses.</a> Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).</li>
<li>Bertoncello, I., McQualter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+clonal+assay+of+adult+lung+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).</li>
<li>Jun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+bleomycin-induced+fibrosis+is+associated+with+loss+of+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+that+regulate+effector+T-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation.</a> Stem Cells. 29, 725-735 (2011).</li>
<li>Majka, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+resident+pulmonary+stem+cells%3A+form+and+function+of+the+lung+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population.</a> Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).</li>
<li>Hennrick, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cells+from+neonates+show+a+mesenchymal+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype.</a> Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).</li>
<li>Salama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+governs+proliferation+and+migration+of+bronchoalveolar+lavage-derived+lung+mesenchymal+stem+cells+in+bronchiolitis+obliterans+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome.</a> Transplantation. 92, 155-162 (2011).</li>
<li>Hoffman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-derived+mesenchymal+stromal+cell+post-transplantation+survival%2C+persistence%2C+paracrine+expression%2C+and+repair+of+elastase-injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung.</a> Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Grisendi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-manufactured+density+gradient+media+for+optimized+mesenchymal+stromal%2Fstem+cell+isolation+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion.</a> Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).</li>
<li>Bardin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Endo+1%2C+a+pan-endothelial+monoclonal+antibody+recognizing+a+novel+human+endothelial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+antigens%22%5BJournal%5D)">S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen.</a> Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).</li>
<li>Covas, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+obtained+from+diverse+human+tissues+share+functional+properties+and+gene-expression+profile+with+CD146%2B+perivascular+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts.</a> Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+high-capacity+assay+to+quantify+the+clonal+heterogeneity+in+trilineage+potential+of+mesenchymal+stem+cells+reveals+a+complex+hierarchy+of+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment.</a> Stem Cells. 28, 788-798 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+CD146%2B+multipotent+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells.</a> Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).</li>
<li>Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+distinguishing+mesenchymal+stem+cells+from+fibroblasts+are+downregulated+with+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging.</a> Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).</li>
<li>McGowan, S. E., Torday, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+lipofibroblast+%28lipid+interstitial+cell%29+and+its+contributions+to+alveolar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development.</a> Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).</li>
<li>Hayakawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%25+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+and+pentastarch+improves+cryopreservation+of+cord+blood+cells+over+10%25+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO.</a> Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+self-renew+and+differentiate+according+to+a+deterministic+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy.</a> PLoS One. 4, 6498(2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+tissues+by+adult+stem%2Fprogenitor+cells+%28MSCs%29%3A+controversies%2C+myths%2C+and+changing+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).</li>
<li>Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).</li>
<li>Boron, W. F., Boulpaep, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoron%2C+WF+%22Medical+Physiology.+2nd+edn%22">Medical Physiology. 2nd edn</a>. , Saunders Elsevier. (2009).</li>
<li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter%3F+Small+molecules+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).</li>
<li>Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+alveolar-capillary+O2+partial+pressure+gradient+by+using+15NO%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide+%3A+biology+and+chemistry+%2F+official+journal+of+the+Nitric+Oxide+Society%22%5BJournal%5D)">Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO.</a> Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).</li>
<li>Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+stem+cell+biology%3A+a+critical+component+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche.</a> Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).</li>
<li>Krampera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+characterization+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells-The+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29+working+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal.</a> Cytotherapy. , (2013).</li>
<li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+perivascular+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Expression+of+Neuron-Glial+Antigen+2+%28NG2%29and+Melanoma+Cell+Adhesion+Molecule+%28CD146%29+in+Heterogeneous+Cultures+of+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue engineering. Part A. , (2013).</li>
<li>Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).</li>
<li>Dagur, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+interleukin-17+by+CD8%2B+T+cells+expressing+CD146+%28MCAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM).</a> Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).</li>
<li>da Silva Meirelles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+adipose+tissue+pericytes+and+mesenchymal+stromal+cells+display+a+very+similar+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+MSCs+are+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">All MSCs are pericytes.</a> Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).</li>
<li>McGowan, S. E., McCoy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibroblast+lipid+storage+and+myofibroblast+phenotypes+during+alveolar+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).</li>
<li>Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+expression+in+alveolar+fibroblasts+during+realveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Bonyadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+self-renewal+deficiency+leads+to+age-dependent+osteoporosis+in+Sca-1%2FLy-6A+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).</li>
<li>Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+and+progenitor+defects+in+Sca-1%2FLy-6A-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice.</a> Blood. 101, 517-523 (2003).</li>
<li>Chow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+contribute+to+pulmonary+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+circulation%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling.</a> Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El aislamiento y cultivo de primaria L-MSC presenta una oportunidad para comprender mejor su función y su interacción con otras poblaciones celulares a nivel celular, y su papel en el desarrollo del pulmón, la salud y la enfermedad. Esto es especialmente importante ya que la falta de un marcador individual específico de estas células hace que sea casi imposible el estudio de estas células in situ. Al igual que con todas las poblaciones de células primarias, se debe tener en cuenta que estas células son más prop...

