Aislamiento de CD146 + Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar in vitro las células estromales mesenquimales residentes o MSC positivas para CD146 aisladas del pulmón de rata mediante una combinación de digestión enzimática, separación por gradiente de densidad, adherencia plástica y clasificación de perlas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades pulmonares sobre cómo se infectan las MSC pulmonares en la enfermedad y cómo contribuyen a la modulación inmunitaria y la reparación de los tejidos. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, reproducible y fácilmente aplicable a diferentes especies de animales o tejidos de experimentación.

Arul Vadivel, investigador asociado de mi laboratorio, demostrará los primeros pasos del procedimiento. Para extraer el pulmón del tórax, sostenga la tráquea con pinzas pequeñas y use tijeras quirúrgicas para separar la tráquea del lado rostral. Luego, mientras tira suavemente del paquete pulmonar fuera del tórax, corte cualquier tejido conectivo en el lado dorsal a lo largo de la caja torácica.

Corta a lo largo del diafragma para separar los pulmones de la aorta y el esófago, y usa una gasa para extraer suavemente la sangre restante del tejido pulmonar. Con unas tijeras, retire la tráquea y los bronquios y coloque con cuidado los lóbulos pulmonares en un tubo de 50 mililitros que contiene 35 mililitros de anticoagulante CPDA frío y PBS para eliminar la sangre y los desechos. Después de cinco minutos, transfiera los pulmones a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente.

E invierta suavemente para eliminar el citrato. Después de cinco minutos, enjuague los pulmones en un tubo nuevo de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente de Dulbecco suplementado con piruvato de sodio y glucosa e inviértalo suavemente. Luego, transfiera los pulmones a otro tubo de 50 mililitros y use un bisturí para picar finamente el tejido contra la pared del tubo.

Es muy importante cortar el tejido en trozos muy pequeños para asegurar el máximo rendimiento celular. Y trabajar rápidamente para garantizar una viabilidad celular robusta. Cuando se haya picado todo el tejido, agregue la enzima recién preparada al tubo y tape herméticamente la tapa.

A continuación, incubar los trozos de tejido a 38 grados centígrados con una suave agitación durante el período de digestión adecuado. Al final de la incubación, detenga la digestión con 200 microlitros de EDTA filtrado estéril. Agregue 20 mililitros de PBS suplementado con FBS a la suspensión de tejidos y pase toda la suspensión a través de un filtro de celdas de 100 micras a un nuevo tubo de 50 mililitros.

A continuación, enjuague el tubo de digestión y el filtro de células con 10 mililitros de FBS/PBS y tire del lavado con una muestra filtrada. Después de girar las celdas dos veces, vuelva a suspender el segundo pellet en cuatro milímetros de FBS/PBS a temperatura ambiente. Y coloque lentamente las celdas en capas sobre tres mililitros de medio de gradiente de densidad en un ángulo superior a 45 grados.

Al dar palmaditas en un ángulo superior a 45 grados entre la suspensión de la célula y el medio de gradiente de densidad, evita que las fuerzas puras mezclen las células con el medio de gradiente, lo que permite crear las capas, si se produce la mezcla, no habrá gradiente de densidad. Separar las células por centrifugación y recoger la interfase. A continuación, lave las MSC pulmonares en 10 mililitros de PBS estéril y vuelva a suspender el pellet en un medio de cultivo de MSC pulmonar completo precalentado para la siembra.

Para aislar la población de células positivas para CD146, primero recubra las perlas magnéticas con 10 microgramos de anticuerpo secundario biotinilado por cada 100 microlitros de perlas magnéticas, en un vial criogénico estéril de fondo redondo de dos mililitros en condiciones estériles. Incubar las perlas y el anticuerpo en un mezclador de muestras giratorio durante 30 minutos a temperatura ambiente y 30 RPM. A continuación, vuelva a suspender las perlas conjugadas con anticuerpos en 1,5 mililitros de PBS suplementado con BSA y transfiera las perlas a un tubo de citometría de flujo de fondo redondo de tres mililitros.

Enjuague el vial criogénico con 1,5 mililitros adicionales de BSA/PBS y tire del lavado con las perlas. Coloque el tubo en un imán apropiado durante dos minutos hasta que todas las perlas estén adheridas a la pared posterior del tubo y la solución se vuelva transparente. A continuación, retire el sobrenadante y lave las perlas dos veces más con tres mililitros de BSA/PBS.

Enjuague las MSC tres veces con PBS sin suplementar. Después del último lavado, trate las células con una solución suave sin tripsina durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Cuando todas las células se hayan desprendido, agregue un medio de cultivo de MSC pulmonar fresco y centrifuga las células.

Vuelva a suspender el pellet en PBS más BSA y cuente las células. A continuación, transfiera las células a un tubo de tres mililitros que contenga el anticuerpo primario CD146, tape el tubo e incube las células en un mezclador de muestras giratorio a 15 RPM y cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lavar las células dos veces en tres mililitros de PBS más BSA, resuspendiendo el segundo pellet en tres milímetros de las perlas conjugadas del anticuerpo secundario.

Después de 30 minutos en el mezclador de muestras giratorio a cuatro grados centígrados, coloque el tubo en el imán y utilice una pipeta pasteur estéril para eliminar lenta y cuidadosamente las células negativas. A continuación, con el tubo extraído del imán, vuelva a suspender las células en tres mililitros de PBS suplementado con BSA y repita el proceso de selección cuatro veces más. Después de la última extracción de células negativas, lavar las MSC pulmonares positivas CD146 en un medio de cultivo precalentado.

Finalmente, vuelva a suspender las células conjugadas con perlas en un medio de cultivo de células estromales mesenquimales de pulmón fresco y coloque 5.000 células por centímetro cuadrado en un matraz de cultivo de tamaño adecuado. La adherencia plástica seguida de tres a cinco días de cultivo enriquece la densidad, los gradientes de separación, la interfase, la población para CD90. CD73. y MSCs pulmonares CD 146 positivas.

Además, estas células son capaces de una eficiencia unitaria de formación de colonias de aproximadamente el 30%, mucho más alta que la generalmente informada para la médula ósea u otros subconjuntos de MSC que se diferencian a lo largo de los tres linajes clásicos de MSC. La selección positiva en la subpoblación CD146 positiva aparentemente da como resultado una población celular que está altamente enriquecida en MSC pulmonares, como lo demuestra un mayor porcentaje de células que expresan marcadores de superficie asociados a MSC. Estas células también demuestran un potencial de formación de colonias considerablemente mayor y una respuesta de diferenciación más fuerte, particularmente en las células del linaje condrogénico en comparación con la población total de células mesenquimales obtenida antes de la selección de CD146.

Cabe destacar que estas MSC pulmonares forman muy pocos adipocitos verdaderos que exhiben muchas más células fusiformes llenas de pequeñas vesículas lipídicas que posiblemente reflejen el linaje de lipofibroblastos que es crucial tanto para el desarrollo pulmonar como para el soporte de las células alveolares de tipo dos. Una vez dominada, esta técnica puede producir MSC pulmonares CD146 positivas en un plazo de seis a 10 días, aunque el rendimiento dependerá de la edad y la especie del animal. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar rápido para preservar la viabilidad de las células.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reacción de linfocitos mixtos o las SA de cicatrización de heridas, para responder preguntas adicionales sobre la eficiencia de las MSC para inhibir la proliferación de células T y apoyar la cicatrización de heridas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las MSC pulmonares positivas CD146 mediante la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia plástica y la clasificación de perlas.