Name: analizando En Vivo Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a analizar la migración celular in vivo mediante trasplante de células e imagen en tiempo real en embriones de pez cebra Danio rerio. Este método permite estudiar la función de genes candidatos en procesos de desarrollo.

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Agradecemos a F. Bouallague y al animalario IBENS por su excelente cuidado del pez cebra. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, las becas N° SFI20111203770 y N° PJA 20131200143.

Nota: La Figura 1 presenta el esquema del protocolo. 1. Preparación de las agujas para inyección y Trasplante Nota: Las agujas se puede preparar en cualquier momento y se almacena. Mantenerlos en una placa de Petri, en una banda de pasta de modelar. Sellar la placa con parafilm para proteger del polvo. <ol><li> Para agujas de inyección, tirar de un capilar de vidrio (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,58 mm, sin filamento (véase la lista de materiales)) con un extractor de micropipeta (véase la lista de materiales). Prefiero agujas cortas y delgadas (sección cónica de unos 5 mm), ya que son más eficientes para perforar el corion. Nota: Las agujas de inyección son de un solo uso. </li><li> Aguja para el trasplante de células <ol><li> Tirar de un capilar de vidrio (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,78 mm, sin filamento (véase la lista de materiales)) con un extractor de micropipeta. </li><li> Tcantar una microforge (véase la lista de materiales), cortar la punta de la aguja en el punto donde el diámetro interior es de 35 micras (un poco más que el diámetro de las células a ser trasplantado). </li><li> Bisel de corte de la extremidad del capilar con un microgrinder (véase la lista de materiales) con un ángulo de 45 °. </li><li> Opcionalmente, tirar de una lengüeta en el extremo de la aguja usando un microforge. Para ello, toque el filamento caliente con la punta del bisel y tire de ella fuera rápidamente, creando una lengüeta que puede ayudar a penetrar en el embrión. </li><li> Montar la aguja en un soporte de aguja colocada en una jeringa. El uso de la jeringa, enjuagar el interior de la aguja tres veces con ácido fluorhídrico 2% para eliminar los residuos de vidrio, y luego enjuagar tres veces con acetona. Precaución: ácido fluorhídrico es tóxico, manipular bajo el capó, con guantes. Nota: Las agujas de trasplante de células pueden ser utilizadas varias veces. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de laVajilla para inyección y Trasplante de células <ol><li> Heat 50 ml de embrión medianas 11 que contienen 0,5 g de agarosa en un microondas durante 1 min a plena potencia para obtener 1% de agarosa en medio de embrión. Enfriar el gel de agarosa a aproximadamente 60 ° C y se vierte los 50 ml en una placa de Petri 90 mm. Colocar en la superficie del gel de un molde especialmente diseñado (véase la lista de materiales), o bien con las líneas para el plato inyección o con pozos para el plato trasplante de células. <ol><li> Observar el flotador en el molde de agarosa, si la agarosa no esté demasiado caliente. Después de establecer el gel de agarosa, se desmolda con unas pinzas (Figura 2 A - B). Nota: Los platos se pueden almacenar a 4 ° C, hasta unas pocas semanas. Mantenerlos en una caja cerrada húmeda, para evitar la desecación. </li></ol></li><li> Coloque el plato en una incubadora de 28 ° C 30 minutos antes de su uso. </li></ol> 3. Recolección de embriones e Inyección <ol><li> Inyección de la solución Preparación Nota: dominio de unión a actinade la proteína 140 (ABP-140), tales como Lifeact unido a mCherry unión a la actina de levadura (referido como ABP140-mCherry) se utiliza para visualizar la actina polimerizada dentro de la célula, con el fin de analizar la actividad de protrusión. Añadir otro compuesto para probar la función de un gen candidato (por ejemplo, mRNA de constructo negativo o