Name: Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprende a diseñar y empaquetar virus CRISPR/Cas9 de alto título para inyección estereotáxica en cerebro de ratón. Este método permite estudiar genes implicados en trastornos neurológicos sin necesidad de crear animales transgénicos.

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<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
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<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
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<li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay unos pocos pasos críticos que son importantes para el empaquetado viral exitosa. la salud de la célula es crítica antes y durante la transfección, tal como células enfermas gran medida a reducir la cantidad de virus producido. Si la transfección y envasado tienen éxito, entonces 100% de las células debe expresar el fluoróforo y las células deben formar un sincitio funcional. En el paso 3.2.4, golpeando ligeramente el tubo es necesario para la transfección de alto título de manera eficiente, y el pH de la solución salina tamponada con HEPES debe ser exacta. Los maxi-preps que producen los plásmidos necesarios para el empaquetado viral deben ser extremadamente puro. A este punto, es útil a etanol precipitar la elución de ADN final y volver a suspender en tampón Tris-EDTA. También es muy importante para reducir la cantidad de suero a 2% o menos en los medios de comunicación que la cafeína se añade a en el Día 6 (etapa 3.4) antes de la recogida viral. Si el suero no se reduce, entonces el virus purificado final contendrá una cantidad no deseable de prot sueroein. El uso de polietilenglicol 6000, cuando la precipitación de las partículas virales excluye la necesidad de ultracentrifugación. También es importante señalar que los CRISPR que contiene virus Cas9 típicamente tienen un título de alrededor de 10 veces menos que los virus que contienen únicamente un fluoróforo. Para la cirugía estereotáxica, el uso de anestesia de inhalación permite el control rápido y preciso o la conciencia del animal en comparación con los anestésicos inyectables y permite la anestesia en un intervalo de edad más amplio. Es muy importante mantener los instrumentos quirúrgicos limpio y estéril, y la focalización reproducible requiere un posicionamiento preciso de la cabeza. Asegúrese de que no hay pitcheo o balanceo de la cabeza en el instrumento estereotáxico y que el cráneo se siente firmemente en su lugar. Puede ser útil para permitir que el cráneo se seque a fin de encontrar las suturas para determinar las coordenadas estereotáxica. Además, la velocidad y el volumen para cada estereotáxica coordenadas deben determinarse empíricamente. Esta técnica es limitante en que la propagación de un retrovirus o lenti- está restringido, especialmente en comparación con los virus adeno-asociados (AAV) .Por lo tanto, estos virus son valiosas cuando infectar una región del cerebro discretos, pero no para la infección general asociado con AAV utilizado para el análisis del comportamiento en animales. El uso de la cafeína en este protocolo aumenta en gran medida el título de estos virus, pero todavía no son tan altos como los títulos obtenidos en el empaquetamiento de AAV. Además, la integración estable sólo es una ventaja de la expresión fluoróforo, como CRISPR / Cas9 forma ediciones genómica estable incluso cuando se transfectaron transitoriamente y es posible que en curso de la expresión de la Cas9 y sgRNA eventualmente puede producir efectos fuera de destino. La expresión transitoria del sistema / Cas9 CRISPR con AAV es suficiente para producir cambios genómicos que se propagan a lo largo de las divisiones celulares, sin embargo, no se mantuvo la expresión fluoróforo. Creación de lenTi y retrovirus que utilizan el sistema de CRISPR / Cas9 impartirán la capacidad de dirigirse a cualquier nuevo gen en una amplia variedad de organismos. La eficiencia de la edición gen parece ser dependiente de la secuencia del RNA guía dirigidas a la escisión Cas9. Se ha determinado empíricamente que entre 10% y 80% de los clones contienen indeles después de la secuenciación infectado células Neuro2A. Actualmente se desconoce si las frecuencias indel calculados en células Neuro2A son un reflejo de aquellos en las neuronas. Guía de software de diseño de ARN tales como Benchling ahora incluyen una puntuación de &quot;en-blanco&quot; que pueden ser capaces de predecir la eficacia de una secuencia diana dada. Hasta qué punto estos índices &quot;en la diana&quot; son fiables las