La extracción de las métricas para los sistemas de raíces de tres dimensiones: volumen y de superficie Análisis de In-suelo de rayos X de tomografía computarizada de datos

El objetivo general de este procedimiento es extraer información cuantitativa sobre las raíces de las plantas a partir de datos de tomografía computarizada de rayos X en el suelo. Este método de investigación de la estructura de las raíces de las plantas vivas puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología, como la forma en que las plantas responden a las condiciones ambientales cambiantes como la sequía, las actividades microbianas, etc. La principal ventaja de esta técnica es que no es invasiva, por lo tanto, nos permite estudiar las plantas en su entorno nativo, el suelo.

La demostración visual de este método es valiosa, ya que el procedimiento implica numerosos pasos, incluidas las imágenes tomográficas, la reconstrucción de datos y el análisis, que pueden ser oscuros sin ayuda visual. Para comenzar, coloque una planta en maceta en el manipulador de muestras del escáner de tomografía de rayos X a la distancia deseada para la ampliación del objetivo. Para una planta en un soporte de dos pulgadas de diámetro, coloque una muestra a una distancia de fuente de aproximadamente tres pulgadas.

En el software de control de instrumentos, establezca la configuración de potencia de rayos X en 85 kilovoltios y 190 microamperios. A continuación, ajuste el tiempo de exposición a un segundo para obtener una mejor relación señal/ruido. Establezca el número de proyecciones en 3.142 y el número de fotogramas por proyección en cuatro para obtener buenas estadísticas de datos.

Usando los parámetros de escaneo que acaba de configurar, seleccione la pestaña "Corrección de sombreado". A continuación, haga clic en "Nuevo" y asigne un nombre al archivo de corrección de sombreado. A continuación, haga clic en "Presentar" para confirmar las nuevas condiciones.

A continuación, haga clic en Crear" y haga clic en Aceptar" para usar dos imágenes de referencia. A continuación, haga clic en Generar. A continuación, cuando aparezca la ventana emergente de advertencia, retire físicamente la muestra de la trayectoria del haz antes de hacer clic en Aceptar. Ahora se ejecutará la corrección de sombreado.

Ahora, haga clic en la pestaña "Adquisición". Asigne un nombre al archivo de datos y, a continuación, seleccione "Ninguno" para el filtro de rayos X. Asegúrese de que la casilla de verificación "Minimizar artefactos de anillo" esté marcada para que la muestra se gire en pasos angulares mientras se adquieren las imágenes de proyección.

Finalmente, inicie el escaneo haciendo clic en el botón Adquirir". Después de adquirir los datos sin procesar, cárguelos en el programa de reconstrucción. Compare la primera y la última imagen haciendo clic en "Parpadear" para asegurarse de que el espécimen no se movió o que la configuración del escaneo no cambió durante la adquisición de datos.

Calcule el centro de rotación, o COR, seleccionando la pestaña "Centro de rotación" y utilizando las opciones Búsqueda automática de "COR con precisión de alta calidad" y selección de corte "Dual" para el cálculo de COR. Luego, haga clic en Inicio"para ejecutar el cálculo. Una vez encontrado el COR, haga clic en la pestaña "Volumen" para seleccionar la muestra que se va a reconstruir.

Utilice las miniaturas para editar las ventanas de selección de volumen. A continuación, haga clic en Inicio"para realizar la reconstrucción y crear el archivo de volumen que contiene datos 3D. Para preparar una pila de imágenes procesables de RooTrak, cargue el archivo de volumen en ImageJ haciendo clic en Archivo, Importar, Sin procesar y, a continuación, seleccionando el archivo de volumen.

Para optimizar el contraste de la imagen entre la raíz y la tierra, haga clic en la pestaña "Imagen", luego elija Ajustar brillo/contraste y seleccione Automático. Cuando la región de interés es visible en claro, la configuración se considera optimizada. Guarde las imágenes como una pila de imágenes en formato JPEG, BMP o PNG haciendo clic en "Guardar como" y eligiendo Secuencia de imágenes.

Para procesar en RooTrak para segmentar la raíz, seleccione la pestaña "Herramientas" y elija Rastreador. A continuación, haga doble clic en el área de entrada blanca del cuadro de diálogo para cargar una pila de imágenes. Una vez cargadas las imágenes, elija la pestaña "Rastreador" y establezca los puntos de inicialización dentro de la raíz haciendo clic en varios puntos dentro de cada una de las secciones de raíz pertinentes visibles en la parte superior de la vista de los datos de volumen.