constitutivamente activa dominante, o oligonucleótidos morfolino). Para evaluar las funciones de sin1 como se describe en los resultados (Figura 3), se utilizaron oligonucleótidos morfolino. Como control, se utilizó una morfolino idéntica a la morfolino sin1 pero por 5 nucleótidos distribuidos a lo largo de la secuencia de modo que este morfolino de control no coincide con el ARN diana. <ol><li> Sin1 descongelación y morfolinos de control 5-desajuste (2 mM de soluciones madre), y ABP140-mCherry ARNm en hielo. Añadir 375 ng de ARNm (75 ng / l final) y 0,75 l de morfolino de control sin1 o 5-desajuste (0,3 mM final) en tampón Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, Ca 0,6 mM (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), para llegar a un volumen total de 5 l. </li></ol></li><li> Colección de Embriones Nota: para establecer este experimental hasta dos embriones de donantes y de acogida son transgénico, que expresa la GFP bajo el control de la goosecoid (SGC), el promotor con el fin de visualizar la placa prechordal prospectivo 11. <ol><li> Recoger Tg (SGC: GFP) huevos. Colocar aproximadamente 80 huevos en un plato de 90 mm de Petri llena de medio de embrión y se incuba a 28 ° C. </li></ol></li><li> Inyectar embriones de donantes <ol><li> Bajo un microscopio estereoscópico, apriete suavemente los embriones obtenidos con fórceps en las líneas de un plato lleno de inyección de medio de embrión. El uso de pinzas, orientar los embriones con las células hacia la parte superior. Coloque el plato de inyección en la incubadora a 28 ° C hasta que los embriones han llegado a la etapa de 4 células (1 hora después de la fecundación). </li><li> Cargar una aguja de inyección con 2 l desolución de inyección. Insertar la aguja en un soporte de la aguja (véase la lista de materiales) que se coloca en un micromanipulador (véase la lista de materiales) y se conecta con politetrafluoroetileno tubo (PTFE) (véase la lista de materiales) a una Transjector aire (véase la lista de materiales ). </li><li> Abra el capilar tocando suavemente la punta con unas pinzas finas. Si es necesario, cortar el capilar abierta pellizcando su extremidad. </li><li> Introduzca una de las cuatro células con la aguja e inyectar la solución dentro de la célula con el fin de llenar el 70% del volumen de la celda (2 nl). Inyectar 30 embriones. Nota: Obtención de la aguja en la célula puede ser difícil, ya que la membrana plasmática es suave. Con el objetivo de la unión entre la célula y la yema facilita la penetración de la aguja. </li><li> Colocar los embriones en el 28 ° C incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa de esfera (4 horas después de la fecundación). </li></ol></li></ol> 4. Preparación de los embriones para la célula Transplantation <ol><li> Preparar 20 ml de medio de embrión con 200 l de penicilina / estreptomicina (véase la lista de materiales) (penicilina / estreptomicina EM). </li><li> Dechorionation de los embriones en la etapa de esfera (4 horas después de la fecundación) Nota: Los embriones dechorionated son muy frágiles y va a explotar en caso de contacto con el aire o plástico. Ellos por lo tanto necesitan ser colocados en placas de agarosa-revestido, y se transfiere con pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego. <ol><li> Utilizando una pipeta Pasteur de plástico, transferir embriones huésped recogidos en el paso 3.2 y embriones de donantes inyectados en la etapa 3.3 en dos placas de Petri de 35 mm recubiertas de agarosa al 1% en medio de embrión y llenos de penicilina / estreptomicina EM. Mantener embriones de acogida y los embriones de donantes en dos platos separados. </li><li> extraer manualmente los embriones de sus chorions con unas pinzas finas (véase la lista de materiales). </li><li> Colocar los embriones en la incubadora a 28 ° hasta que hayan alcanzado la etapa de protección (6 horas después de la fecundación). </li></ol></li></ol>5. El trasplante