necesidades que se determinen empíricamente en las neuronas y otros tipos de células como el sistema CRISPR-Cas9 convierte implementadas más ampliamente. la producción de animales transgénicos basados ​​en lentivirus ha sido variable éxito con los informes de que los transgenes lentivirus entregado convierten SIlenced 11. CRISPR edición génica mediada de ADN se puede hacer pasar a través de la línea germinal para generar modelos de animales enteros. Por lo tanto, la edición genómica estable puede ser alcanzable, a pesar del silenciamiento de fluoróforos-virales y entregado transgenes Cas9. Esto puede proporcionar una plataforma eficiente para las alteraciones genómicas específicas. La entrega viral del sistema / Cas9 CRISPR, mientras que no requieren organismos transgénicos, es complementaria a esas técnicas. Por ejemplo, la inyección de tales partículas virales en un animal transgénico que expresa de manera inducible compuesto opto-o quimio-genética dependiente Cre y Cre transgenes debe facilitar los estudios complejos en la relación entre las manipulaciones genéticas y la actividad neuronal. Un segundo ejemplo es entregar estas partículas virales Cas9 / sgRNA en un knockout condicional en un intento de detectar interacciones gen-gen. Por último, otra vía interesante de esta investigación es la detección de fenotipos y compuestos terapéuticos en células derivadas del paciente, lo que puedeser utilizado para validar y descubrir las redes genéticas que se encuentran alteradas en diversas enfermedades.

Para el estudio de la base de la fisiología normal y patología de la enfermedad, existe una necesidad de manipular con precisión la expresión génica en organismos modelo. Para organismos modelo de mamíferos, esta se centra en gran medida en la creación y desarrollo de ratones transgénicos en el que un elemento genético de interés está flanqueado por sitios reconocidos por una recombinasa. Esto puede resultar en una manipulación específica del sitio de estos genes flanqueados. Si bien esto ha sido una estrategia exitosa, es tiempo y requiere muchos recursos; por ejemplo, la creación de un animal transgénico de triple que expresara un gen floxed, recombinasa Cre, y un gen indicador Cre requiere múltiples apareamientos y validación. En contraste, la inyección estereotáxica de la replicación de partículas virales defectuosas que codifican una proteína fluorescente y la recombinasa en un animal gen floxed no requiere la genotipificación complejo o estrategias de reproducción 1. Además, si una proteína fluorescente y expresar Cre virus es co-inyectados con un segundo virus encoding una proteína fluorescente diferente, a continuación, esto proporciona un control dentro de los tejidos para la manipulación genética dirigida. Si bien esta estrategia todavía requiere el uso de animales knock-in, las estrategias de ARN basado mediadas por virus eludir la necesidad de animales transgénicos. Por ejemplo, la inyección estereotáxica de virus deficientes en replicación que codifican una proteína fluorescente y un ARN de horquilla corta (ARNhc) puede utilizar la maquinaria de RNAi endógeno de la célula para dar lugar a una potente reducción de la transcripción de un gen de interés. Sin embargo, las estrategias de shRNA producen genes sutil derribos menudo resultan en fenotipos celulares modestas 2. Mientras que un knock-down puede ser fisiológicamente más relevantes para la disfunción gen heterocigoto, su robustez disminuido en comparación con un knock-out no es lo ideal para el descubrimiento de nuevos genes fenotípica. Una tercera técnica que ha surgido recientemente, el CRISPR (agrupado regularmente espaciadas Repita palindrómico corto) / Cas9 (CRISPR-asociadoproteína 9) del sistema, se basa en la expresión tanto de un pequeño ARN exógeno y una enzima de corte de ADN. El sistema / Cas9 CRISPR es una adaptación del sistema inmunológico procariotas que se desarrolló un método de identificación de extranjero, la invasión de ADN de los virus y la orientación para la degradación a través de la enzima Cas9 3,4. Esta poderosa técnica de edición genoma se puede usar para la creación de deleciones específicas, inserciones y mutaciones; y el siguiente protocolo describirá cómo hacer deleciones en un gen de interés con el fin de knockout su expresión in vivo. La enzima Cas9 debe ser expresada con una guía de ARN homólogo a la región de interés y contigua con un ARN andamio. Knockout de un gen utilizando esta técnica requiere la orientación Cas9 a una región específica en el genoma utilizando guía RNAs sintéticos (sgRNA), y la inducción de roturas de