Establezca el parámetro de rastreo suavizado en 0,3 y similitud en 0,8. Haga clic en el campo debajo de "Directorio de salida" para elegir una carpeta de archivos. Luego, haga clic en Seleccionar carpeta" y haga clic en Inicio.

A continuación, se ejecutará la función de seguimiento. Esto seguirá la raíz desde el corte superior de la imagen hasta el corte inferior. Después de abrir y ver los datos de volumen, seleccione el número de segmentos de acuerdo con el volumen de datos utilizable.

En el ejemplo que se muestra aquí, el seguimiento se detuvo en 200 cortes, lo que equivale a una profundidad de 6,2 milímetros, donde los límites de las raíces se volvieron mal definidos. Para llevar a cabo el análisis de volumen y superficie en ImageJ, convierta la pila de imágenes de RooTrak a un formato de imagen binaria seleccionando Proceso, Binario y, a continuación, Crear binario. Utilice el complemento de código abierto de ImageJ, BoneJ, para crear la malla triangular seleccionando Complementos, BoneJ y, a continuación, Isosuperficie.

En la ventana de opciones que se abre, establezca "Remuestreo" y Umbral" en seis y 120, respectivamente. Luego, marque Mostrar superficie" y presione el botón OK". En el visor 3D que se abre, haga clic en la pestaña Archivo.

A continuación, haga clic en "Exportar superficies" y guárdelo como binario STL. Por último, abra IMESHJ. Cargue el archivo STL haciendo clic en Seleccionar archivo STL" e ingrese el tamaño del vóxel en micras.

Haga clic en Ingresar tamaño de vóxel "e ingrese 31 micras, luego haga clic en Aceptar" dos veces. Haga clic en "Calcular área de superficie" para adquirir el área total de la superficie de la raíz de la muestra en milímetros cuadrados. Luego, haga clic en "Calcular volumen" para obtener el volumen total de la raíz de la muestra en milímetros cúbicos.

Aquí se muestra el espécimen, que consta de dos tallos de la semilla de la pradera de pastos nativos, Sporobolus heterolepis, y el suelo original que la rodea. El tamaño del vóxel de los datos reconstruidos generados fue de aproximadamente 31 micras cúbicas. Después de crear una pila de imágenes y aumentar el contraste entre las raíces y el suelo, los datos reconstruidos mostraron que la raíz y algunos de los componentes del suelo tienen factores de atenuación de rayos X muy similares, lo que resulta en poco o ningún contraste en escala de grises en las imágenes.

Esta figura muestra un punto de inicialización representativo que se seleccionó dentro de una sección raíz pertinente visible en el segmento superior de los datos de volumen. Utilizando los parámetros de RooTrak descritos en este vídeo, RooTrak segmentó con éxito los aproximadamente 200 segmentos de datos de volumen seleccionados, lo que equivalía a una profundidad de 6,2 milímetros. La segmentación de la raíz también se muestra en esta animación.

Aquí, ImageJ se utilizó para generar una isosuperficie de malla triangular del volumen 3D a partir de los datos producidos por RooTrak. La configuración predeterminada utilizada produjo una isosuperficie detallada de una manera relativamente rápida. Finalmente, utilizando IMESHJ, el área superficial se calculó como 351.87 milímetros cuadrados, y el volumen calculado fue de 47.27 milímetros cúbicos.

Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar seguir todos los procedimientos de seguridad. También es importante recordar que la segmentación de las raíces solo es posible si hay suficiente contraste de rayos X entre la raíz y el suelo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden obtener imágenes y analizar otros especímenes con estructuras ramificadas como hojas de árboles, pulmones animales y humanos, etc., para responder preguntas adicionales, como cómo crecen los tejidos vivos o cómo toleran ciertas condiciones. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la ciencia de las plantas exploren cosas como la resistencia a la sequía en plantas modelo como Brachypodium. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de un espécimen de planta mediante tomografía, cómo visualizar la estructura de su raíz y extraer información cuantitativa sobre la raíz a partir de datos de tomografía computarizada de rayos X en el suelo.

No olvide que trabajar con instrumentación de rayos X puede ser peligroso, y se deben seguir los procedimientos de seguridad pertinentes al intentar esta técnica.