de la célula <ol><li> Organizar los embriones para el trasplante de células. <ol><li> Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, seleccione embriones de donantes que expresan ABP140-mCherry (rojo) dentro de la protección (verde). </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de los embriones en los pocillos de la placa de trasplante de células lleno de Pen / Strep EM. Colocar los embriones de acogida en una fila y los embriones de donantes en la fila vecina. </li><li> El uso de una pestaña, orientar cuidadosamente los embriones con el escudo arriba. Nota: la posición de la pantalla se puede evaluar mediante la expresión de GFP o anatómicamente. </li></ol></li><li> Trasplante de configuración del sistema de seguimiento. Nota: El sistema de trasplante se compone de un soporte de aguja (véase la lista de materiales) conectado con un tubo de PTFE (véase la lista de materiales) y un conector de tubo (véase la lista de materiales) a una jeringa Hamilton equipada con un micro-unidad (consulte la lista de Materiales). El soporte de la agujaestá montado en un micromanipulador de 3 vías (véase la lista de materiales). <ol><li> El uso de un soporte de aguja unida a una jeringa, enjuague la aguja para el trasplante de células con 70% de etanol. Seca al absorber el aire en la aguja. No dejar secar por soplado, ya que esto puede resultar en polvo se queda pegada en la parte cónica de la aguja. </li><li> Insertar la aguja en el soporte de aguja conectada a la jeringa Hamilton, con el bisel hacia arriba. </li></ol></li><li> Escudo-a-escudo Trasplante de células <ol><li> Introduzca el escudo de un embrión donante con la aguja y el trasplante de elaborar unos 10-20 células marcadas con ABP140-mCherry. Evita cuidadosamente dibujo yema. </li><li> Transplante las células en el escudo de la embrión de acogida. Repita hasta que todos los embriones de acogida han sido trasplantados. </li><li> Retire cualquier embriones dañados con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar los embriones trasplantados en la incubadora a 28 ° C y dejar que ellos se recuperen durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Usando una agujatitular unida a una jeringa, enjuague la aguja trasplante de células con agua y colocarlo de nuevo en una placa de Petri en una banda de pasta de modelar. Sellar la placa con parafilm. </li></ol></li></ol> 6. (OPCIONAL) Trasplante de los organismos unicelulares Nota: En el embrión, las células se adhieren entre sí, de modo que es difícil sacar una sola célula en la aguja del trasplante. Hemos desarrollado un protocolo modificado fácilmente para trasplantar células progenitoras placa prechordal individuales. La idea es de disociar las células antes del trasplante. Debido a que las células aisladas prechordal placa progenitoras tienden a perder su identidad, que genéticamente las imponen una identidad prechordal placa prospectivo, mediante la activación de la vía de señalización nodal, en ausencia del factor de transcripción Sox32. Hemos comprobado que estas células inducidas se comportan como células progenitoras placa prechordal endógenos 8. A continuación se presentan los pasos específicos para llevar a cabo trasplantes de células individuales. dissocia celularción se logra mediante la colocación de los embriones en Ringer libre de calcio 11, la disección de un explante y mecánicamente agitándolo. <ol><li> En el paso 2.1, preparar el plato con el trasplante de agarosa al 1% en Ringer libre de calcio en lugar de embriones Medio. </li><li> En la etapa 3.1, además de ABP140-mCherry ARN y morfolino sin1, añadir 3 ng de ARN que codifica la forma activa del receptor Nodal Taram-A (0,6 ng / l final) y 1,25 l de morfolino contra sox32 (solución madre a 2 mM, por lo tanto, 0,5 mM final). </li><li> Después del paso 4, la transferencia de tres embriones de donantes seleccionados en el plato para el trasplante de células lleno de Pen / Strep Ringer libre de calcio con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Con unas pinzas finas, diseccionar un explante que contiene las células inyectadas (ABP140-mCherry células marcadas). Rápidamente desechar el resto de los embriones. </li><li> Con una pestaña, agitar suavemente el explante hasta que las células se disocian. </li><li> Elaborar una única célula aislada de la aguja del trasplantey trasplantar en el escudo de un embrión de acogida. