Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

El objetivo general de este procedimiento es permitir a los investigadores diseñar y empaquetar virus que expresen una proteína fluorescente, CAS9 y sgRNAs, y luego inyectarlos estereotácticamente en el cerebro del ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas específicas en el campo de la neurociencia, como el papel de los genes que subyacen a los trastornos neurológicos y del neurodesarrollo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de manipular genes específicos sin el proceso intensivo de tiempo y recursos de crear animales modificados genéticamente.

Antes de preparar las células, utilice un sitio web para generar una hebra guía de 20 nucleótidos o sgRNA que se utilizará para diseñar oligonucleótidos monocatenarios. Después de ordenar oligonucleótidos y usarlos para crear un plásmido final como se describe en el protocolo de texto, continúe pipeteando todas las células th-od de un tubo criogénico en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue 2 mililitros de IMDM completo equilibrado con CO2 precalentado.

A continuación, centrifugar las células durante cinco minutos a 500 veces G. Después, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 10 mililitros de IMDM completo. Coloque las células en una placa de cultivo celular de 10 cm e incube durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. 24 horas después del enchapado, cambie el medio aspirando el medio existente y agregando 10 mililitros de IMDM precalentado.

Divida las celdas una vez que sean confluentes. Para dividir las celdas, aspire el medio y lave la placa con 5 mililitros de PBS. A continuación, añade un mililitro de tripsina al 0,25% a la placa e incuba a 37 grados centígrados hasta que las células se despeguen de la placa.

A continuación, añade 0,5 mililitros de IMDM para neutralizar la reacción de tripsina y pipetea las células en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, gire las celdas a 500 veces G durante cinco minutos. Resuspender las células en un mililitro de IMDM y diluir 10 microlitros de células en 90 microlitros de PBS.

Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado y vuelva a colocar las células con IMDM completo. El quinto día, cambie el medio dos horas antes de la transfección y asegúrese de que haya exactamente 10 mililitros de medio en la placa de 10 centímetros. A continuación, prepare los reactivos de transfección para dos disshes utilizando dos tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros.

Etiquete el primer tubo como ADN y el segundo tubo como 2X HBS. A continuación, ajuste la concentración de ADN a un microgramo por microlitro en Tris EDTA a un pH de 7,4. Para hacer reactivos de transfección para lentivirus y retrovirus, agregue lentamente los componentes necesarios al tubo de ADN etiquetado mientras golpea continuamente el tubo para mezclar.

Después de eso, agregue un mililitro de 2X HBS al tubo etiquetado como 2X HBS. A continuación, agregue lentamente un mililitro del contenido del tubo de ADN al tubo HBS 2X, una gota a la vez. Golpee continuamente el tubo 2X HBS y observe el precipitado de fosfato de calcio que se forma después de cada gota para garantizar la creación exitosa de los complejos de transfección.

Posteriormente, incubar el tubo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, agregue un mililitro del reactivo de transfección en gotas lentas a cada placa de células de 10 centímetros e incube las células durante la noche a 37 grados centígrados. Reemplace los medios el sexto día.

Al séptimo día, transfiera los medios que contienen partículas virales con una pipeta serológica de 10 mililitros a un tubo cónico de 50 mililitros antes de almacenarlo a cuatro grados centígrados. A continuación, añada ocho mililitros del medio 0,5%FBS a cada placa de celda. En el octavo día, recoja los medios celulares que contienen partículas virales y combínelos con la cosecha del día anterior en el tubo cónico de 50 mililitros.

En este paso, centrifugar el sobrenadante viral a 2000 veces G durante 10 minutos. A continuación, purifique los medios virales filtrándolos a través de un filtro de jeringa de baja unión a proteínas de 0,45 micrómetros. A continuación, agregue 5 veces la solución de polietilenglicol 6000 al medio.

Invierta el tubo varias veces para mezclar. Luego incube la mezcla viral a cuatro grados centígrados durante al menos 12 horas. En el noveno día, centrifuga la mezcla viral a 2500 veces G durante 45 minutos.