doble cadena (DSBs) en un sitio de interés. Estos DSBs son entonces reparados por la maquinaria de la célula de reparación de endógeno a través de extremos no homólogos de unión (NHEJ), que leanuncio a indeles que pueden producir pérdida de sentido o sin sentido mutaciones y por lo tanto pueden crear una pérdida de la expresión de la proteína funcional 5. Debido a que este sistema produce alteraciones genómicas, que sólo requiere la expresión transitoria de la Cas9 y sgRNA. Sin embargo, es deseable para un indicador fluorescente estable para identificar las células y su progenie manipulados de esta manera. Lenti- y retrovirus tienen la ventaja de integrar de forma estable de ADN de interés en las células huésped que mantienen la expresión a largo plazo y se transmiten a las células hijas durante la mitosis. Este protocolo describe el diseño y la producción de dos tipos de replicación defectuosa, los retrovirus alto título: el virus de la inmunodeficiencia humana partículas lentivirales derivados (lentivirus) y los basados ​​en virus murina Maloney Leucemia (retrovirus). Mientras tanto de estos virus son capaces de soportar grandes expresando estable de los transgenes, las partículas retrovirales sólo se integran en el genoma dula división celular anillo con la degradación de la envoltura nuclear, y por lo tanto se puede utilizar como una herramienta para etiquetar y células fecha de nacimiento 6. Mientras que los lentivirus tienen una reputación de ser relativamente baja titulación 7, esta metodología, incluyendo el uso de la cafeína durante la recogida de 8 viral, habitualmente produce títulos de 10 y 9 10 10 partículas / ml. Otra ventaja de lenti- y los retrovirus es la tolerancia en caso de grandes insertos. La siguiente colección de protocolos describe el procedimiento para diseñar un lenti o retrovirus que codifica un informador fluorescente, sgRNAs, y Cas9 para utilizar el sistema / Cas9 CRISPR para modificar ADN, así como expresar una proteína fluorescente. Neurocirugía estereotáxica ratón es un método valioso para la inyección de virus in vivo para estudiar la morfología, función y conectividad de las neuronas infectadas. La infección viral en las neuronas se puede utilizar para manipular los niveles de expresión durante un período prolongado de time, como en todo el desarrollo y la expresión pueden ser controlados con precisión mediante el uso de diversos sistemas inducibles de drogas y expresión específica impulsada Cre. Este protocolo particular explica cómo inyectar un virus que expresa un sgRNA y Cas9 a octavos de final de un gen de interés en el cerebro de un ratón adulto. Los ratones se recuperan muy rápidamente de este procedimiento y la expresión del transgén viral se puede ver dentro de las 48 horas después de la inyección. Sin embargo, la expresión fluoróforo parece aumentar en el transcurso de semanas que resultan en niveles máximos cerca de 3 semanas después de la infección. Los ratones que se someten a inyección estereotáxica viral se pueden utilizar para el comportamiento, la electrofisiología, o estudios morfológicos. En general, el propósito de estos procedimientos es demostrar cómo un gen knockout en el cerebro de ratón adulto utilizando cirugía estereotáxica y un virus que expresa un sgRNA específico y Cas9.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Lista de Reactivos de Cultivo Celular</td></tr><tr><td>293FT</td><td>línea celular Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>Para Lentivirus</td></tr><tr><td>Línea celular 293GP</td><td>Clontech</td><td>631458</td> Para la Modificación <td></td></tr><tr><td>de DMEM (IMDM) de Retrovirus Iscove's Corning</td><td>&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>IMDM completo con 10% de FBS, 1% de NEAA, 1% de L-Gln y 1% P/S</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina/estreptomicina, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno 10&nbsp; placa cm</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lista de reactivos de transfección</td></tr><tr><td>5&nbsp; ml tubos de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio dihidratado (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Prepare una solución de 2,5 M en cloruro de sodio (NaCl) ddH2</td></tr><tr><td></td><td>O Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x solución salina tamponada HEPES (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95&nbsp; g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (¡exacto!)