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de los embriones en un plato de agarosa recubiertas de llenado de Pen / Strep EM. Coloque los embriones en la incubadora a 28 ° C durante 30 min. </li></ol> 7. Montaje de embriones <ol><li> Cámara de imagen <ol><li> Método 1: utilizar una cámara de imágenes compuesto por un tobogán de plástico (75 * 25 * 0,5 mm) perforado con 4 agujeros (5,5 mm de diámetro), con 3 mm de bordes altos, por un lado (Figura 2 C - D). Pegue un cubreobjetos de vidrio en la parte trasera, con pegamento de cianoacrilato (pegamento). Nota: Al final del experimento, coloque la cámara en el agua durante una noche para eliminar el cubreobjetos y deshacerse de residuos de cola con papel de lija. </li><li> Método 2: utilizar 35 mm MatTek vidrio platos de fondo (véase la lista de materiales) con un agujero de 10 mm. </li></ol></li><li> montaje de embriones <ol><li> Llenar un vial de vidrio con 1 ml de caliente 0,2% de agarosa en medio de embrión.Mantenerlo a 42 ° C en un bloque de calor. </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico fluorescente, seleccionar un embrión en el que el rojo células trasplantadas son parte de la placa prechordal prospectivo marcada en verde (es decir, células trasplantadas son rojos dentro de la placa prechordal prospectivo verde, y han comenzado a migrar hacia el polo animal). </li><li> Transferencia de un embrión seleccionado en la solución de agarosa con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Desechar el exceso de medio de embrión a partir de la pipeta. Dibuje el embrión en la pipeta con agarosa, y transferir el embrión en la cámara de formación de imágenes, depositando una gota de agarosa. Antes se establece agarosa, orientar el embrión con una pestaña. Colocar la placa precordal prospectivo hacia arriba para formación de imágenes con un microscopio vertical, o en el fondo de vidrio para formación de imágenes con un microscopio invertido. Espere hasta que la agarosa se establece (alrededor de 1 min, dependiendo de la temperatura ambiente) antes de montar otro embrión en el siguiente pozo de la cámara. Nota: un cha de imagenmbre que contiene 4 pozos permite montar hasta 4 embriones. </li><li> Cuando se establece la agarosa, llenar la cámara con penicilina / estreptomicina EM para evitar la desecación. </li></ol></li></ol> 8. imágenes en vivo <ol><li> Utilice un objetivo de largo alcance 40X de inmersión en agua. Utilice los conjuntos de filtro a la imagen GFP y mCherry (para GFP: excitación BP 470/40, divisor de haz FT 510, y la emisión de 540/50 BP; para mCherry: excitación BP 578/21, divisor de haz FT 596, y LP emisión de 641 / 75). Ajustar duración de la exposición con el fin de optimizar la dinámica de la imagen. </li><li> Para imagen todas las células en la placa, adquirir z-pilas, empezando una pocas micras por encima de la placa precordal prospectivo (en el ectodermo) y finalización de una pocas micras por debajo de la placa precordal prospectivo (en la yema). Use un z-paso de 2 micras. Para optimizar la velocidad de adquisición, cambiar colores entre z-pilas en lugar de entre bastidores. Nota: Esto puede conducir a ligeras diferencias entre las imágenes verde y rojo, pero no es un problema ya que no precisa coSe requiere -localization entre las señales verde y rojo. Para reducir aún más el tiempo de formación de imágenes y la exposición a la luz, verde puede ser adquirido sólo una vez cada 5 puntos de tiempo, lo cual es suficiente para identificar células