Después de 45 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a girarlo durante dos minutos. Seguido de la remoción del sobrenadante de nuevo. A continuación, vuelva a suspender el pellet añadiendo 320 microlitros de PBS estéril e incube en el agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Al día siguiente, alícuota el virus y congelar las alícuotas a menos 80 grados centígrados. Para comenzar este procedimiento, afeite la cabeza de un ratón anestesiado con el fin de prepararse para el lugar de la inyección. Dirija el 4% de isoflurano en el cono de la nariz.

A continuación, coloque el ratón en el instrumento estereotáctico. Inserte la barra de mordida en su boca hasta que sus dientes caigan en la ranura antes de asegurar las barras de los oídos. Asegúrese de que el cuerpo del animal esté sobre la almohadilla térmica y que la nariz esté situada en el cono de la nariz.

A continuación, confirme la anestesia dando un pellizco en el pie. A continuación, aplica lágrimas artificiales para lubricar los ojos. A continuación, frote la cabeza afeitada con povidona yodada y lidocaína.

Ahora haz una pequeña incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Seque el cráneo con un hisopo y aplique peróxido de hidrógeno para ayudar a visualizar el bregma. Con un telescopio de disección, localice el bregma en el cráneo y coloque la broca sobre él.

Establezca las coordenadas estereotácticas digitales de los planos X, Y y Z en cero. Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada en el eje Y caudal rostral, coloque la broca en lambda y nivele la cabeza de modo que la coordenada Z sea aproximadamente igual a cero en bregma y lambda. Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada a lo largo del eje X, coloque la broca en el punto medio entre bregma y lambda y mida las coordenadas Z a un milímetro del punto medio en ambos lados para asegurarse de que sean iguales.

A continuación, baje el isoflurano al 2% antes de colocar el taladro sobre las coordenadas deseadas y perfore el cráneo con cuidado. Después de perforar todos los agujeros, coloque la jeringa llena de virus en el instrumento estereotáctico. Centre la jeringa sobre el orificio y establezca la coordenada Z en el cráneo a cero.

Baje lentamente la jeringa hasta la profundidad Z más profunda y comience la inyección a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto utilizando un inyector estereotáctico. Una vez completada la inyección a la profundidad Z más profunda, espere un minuto antes de elevarla a la siguiente coordenada y comience la inyección nuevamente. Continúe este patrón hasta que se inyecten todas las coordenadas de inyección Z.

Después de la última inyección, espere dos minutos antes de retirar la jeringa. A continuación, retire el ratón del instrumento estereotáctico y suture el cuero cabelludo. Aplique lidocaína y crema antibacteriana en el sitio quirúrgico y administre analgésicos antes de transferir al animal a una cámara de recuperación calentada.

Esta imagen fluorescente de campo amplio 10X demostró que los retrovirus de alto título infectan a un gran número de células cuya morfología puede evaluarse mediante la expresión de fluoróforos. En este ejemplo, los virus que expresan GFP o mCherry se coinyectaron en el giro dentado. Usando un sistema de retrovirus, se puede usar un virus para hacer una manipulación genética marcada por GFP y otra manipulación marcada por mCHerry y luego evaluar los cambios únicos o aditivos debidos a cada virus.

Se trata de una reconstrucción en 3D de la extensión de la inyección en la que se trazaron contornos cerrados de la propagación viral en 21 secciones seriadas. A continuación, los trazados de contorno se alinearon para generar imágenes 3D para la cuantificación del volumen. La propagación viral total se muestra en verde y la propagación localizada del dendato se muestra en morado.

Esta imagen muestra que el virus se propaga a lo largo de la pista de la aguja y el cuerpo calloso, además de llenar el eje caudal rostral de la circunvolución dentada. Después de la inyección viral in vivo, utilizamos otros métodos como la histología, la electrofisiología o la microscopía en vivo para estudiar las consecuencias de la manipulación genética en el desarrollo neuronal.