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Unidad de filtro de jeringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0,45 y micro; Unidad de filtro de jeringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>60 cc L/L Jeringa</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Cónico</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>polietilenglicol&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo donante</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP, conejo, 488 conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reactivos para cirugía estereotáxica</fuerte></td></tr><tr><td>Jeringa veterinaria uso veterinario Jeringa T.B. solo 1 cc Luer slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS Hojas de</td> bisturí de <td></td></tr> acero inoxidable <tr><td>con isoflurano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>ungüento</td> de lágrimas artificiales JOR580S <td></td></tr><tr><td></td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>solución salina normal&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>aplicadores con punta de algodón</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica triple&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; Agujas Soft Pack 25 g x 5/8"</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suturas de seda</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

proyectos, embalaje y entrega de alto título de crispr retro y lentivirus vía estereotáxica inyección

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Los lentivirus o retrovirus defectuosos de replicación son capaces de integrar transgenes de manera estable en el genoma de una célula huésped infectada. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada para codificar proteínas fluorescentes, controladores optogenéticos o quimiogenéticos de la actividad celular o expresión heteróloga de genes humanos en organismos modelo. Estos virus también se han utilizado con éxito para administrar recombinasas a sitios objetivo relevantes en animales transgénicos, o incluso para administrar pequeños ARN de horquilla o micro con el fin de manipular la expresión génica. Si bien estas técnicas han sido fructíferas, se basan en animales transgénicos (recombinasas) o con frecuencia carecen de alta eficacia y especificidad (shRNA/miRNA). Por el contrario, el sistema CRISPR/Cas utiliza una nucleasa Cas exógena que se dirige a sitios específicos del genoma de un organismo a través de un ARN guía exógeno para inducir roturas de doble cadena en el ADN. A continuación, estas roturas se reparan mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), produciendo mutaciones de inserción y deleción (indel) que pueden dar lugar a mutaciones deletéreas con cambio de sentido o sin sentido. Este manuscrito proporciona métodos detallados para el diseño, la producción, la inyección y la validación de partículas de virus individuales lenti/retro que pueden transducir neuronas de manera estable para expresar un indicador fluorescente, Cas9 y sgRNAs para eliminar genes en un organismo modelo.

Tras el &quot;Protocolo para el diseño de una Guía de Strand (sgRNA) para CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, oligos dirigidas a una secuencia particular se insertan en el vector de clonación PXL aguas abajo del promotor Hu6 y aguas abajo de un andamio guía de ARN usando los sitios de clonación BbsI (Figura 1, paso 1). Este sgRNA se escinde luego de PXL y se inserta en la columna vertebral pRubi usando los sitios BstBI y PacI (Figura 1, paso 2). Por último, otro sgRNA clonado en PXL se puede colocar aguas abajo de la primera guía de pRubi-Guía 1 (figura 1, paso 3), dirigido a otra área de la genética y aumentar las posibilidades de un golpe de gracia a través de NHEJ. Verificación de los constructos correctos debe ser determinado por análisis de secuencia. Una vez hecha esta construcción, puede ser empaquetado en un virus siguiendo el &quot;Protocolo para Retro / Lentiviral producción- CaPO4 el método&quot;. embalaje exitosa se confirmó por la infección de virus en células HEK293 con el fin de titular la virus. Si no hay expresión fluoróforo entonces no era probable un error durante el empaquetado del virus. La Figura 2 es un resultado representativo de 2 retrovirus, uno que expresan GFP y el otro mCherry expresar, co-inyecta en el giro dentado del ratón neonatal (7 días de edad) y la imagen de 21 días después de la inyección. Etiquetado de neuronas con mCherry o GFP permite la evaluación morfológica de diversas manipulaciones genéticas en el mismo tejido, donde un virus puede expresar una CRISPR mediada / Cas9 KO y el otro un virus control, que expresan únicamente un fluoróforo. inyección estereotáxica