progenitoras placa prechordal. </li><li> El uso de tales ajustes, la imagen hasta 4 embriones dentro del intervalo de tiempo de dos minutos que es necesario analizar la frecuencia protuberancia y la orientación. Para el análisis de toda la vida saliente, reducir el intervalo de tiempo de 30 segundos para obtener una mayor resolución de tiempo. Imagen de un 60% a un 80% epibolia epibolia. </li></ol> Análisis 9. Dinámica Celular <ol><li> Cargar imágenes en 4D ImageJ Nota: Dependiendo del software utilizado para la adquisición, las imágenes se almacenan en diferentes formatos (un archivo por imagen, un archivo por z-pila, un archivo para todo el experimento). Algunos plugins ImageJ están disponibles en línea para abrir pilas 4D. Nuestros datos se almacenan como un archivo por z-pila. Debido a que el conjunto de datos puede ser grande, puede ser conveniente para abrir solamente parte de ella (algunos timlos puntos E, o una subparte de la pila Z, o de 8 bits convertidos imágenes ...). Utilizamos un plugin de ImageJ medida para hacerlo, lo que estaremos encantados de distribuir bajo petición. </li><li> El análisis de la orientación y de frecuencia de protuberancias celulares <ol><li> Use imágenes GFP para determinar la dirección principal de la migración prechordal placa prospectivo. Toma esto como una referencia para mediciones de ángulos salientes celulares. Girar la pila, de modo que esta dirección de referencia es paralela a un lado de la imagen. </li><li> Siga una célula. Herramienta de selección de ángulo. Para cada trama y cada saliente, utilice la herramienta de ángulo para medir el ángulo entre la protuberancia y la dirección de referencia (Figura 3A). Utilice el comando Analizar / Medir para almacenar el valor (o pulse M en el teclado). Guardar los resultados como un archivo txt. Repita con la siguiente celda. </li><li> Importar los datos en la distribución de R y el ángulo de trama como histogramas. Utilice la prueba de Kolmogorov-Smirnov (ks.test en I) para comparar diferentes condiciones. Nota: La herramienta ángulo proporciona valores comprendidos entre 0 ° y 180 °, lo que permite el uso de pruebas estadísticas clásicas y pruebas no circulares. </li><li> Con este conjunto de datos, calcular la frecuencia de emisión como el número de salientes por célula por minuto. El uso del estudiante t-test (t.test en I) para comparar diferentes condiciones. </li></ol></li><li> Análisis de la célula salientes Lifetime <ol><li> Para cada célula y cada saliente, duración saliente medida (número de tramas durante las cuales el saliente está presente x intervalo de tiempo entre tramas). </li><li> Importar los datos en R. Uso t de Student (t.test en I) para comparar diferentes condiciones. Nota: Otras características de migración puede ser interesante analizar con el fin de caracterizar la migración celular. Estos incluyen pistas de células, para la velocidad, la dirección y las mediciones de la persistencia o la morfología celular. Algunas aplicaciones de software comerciales disponibles para medir estas características, pero un gran número de apli software de código abiertocationes y plugins ImageJ también están disponibles, como por ejemplo ADAPT para analizar Morfodinámica 12, Diper a mirar las trayectorias celulares y persistencia direccional 13, CellTrack para realizar un seguimiento límites de las celdas durante la migración 14. </li></ol></li></ol>

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<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo presenta una forma fácil de estudiar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo, mediante la combinación de la creación de embriones quiméricos utilizando el trasplante de células con imágenes en directo. Creación de embriones de mosaico El estudio de la dinámica de una célula requiere la visualización de su contorno para analizar extensiones citoplasmáticas. Esto se puede lograr mediante el etiquetado de las células ai...