las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Durante el desarrollo, incluyendo en el pulmón, el mesénquima es una importante fuente de señales de desarrollo, y las MSC residentes son un probable candidato para estar en el centro de esta. Por otra parte, la evidencia está emergiendo que las MSC residentes son perturbados en enfermedades de adultos, incluyendo el cáncer y la fibrosis 1,2 3. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células 4. Célula de vástago antígeno-1 (Sca-1) fue identificado en ratones como un marcador para una variedad de células madre de tejido, y se puede utilizar para el aislamiento de L-MSC 5, pero tiene por desgraciasin ortólogos conocido en otras especies 6. Los investigadores han informado una variedad de diferentes métodos de aislamiento para el aislamiento de L-MSC ya sea de tejido pulmonar o líquido. Estos varían de células activadas por fluorescencia métodos (FACS) basados ​​selección para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) - / Sca-1 + 8, resistencia a múltiples fármacos transportador ATP casete de unión a G (ABCG2) células positivas 9 o Hoechst 33342 flujo de salida de colorante 10, a la adherencia de plástico 11,12 y la migración de tejido picado 13. Las ventajas del método presentado en este documento son varias veces. Mediante el uso de una digestión enzimática suave y gradiente de densidad 14, se obtiene todas las células de la gama de densidad que incluyen MSCs pero excluyen las células epiteliales o endoteliales. El paso de la adherencia de plástico posterior asegura que sólo el mesenchymal células se adhieran y se quedan en la cultura, la eliminación de los leucocitos. Sin embargo es más importante, la etapa de selección CD146 + permite la eliminación de los fibroblastos, ya que estas células no expresan CD146. La expresión de la molécula de adhesión celular CD146 se correlaciona positivamente con la multipotencia, y por lo tanto es un buen marcador para eliminar a los fibroblastos a partir de una población de células mesenquimales 15-19. Esto es una ventaja sobre el uso de CD90 como marcador de selección, ya que no sólo se expresa en las MSC, sino también en lipofibroblasts 5,20. En este protocolo se ha elegido de forma explícita una selección de perlas magnéticas, ya que es más suave en las células, y todo el procedimiento se puede realizar en condiciones estériles. Otra ventaja importante de este método de aislamiento en comparación con el método de derivación, es que es relativamente rápido, 6-10 días en contraposición a un mes o más para el método de extensión. De tres a cinco días después del aislamiento inicial y la población mesenquimales está listo para CD146 + sele<html> cción; después de otros tres a cinco días las células CD146 + están listos para ser utilizados en los experimentos o se pueden congelar para su uso posterior. El tiempo de disminución de la cultura mejora la calidad de las células como MSCs transdifferentiate hacia fibroblastos en cultivo prolongado ex vivo 19. Por último, debido a la naturaleza del protocolo, es posible aplicar este método para otras especies simplemente eligiendo anticuerpos apropiados, o incluso a otros sistemas de órganos mediante el ajuste de la elección de las enzimas de fermentación y el tiempo de incubación. Un protocolo detallado de este método de aislamiento se da a continuación, y una vista general esquemática del aislamiento y la posterior selección de la subpoblación CD146 + se proporciona en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Además, se incluyen detalles de los pases, la congelación y descongelación estas células. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema general del aislamiento de las células pulmonares mesenquimales (A) y la posterior CD146 + selección de célula (B) min = minutos.; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; 2º Ab = anticuerpo secundario; a-CD146 Ab = anticuerpo anti-CD146 primaria; células negativas -ve células CD146 =; + ve células células CD146 positivas =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Proteasa neutra</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Prepare el día del aislamiento y almacene a 4 & grados; C hasta el uso</td></tr><tr><td>de la colagenasa I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Prepare el día del aislamiento y almacene a 4 ° C hasta usar</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Preparar el día del aislamiento y almacenar a 4 &°; C hasta su uso</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico (Eutanilo)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublín, Irlanda-Uso</td><td></td> <td>de 0,2 ml para crías de rata de entre 20 y 30 g; los animales más grandes pueden necesitar más.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + Piruvato de sodio + Glucosa Life</td><td>Technologies</td><td>14287-072</td><td>Muy importante utilizar este tipo de D-PBS, ya que el calcio y el magnesio que están presentes en este D-PBS facilitan la digestión enzimática</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Medios de gradiente de densidad. Para obtener una buena interfase, es crucial que la estratificación de la suspensión unicelular se produzca a una >45&deg; ángulo a muy baja velocidad, y que la posterior centrifugación se realice a 19 &°C.</td></tr><tr><td>y alfa; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Cálido en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiótico-Antimicótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicilina/Estreptomicina/Fungizona</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Perlas magnéticas</td></tr><tr><td>policlonales biotiniladas conejo-anti-ratón IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Anticuerpo secundario biotinilado que coincide con el anticuerpo anti-rata CD146 que se describe a continuación</td></tr><tr><td>: Imán DynaMag5-Technologies</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>que se recomienda usar con Dynabeads. NOTA: el imán debe elegirse en función de las especificaciones del fabricante. s de las cuentas magnéticas de elección.</td></tr><tr><td>TrypLE express&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Alternativa suave sin tripsina, utilizar 1 ml de TrypLE express/25 cm2 superficie. Después del desprendimiento, 10 ml de medio de cultivo L-MSC son suficientes para inactivar 3 ml</td></tr><tr><td>de anticuerpo TrypLE anti-rata CD146</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 y mu; l por 0,5 x 106 células</td></tr><tr><td>Pentaspan (solución de pentaalmidón)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Canadá-Se</td> <td>puede obtener a través de los servicios locales de donación de sangre o los departamentos de hematología. Alternativamente, se podría utilizar la solución de pentaalmidón PSI al 20% (Preservation Solutions, PST001) diluida 1:1 con NaCl al 0,9%.</td></tr><tr><td>Contenedor de congelación Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Mejora la viabilidad al congelar L-MSC durante la noche a -80 & grados; C</td></tr></tbody></table>