permite selectividad anatómica precisa como se demuestra por la infección discreta de las coordenadas destinados, el giro dentado. Al analizar las secciones del cerebro para la infección, es importante para mantener el tejido circundante hasta que se determina que la región anatómica correcta estaba infectado. Si no hay ningún signo de infección, entonces es posible que la inyección se produjo en una región de un vecinod puede ser identificado en las secciones de los alrededores. También puede ser útil para localizar el trayecto de la aguja para encontrar la zona de inyección exacta. Pseudotyped virus VSVG rara vez se diseminan fuera de los márgenes de la circunvolución dentada cuando se inyecta in vivo, y tienden a extenderse a lo largo de las células de eje infectar caudal / rostrales a lo largo de todo el giro dentado, tal como se analizó por la reconstrucción 3D (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Estrategia de clonación para el plásmido pRubi-Guía 1-Guía 2-retroviral CRISPR Esta estrategia es idéntica para los plásmidos de lentivirus basados-FU. oligos sgRNA se recuecen y se insertan en PXL usando los sitios de clonación BSBI. Después de la secuenciación para asegurar que el sgRNA se inserta con éxito en PXL, digerir el plásmido con BstBI y PacI. El inserto que se deja caer hacia fuera (cuadro negro) se clona en la espalda b viraluno (negro líneas de puntos) pRubi-Guía 1 CRISPR. Un segundo sgRNA también se puede insertar en PXL y se digirió a cabo utilizando la enzima PacI. Esto se clona en el vector de CRISPR pRubi-Guía 1 (líneas de puntos rojos), utilizando el sitio PacI. El plásmido resultante contiene entonces ambas cadenas de guía, así como los elementos necesarios virales, promotores y fluoróforos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. De inyección retroviral del giro dentado del ratón Los retrovirus que expresan mCherry (rojo) o GFP (verde) se inyectaron en el giro dentado de un ratón p7. 21 días más tarde, los ratones fueron perfundidos y los cerebros se seccionaron y se tiñeron para GFP y mCherry. (A) Una imagen fluorescente de campo amplio 5X muestra el prECISIÓN de la inyección giro dentado y la especificidad de etiquetado dentado gyrus neuronas granulares. La morfología del hipocampo puede ser visto a través de la tinción (azul) Dapi. La barra de escala mide 200 micras. (B) Una imagen fluorescente 10X de gran campo demuestra que estos lentivirus alto título infectan un gran número de células cuya morfología se puede acceder a través de la expresión fluoróforo. La barra de escala mide 100 micras. (C) Los virus que expresan GFP o mCherry fueron co-inyectados en el giro dentado. El uso de un sistema de retrovirus, se puede utilizar un virus para hacer una manipulación genética marcada por GFP y otra manipulación marcado por mCherry, y luego evaluar los cambios individuales o aditivo debido a cada virus. La barra de escala mide 10 micras. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Anatómico propagación de la inyección lentiviral co-inyección estereotáxica<html> de un virus GFP-shPten y un virus de control mCherry en el cerebro de un adulto Pten loxP / + ratón dio como resultado una propagación viral a lo largo de todo el eje rostral / caudal del giro dentado del hipocampo. Esto se muestra en una reconstrucción en 3D de la extensión de la inyección en el que contornos cerrados de la propagación viral se trazaron más de 21 secciones en serie (Z = 50 micras / sección) utilizando software de reconstrucción. Los trazados de contorno fueron alineados para generar las imágenes en 3D para la cuantificación del volumen. La propagación viral total se muestra en verde (volumen = 54.730.800 m 3) y la propagación dentado-localizada se muestra en morado (volumen = 27.275.200 m 3). El virus se propaga a lo largo del trayecto de la aguja y el cuerpo calloso en la intersección de la pista de la aguja además de llenar el eje rostral / caudal del giro dentado. La barra de escala mide 200 micras. Les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Suplementario vídeo 1. Diseño de sgRNAs para clonar en estructura principal retroviral y lentiviral. En este ejemplo de diseño RNA guía sintética (sgRNA), la secuencia genómica de ratón CHD8 se descarga desde NCBI. El codón de iniciación y la estructura exón se visualizaron después de Vector NTI. Esto nos permite copiar la región genómica alrededor del primer exón codificante y entramos en esta secuencia en Benchling. Benchling nos permite visualizar todas las sgRNAs potenciales en la región. Además, después de lo que indica la región genómica que tenemos de entrada, Benchling nos mostrará las puntuaciones en la diana y fuera de objetivo para cada guía de ARN. El usuario puede entonces seleccionar la guía de ARN con las puntuaciones más altas dentro y fuera de objetivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a>