En los organismos multicelulares, la migración celular es esencial tanto para el desarrollo del embrión en el que se asegura la organización de células en tejidos y órganos, y para la vida adulta, en el que toma parte de la homeostasis del tejido (cicatrización de heridas) y la inmunidad. Además de estas funciones fisiológicas, la migración celular también participa en diversas situaciones patológicas, incluyendo, en particular, la metástasis del cáncer. La migración celular se ha analizado in vitro durante décadas, proporcionando una comprensión global de los mecanismos moleculares que garanticen movimientos de la célula en superficies planas. In vivo, sin embargo, las células se enfrentan a un entorno más complejo. Es claramente apareció en los últimos años que la migración dentro de un organismo puede estar influenciada por las señales externas, tales como la matriz extracelular, las células o quimiocinas secretadas migración de guía vecina, y que los mecanismos que impulsan la migración de células puede variar de lo que se ha descrito &lt;em&gt; in vitro 1,2. Los mecanismos que garanticen en la migración celular in vivo han recibido menos atención hasta ahora, principalmente debido a la mayor dificultad técnica, en comparación con los estudios in vitro. In vivo análisis de la migración de células, en particular, requiere de acceso óptico directo a células que migran, las técnicas para marcar las células únicas en para ver su dinámica y morfología, así como ganancia o pérdida de la función se acerca a probar el papel de los genes candidatos. Hasta ahora, sólo unos pocos sistemas modelo que albergan estas características se han utilizado para diseccionar en la migración celular in vivo 3. Recientemente hemos utilizado la migración de la placa precordal prospectivo en los primeros embriones de pez cebra como un nuevo sistema conveniente modelo para evaluar la función de los genes candidatos en el control de la migración de células en vivo 4,5. prechordal placa prospectivo (también conocido como mesendoderm anterior) es un grupo de células que forman en el inicio de Gastrulation en el lado dorsal del embrión. Durante la gastrulación este grupo migra colectivamente hacia el polo animal del embrión 6-8, para formar la placa precordal, un engrosamiento mesendodermal, anterior a la notocorda, y subyacente a la placa neural. La parte anterior de la placa prechordal dará lugar a la glándula de la eclosión, mientras que su parte posterior, probablemente contribuye a la cabeza mesodermo 9. Gracias al desarrollo externo y la claridad óptica de la embrión de pez, la migración celular puede ser directa y fácilmente observarse en esta estructura. Trasplante de la célula es una técnica muy potente que permite la creación rápida y fácil de los embriones de mosaico 10. Expresan marcadores fluorescentes citoesqueleto de las células trasplantadas resultados en el etiquetado de las células aisladas, la morfología y la dinámica de las cuales se pueden observar con facilidad. La combinación de esta a la pérdida o ganancia de función se acerca permite el análisis de funciones de las células autónoma de una latagen didato. El protocolo presentado describe cómo se evaluó la función del componente SIN1 TORC2 en el control de la dinámica de la migración celular y de actina in vivo 5. Pero, como se menciona en los resultados y más discutido, podría ser utilizado para analizar la implicación potencial de cualquier gen candidato en el control de la migración celular in vivo.

<table><tbody><tr><td>Capilares de vidrio (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,58&nbsp; mm)</td><td>Aparato Harvard</td><td>300085</td><td>capilares</td></tr> de vidrio de espesor estándar <tr><td>(diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,78 mm)</td><td>Aparato Harvard</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td> de pared delgada <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp; 000&nbsp; unidades de penicilina y 10&nbsp; mg de estreptomicina por ml</td></tr><tr><td>pinzas finas</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Transjector de aire</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromolinillo</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (para inyección)</td> Micromanipulador <td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>(para trasplante de células)Micromanipulador</td><td></td><td></td> <td>Leica Leica</td></tr><tr><td>Jeringa Hammilton</td> Tirador de micropipetas <td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>David Kopf Instruments Modelo</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Molde de trasplante</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubo</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PTFE</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analizando<em&gt; en vivo</em&gt; migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

La migración celular es clave para muchas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo la metástasis del cáncer. Las bases celulares y moleculares de la migración celular han sido analizadas minuciosamente in vitro. Sin embargo, la migración celular in vivo difiere de alguna manera de la migración in vitro, y ha demostrado ser más difícil de analizar, siendo menos accesible a la observación directa y la manipulación. Este protocolo utiliza la migración de la placa precordal prospectiva en el embrión temprano de pez cebra como un sistema modelo para estudiar la función de los genes candidatos en la migración celular. Los progenitores de la placa precordal forman un grupo de células que, durante la gastrulación, experimentan una migración dirigida desde el organizador embrionario hasta el polo animal del embrión. El protocolo propuesto utiliza el trasplante de células para crear embriones en mosaico. Esto ofrece las ventajas combinadas de etiquetar células aisladas, que es clave para una buena obtención de imágenes, y de limitar los efectos de ganancia/pérdida de función en las células observadas, lo que garantiza efectos autónomos de la célula. Describimos aquí cómo evaluamos la función del componente Sin1 de TORC2 en la migración celular, pero el protocolo se puede utilizar para analizar la función de cualquier gen candidato en el control de la migración celular in vivo.