aislamiento de cd146<sup&gt; +</sup&gt; las células estromales mesenquimales de pulmón residente de los pulmones de ratas

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Por otra parte, que probablemente tienen un papel en el desarrollo normal de órganos, y se han atribuido funciones en la enfermedad, en particular aquellos con una naturaleza fibrótica. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células. La técnica de aislamiento descrito aquí se aplica múltiples características de las MSC residentes de pulmón (L-MSC). Después del sacrificio de las ratas, los pulmones se retiran y se enjuagan varias veces para eliminar la sangre. Tras la disociación mecánica por bisturí, los pulmones se digieren durante 2-3 hr usando una mezcla de colagenasa tipo I, proteasa neutra y el tipo de DNasa I. El obtainesuspensión de células individuales d se lava posteriormente y en capas sobre medio de gradiente de densidad (densidad 1,073 g / ml). Después de la centrifugación, las células de la interfase se lavaron y se sembraron en frascos de cultivo tratadas. Las células se cultivan durante 4-7 días en fisiológica 5% de O2, 5% de CO 2 condiciones. Para agotar los fibroblastos (CD146 -) y para asegurar una población de sólo la selección L-MSC (CD146 +), positivo para las células CD146 + se lleva a cabo a través de la selección de perlas magnéticas. En resumen, este procedimiento fiable produce una población de primaria L-MSC para su posterior estudio y manipulación in vitro. Debido a la naturaleza del protocolo, que puede ser fácilmente traducido a otros modelos animales experimentales.

Dos de las características físicas más fiables de las MSC, la densidad y la adhesión de plástico, se utilizan en la primera parte de este protocolo para obtener la fracción de células mesenquimales del pulmón que contiene L-MSC. Aunque la interfase gradiente de densidad incluirá monocitos y macrófagos, además de las células mesenquimales de pulmón, la adherencia de plástico seguido de 3-5 días de cultivo se asegura de que sólo las células mesenquimales de pulmón permanecen. De hecho esta...

Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar in vitro células mesenquimales estromales residentes positivas para CD146, o CEM, aisladas del pulmón de rata mediante una combinación de digestión enzimática, separación por gradiente de densidad, adherencia al plástico y clasificación con microesferas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades pulmonares sobre cómo las CEM pulmonares se ven afectadas en la enfermedad y cómo contribuyen a la modulación inmune y a la reparación del tejido. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, reproducible y fácilmente aplicable a diferentes especies de animales experimentales o tejidos.Quien demostrará los primeros pasos del procedimiento será Arul Vadivel, un asociado de investigación de mi laboratorio. Para extraer el pulmón del tórax, sostenga la tráquea con pinzas pequeñas y use tijeras quirúrgicas para separar la tráquea en el lado rostral. Luego, mientras se extrae suavemente el conjunto pulmonar del tórax, corte los tejidos conectivos en el lado dorsal a lo largo de la caja torácica.Corte a lo largo del diafragma para separar los pulmones de la aorta y el esófago, y use gasa para retirar suavemente cualquier sangre residual del tejido pulmonar. Con tijeras, retire la tráquea y los bronquios y coloque cuidadosamente los lóbulos pulmonares en un tubo de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de anticoagulante CPDA frío y PBS para eliminar la sangre y los restos celulares. Después de cinco minutos, transfiera los pulmones a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente.Y dar la vuelta suavemente para eliminar el citrato. Después de cinco minutos, enjuague los pulmones en un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de PBS de Dulbecco estéril a temperatura ambiente, suplementado con piruvato de sodio y glucosa, e invierta suavemente. Luego, transfiera los pulmones a otro tubo de 50 mililitros y use un escalpelo para picar finamente el tejido contra la pared del tubo.Es muy importante cortar el tejido en trozos muy pequeños para asegurar un rendimiento máximo de células. Y trabajar rápidamente para garantizar una viabilidad celular óptima. Cuando todo el tejido haya sido picado, agregue enzima recién preparada al tubo y cierre la tapa firmemente.Luego, incubar los fragmentos de tejido a 38 grados Celsius con agitación suave durante el período de digestión adecuado. Al final de la incubación, detener la digestión con 200 microlitros de EDTA estéril filtrado. Añadir 20 mililitros de PBS suplementado con FBS a la suspensión de tejido y pasar toda la suspensión a través de un filtro celular de 100 micrones hacia un nuevo tubo de 50 mililitros.Luego, enjuague el tubo de digestión y el filtro celular con 10 mililitros de FBS/PBS y aspire el lavado junto con la muestra filtrada. Después de centrifugar las células dos veces, re suspenda el segundo pellet en cuatro mililitros de FBS/PBS a temperatura ambiente. Y, lentamente, forme una capa con las células sobre tres mililitros de medio de gradiente de densidad a un ángulo mayor de 45 grados.Al golpear en un ángulo mayor a 45 grados entre la suspensión celular y el medio de gradiente de densidad, se evitan fuerzas de cizallamiento que mezclen las células con el medio de gradiente, permitiendo así la formación de capas; si ocurre mezcla, no se generará ningún gradiente de densidad. Separe las células mediante centrifugación y recoja la interfase. Luego lave las CEM pulmonares con 10 mililitros de PBS estéril y resuspenda el precipitado en medio de cultivo completo precalentado para CEM pulmonares para su siembra.Para aislar la población de células positivas para CD146, primero recubra las perlas magnéticas con 10 microgramos de anticuerpo secundario biotinilado por cada 100 microlitros de perlas magnéticas, en un vial criogénico estéril de fondo redondo de dos mililitros bajo condiciones estériles. Incube las perlas y el anticuerpo en un mezclador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente y 30 RPM. A continuación, re suspenda las perlas conjugadas con anticuerpo en 1,5 mililitros de PBS suplementado con BSA y transfiera las perlas a un tubo de citometría de flujo de fondo redondo de tres mililitros.Lave el vial criogénico con 1,5 mililitros adicionales de BSA/PBS y aspire el lavado junto con las perlas. Coloque el tubo en un imán adecuado durante dos minutos hasta que todas las perlas se adhieran a la pared posterior del tubo y la solución se vuelva transparente. A continuación, retire el sobrenadante y lave las perlas dos veces más con tres mililitros de BSA/PBS.Lave los MSC tres veces con PBS sin suplementar. Después del último lavado, trate las células con una solución suave sin tripsina durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Cuando todas las células se hayan desprendido, agregue medio de cultivo para MSC pulmonares fresco y centrifugue las células.ReSuspender el precipitado en PBS con BSA y contar las células. Luego, transferir las células a un tubo de tres mililitros que contenga el anticuerpo primario CD146, tapar el tubo e incubar las células en un mezclador rotatorio a 15 RPM y cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lavar las células dos veces en tres mililitros de PBS con BSA, reSuspendiendo el segundo precipitado en tres mililitros de perlas conjugadas con el anticuerpo secundario.Después de 30 minutos en el mezclador rotatorio a cuatro grados Celsius, coloque el tubo en el imán y use una pipeta Pasteur estéril para retirar lentamente y con cuidado las células negativas. A continuación, con el tubo retirado del imán, resuspenda las células en tres mililitros de PBS suplementado con BSA y repita el proceso de selección otras cuatro veces. Después de la última eliminación de células negativas, lave los MSC pulmonares CD146 positivos en medio de cultivo precalentado.Finalmente, re suspenda las células conjugadas con perlas en medio fresco de cultivo de células mesenquimatosas estromales pulmonares y coloque 5.000 células por centímetro cuadrado en un matraz de cultivo de tamaño adecuado. La adhesión al plástico seguida de tres a cinco días de cultivo enriquece la población de la interfase de los gradientes de densidad para células MSC pulmonares positivas para CD90, CD73 y CD146.Además, estas células son capaces de una eficiencia de formación de unidades de colonia de aproximadamente el 30 %, mucho más alta que la generalmente reportada para la médula ósea u otros subconjuntos de CMM que se diferencian a lo largo de las tres linajes clásicos de CMM. La selección positiva en la subpoblación positiva para CD146 aparentemente resulta en una población celular altamente enriquecida en CMM de pulmón, como lo demuestra un mayor porcentaje de células que expresan marcadores superficiales asociados a CMM. Estas células también demuestran un potencial de formación de colonias considerablemente mayor y una respuesta de diferenciación más fuerte, particularmente en las células del linaje condrogénico, en comparación con la población total de células mesenquimales obtenida antes de la selección de CD146.Es importante destacar que estos MSC pulmonares forman muy pocos adipocitos verdaderos, exhibiendo en cambio muchas células con forma de huso llenas de pequeñas vesículas lipídicas, lo que posiblemente refleja la linaje de lipofibroblastos, crucial tanto para el desarrollo pulmonar como para el soporte de las células alveolares tipo dos. Una vez dominada, esta técnica puede producir MSC pulmonares positivos para CD146 en un plazo de seis a diez días, aunque el rendimiento dependerá de la edad y de la especie del animal. Al realizar este procedimiento, es fundamental trabajar rápidamente para preservar la viabilidad celular.Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reacción mixta de linfocitos o ensayos de cicatrización de heridas, para responder preguntas adicionales sobre la eficacia de las CEM en la inhibición de la proliferación de linfocitos T y en el apoyo a la cicatrización de heridas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar CEM pulmonares positivas para CD146 mediante digestión enzimática, separación por gradiente de densidad, adherencia al plástico y clasificación con microesferas.

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula tienen funciones significativas en la diferenciación diversa, la autorrenovación y la modulación inmunitaria. Se han convertido en un reservorio crucial de células precursoras en terapia génica, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Aquí, presentamos un método único para aislar células madre mesenquimales de médula ósea de la mandíbula en ratas.

Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

El protocolo que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar células que contienen retinoides de poblaciones de células pulmonares muy heterogéneas mediante el uso de la autofluorescencia de retinoides específicos y el empleo de la clasificación de células activadas por fluorescentes.

Aislamiento de células que contienen retinoides pulmonares mediante clasificación celular

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Aprende a aislar células estromales mesenquimales CD146+ de pulmón de rata mediante digestión enzimática, separación por gradiente de densidad y selección con microesferas magnéticas. Este protocolo eficiente permite estudiar la biología pulmonar y las enfermedades respiratorias.

Aislamiento de CD146

Explorar más videos