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir a los investigadores diseñar y empaquetar virus que expresen una proteína fluorescente, CAS9 y ARNsg, y luego inyectarlos estereotácticamente en el cerebro del ratón.Este método puede ayudar a responder preguntas específicas en el campo de la neurociencia, como el papel de los genes que subyacen a los trastornos neurológicos y neurodesarrolladores. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de manipular genes específicos sin necesidad del proceso intensivo en tiempo y recursos que implica la creación de animales genéticamente modificados.Antes de preparar las células, utilice un sitio web para generar una cadena guía de 20 nucleótidos o un ARNsg que se utilizará para diseñar oligonucleótidos de cadena sencilla. Después de pedir los oligonucleótidos y usarlos para crear un plásmido final según se describe en el protocolo escrito, continúe pipeteando todas las células descongeladas de un criotubo hacia un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue 2 mililitros de IMDM completo equilibrado con CO2 y precalentado. Luego, centrifugue las células durante cinco minutos a 500 veces g. Posteriormente, aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de IMDM completo. Siembre las células en una placa de cultivo celular de 10 cm e incúbelas durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora con 5% de dióxido de carbono. 24 horas después del siembra, cambie el medio aspirando el medio existente y agregando 10 mililitros de IMDM precalentado. Pase las células una vez que estén confluentes. Para pasar las células, aspire el medio y lave la placa con 5 mililitros de PBS. Luego, agregue un mililitro de tripsina al 0,25% a la placa e incube a 37 grados Celsius hasta que las células se desprendan de la placa.A continuación, agregue 0.5 mililitros de IMDM para neutralizar la reacción de la tripsina y aspire las células hacia un tubo de 1.5 mililitros. Luego, centrifugue las células a 500 ×g durante cinco minutos. Reuspenda las células en un mililitro de IMDM y diluya 10 microlitros de células en 90 microlitros de PBS.Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células y replantee las células con IMDM completo. El día cinco, cambie el medio dos horas antes de la transfección y asegúrese de que haya exactamente 10 mililitros de medio en la placa de 10 centímetros. A continuación, prepare los reactivos de transfección para dos placas utilizando dos tubos de poliestireno redondos de 5 mililitros. Etiquete el primer tubo como ADN y el segundo tubo como HBS 2X. Luego, ajuste la concentración de ADN a un microgramo por microlitro en Tris EDTA a pH 7,4. Para preparar los reactivos de transfección para lentivirus y retrovirus, agregue lentamente los componentes requeridos al tubo etiquetado como ADN mientras golpea continuamente el tubo para mezclar. A continuación, agregue un mililitro de HBS 2X al tubo etiquetado como HBS 2X. Luego, agregue lentamente un mililitro del contenido del tubo de ADN al tubo de HBS 2X, una gota a la vez. Golpee continuamente el tubo de HBS 2X y observe el precipitado de fosfato de calcio formado tras cada gota para asegurar la creación exitosa de los complejos de transfección. Posteriormente, incube el tubo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, agregue un mililitro del reactivo de transfección en gotas lentas a cada placa celular de 10 centímetros e incube las células durante la noche a 37 grados Celsius. Cambie el medio el día seis.El día siete, transfiera el medio que contiene partículas virales con una pipeta serológica de 10 mililitros a un tubo cónico de 50 mililitros antes de almacenarlo a cuatro grados Celsius. Luego, agregue ocho mililitros del medio con 0,5 % de FBS a cada placa de células. El día ocho, recolecte el medio celular que contiene partículas virales y combínelo con la cosecha del día anterior en el tubo cónico de 50 mililitros.En este paso, centrifugue el sobrenadante viral a 2000 ×g durante 10 minutos. Posteriormente, purifique el medio viral filtrándolo a través de un filtro de jeringa de baja unión a proteínas de 0,45 micrómetros. A continuación, agregue solución de polietilenglicol 6000 5X al medio. Invierta el tubo varias veces para mezclar. Luego, incube la mezcla viral a cuatro grados Celsius durante al menos 12 horas.En el día nueve, centrifugue la mezcla viral a 2500 veces G durante 45 minutos. Después de 45 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a centrifugar durante dos minutos. A continuación, elimine nuevamente el sobrenadante. Posteriormente, re suspenda el precipitado agregando 320 microlitros de PBS estéril e incube en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al día siguiente, alícuote el virus y congele las alícuotas a menos 80 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, afeite la cabeza de un ratón anestesiado con el fin de preparar el sitio de inyección. Dirija un 4% de isoflurano hacia el cono nasal. A continuación, coloque al ratón en el instrumento estereotáxico. Introduzca la barra de mordida en su boca hasta que sus dientes caigan en la ranura antes de fijar las barras oticas. Asegúrese de que el cuerpo del animal esté sobre la almohadilla calefactora y que su nariz se encuentre dentro del cono nasal.A continuación, confirme la anestesia aplicando una compresión en la pata. Luego, aplique lágrimas artificiales para lubricar los ojos. Posteriormente, limpie con hisopo la cabeza afeitada con povidona yodada y lidocaína.Ahora realice una pequeña incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Seque el cráneo con un hisopo y aplique peróxido de hidrógeno para ayudar a visualizar el bregma. Utilizando un microscopio de disección, localice el bregma en el cráneo y coloque la broca encima de este.Establezca las coordenadas estereotácticas digitales de los planos X, Y y Z en cero. Para asegurar que la cabeza esté nivelada en el eje Y rostrocaudal, coloque la broca sobre el punto lambda y nivele la cabeza de manera que la coordenada Z sea aproximadamente igual a cero en bregma y lambda. Para garantizar que la cabeza esté nivelada a lo largo del eje X, coloque la broca en el punto medio entre bregma y lambda y mida las coordenadas Z a un milímetro del punto medio en ambos lados, asegurándose de que sean iguales.A continuación, reduzca el isoflurano al 2 % antes de colocar el taladro sobre las coordenadas deseadas y perfore cuidadosamente el cráneo. Después de hacer todos los orificios, fije la jeringa cargada con el virus al instrumento estereotáxico. Centre la jeringa sobre el orificio y establezca la coordenada Z en el cráneo como cero. Baje lentamente la jeringa hasta la profundidad Z más profunda e inicie la inyección a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto utilizando un inyector estereotáxico. Una vez completada la inyección en la profundidad Z más profunda, espere un minuto antes de elevarla hasta la siguiente coordenada e inicie nuevamente la inyección. Continúe con este patrón hasta que se hayan inyectado todas las coordenadas Z.Después de la última inyección, espere dos minutos antes de retirar la jeringa. Luego, retire al ratón del instrumento estereotáxico y sutúre el cuero cabelludo. Aplique lidocaína y crema antibacteriana en el sitio quirúrgico y administre medicación analgésica antes de transferir al animal a una cámara de recuperación calentada.Esta imagen fluorescente de campo amplio 10X demostró que los retrovirus de alto título infectan un gran número de células cuya morfología puede evaluarse mediante la expresión de fluoróforos. En este ejemplo, se inyectaron conjuntamente virus que expresan GFP o mCherry en el giro dentado. Mediante un sistema de retrovirus, se puede utilizar un virus para realizar una manipulación genética marcada con GFP y otra manipulación marcada con mCherry, y luego evaluar los cambios individuales o aditivos provocados por cada virus.Esta es una reconstrucción 3D del alcance de la inyección en la que se trazaron contornos cerrados de la diseminación viral a lo largo de 21 secciones seriadas. Los trazos de contorno luego se alinearon para generar imágenes 3D destinadas a la cuantificación del volumen. La diseminación viral total se muestra en verde y la diseminación localizada en el giro dentado se muestra en morado. Esta imagen muestra el virus propagándose a lo largo del trayecto de la aguja y el cuerpo calloso, además de llenar el eje rostral-caudal del giro dentado. Tras la inyección viral in vivo, utilizamos otros métodos como histología, electrofisiología o microscopía en vivo para estudiar la consecuencia de la manipulación genética en el desarrollo neuronal.

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Investigación

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Neurociencia

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

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