La técnica presentada se utilizó para analizar el papel de sin1, uno de los componentes principales de la Tor complejo 2 (TORC2), en el control de la migración celular in vivo. El uso de trasplante de células permite el etiquetado de las células y análisis de los efectos de células autónoma aisladas. Película S1 muestra la migración de las células progenitoras de la placa precordal trasplantados. etiquetado de actina con ABP140 permite la visualización fácil de protuber...

Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función de un gen candidato en el control de la migración celular in vivo mediante trasplante celular combinado con imágenes en vivo en el embrión de pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la migración celular, como determinar el papel y la importancia de nuevos genes candidatos en la migración celular in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que genera embriones mosáicos, lo que permite un buen análisis por imágenes y la adenomiosis celular.Para preparar las agujas para trasplante celular, utilice un tirador de micropipetas para estirar un capilar de vidrio. Luego, con un microfórge, corte la punta de la aguja en el punto donde el diámetro interno sea de 35 micrómetros. Utilizando un microdesgastador, afile el extremo cortado del capilar con un ángulo de 45 grados.Para eliminar los residuos de vidrio, inserte la aguja en un portaagujas montado en una jeringa y luego use ácido fluorhídrico al 2% para enjuagar el interior de la aguja tres veces, aspirando y expulsando la solución. A continuación, enjuague la aguja con acetona tres veces. Para preparar las placas para inyección o trasplante celular, prepare agarosa al 1% calentando 50 mililitros de medio para embriones que contenga 0,5 gramos de agarosa en el microondas durante un minuto a potencia máxima.Enfríe el gel de agarosa hasta aproximadamente 60 grados Celsius y vierta todo el volumen en una placa de Petri de 90 milímetros. Inserte un molde para crear líneas de inyección o pozos para el trasplante celular. Cuando el gel de agarosa haya solidificado, use pinzas para retirar el molde.Para inyectar embriones donantes, bajo un microscopio estereoscópico utilice pinzas para comprimir suavemente los embriones transgénicos recolectados dentro de las líneas de una placa de inyección llena con medio embrionario. Oriente los embriones con las células hacia arriba usando pinzas y luego incube la placa a 28 grados Celsius hasta que los embriones alcancen la etapa de cuatro células. A continuación, cargue una aguja de inyección con dos microlitros de una solución de inyección previamente preparada que contenga el dominio de unión a la actina de la proteína de unión a la actina de levadura 140 unido a mcherry.Luego inserte la aguja en un portaagujas conectado a un micromanipulador y unido a un inyector de aire. Abra la aguja utilizando pinzas finas para tocar suavemente la punta de la aguja o pellizcando su extremo. A continuación, inserte la aguja en una de las cuatro células e inyecte la solución hasta llenar el 70% del volumen celular.Inyecte 30 embriones de manera similar. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de esfera, utilice una pipeta Pasteur de plástico para transferir los embriones transgénicos huésped goosecoid GFP y los embriones donantes previamente inyectados a placas de Petri separadas de 35 milímetros recubiertas con agarosa de un milímetro en medio de embrión y llenadas con medio de embrión Pen/Strep. Utilizando pinzas finas, extraiga manualmente los embriones de sus coriones.Luego, coloque los embriones en el incubador a 28 grados Celsius. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de escudo bajo un microscopio fluorescente, seleccione los embriones donantes que expresen ABP140 mcherry dentro del escudo verde. Utilizando una pipeta de Pasteur pulida con fuego, transfiera los embriones huésped a una fila de pocillos en el plato de trasplante celular lleno con EM Pen/Strep. A continuación, coloque los embriones donantes en la fila adyacente.A continuación, con una pestaña, oriente cuidadosamente los embriones con el escudo hacia arriba. Luego, utilizando un portagujas conectado a una jeringa, enjuague la punta de la aguja aspirando y expulsando etanol al 70 %. Seque la aguja aspirando aire hacia su interior.Cuando la aguja esté seca, insértela en el portaagujas conectado a la jeringa Hamilton con el bisel orientado hacia arriba. Para realizar el trasplante de escudo a escudo, introduzca la aguja de trasplante en el escudo de un embrión donante y aspire aproximadamente de 10 a 20 células marcadas con ABP140 mcherry. Evite cuidadosamente aspirar el vitelo.Transplante las células al escudo del embrión huésped y repita la transferencia celular hasta que todos los embriones huésped hayan sido trasplantados. Cuando finalice el trasplante, utilice una pipeta Pasteur pulida con fuego para eliminar cualquier embrión dañado. Incube los embriones trasplantados a 28 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos para permitir que se recuperen.Para trasplantar células individuales precursores de la placa prenotocordal después de descorionar los embriones, como se demostró anteriormente, utilice una pipeta de Pasteur pulida al fuego para transferir tres embriones donantes a un platillo de trasplante celular lleno con solución de Ringer sin calcio y Pen/Strep. Con pinzas finas, para cada embrión, diseccione un explante que contenga las células marcadas con ABP140 mCherry y deseche rápidamente el resto del embrión. Usando una pestaña, agite suavemente los explantes hasta que las células se disocien.Luego aspire una sola célula aislada en la aguja de trasplante y traspásela al escudo de un embrión huésped, como se demostró anteriormente en el video. Para un control óptimo de la aspiración y el trasplante, mantenga la separación aire/agua a unos 20 centímetros del extremo de la aguja. Para montar los embriones, llene un vial con fondo de vidrio con un milímetro de agarosa caliente al 0,2 % en EM. Coloque el vial a 42 grados Celsius en un bloque térmico.Transfiera un embrión seleccionado a la solución de agarosa y deseche el medio excedente del embrión del pipeta. Luego, aspire el embrión junto con la agarosa en la pipeta y transfiéralo a una cámara de imagen previamente preparada junto con una gota de agarosa. Antes de que la agarosa se solidifique, use una pestaña para orientar el embrión colocando la placa prenotocordal hacia arriba para la imagen con un microscopio vertical, o sobre el fondo de vidrio para la imagen con un microscopio invertido.Dispondrá de aproximadamente 40 segundos para orientar el embrión antes de que el gel de agarosa se solidifique, dependiendo de la temperatura ambiente. Oriente el embrión rápidamente manipulando el blastodermo en lugar del vitelo, que es muy frágil. Una vez que todos los embriones estén montados y el agarosa se haya solidificado, use EM con Pen/Strep para llenar la cámara y evitar que los embriones se sequen.Realice imágenes de células vivas y experimentos de dinámica celular según el protocolo descrito. La técnica demostrada en este video se utilizó para analizar el papel de Sin1, uno de los componentes principales del complejo TOR dos, en el control de la migración celular in vivo. Esta película muestra la migración de células precursores del placa prenotocordal trasplantadas.La marcación de actina permite visualizar las prolongaciones citoplasmáticas ricas en actina. Mediante el análisis de la frecuencia y la orientación, se observó que las células de tipo salvaje producen frecuentemente prolongaciones citoplasmáticas grandes, orientadas en la dirección del polo animal y de la migración. Como se observa en esta figura, la pérdida de función de Sin1 conduce a una reducción drástica en el número de prolongaciones y a la aleatorización de la orientación de las prolongaciones restantes, lo que demuestra la importancia de Sin1 en el control de la formación de prolongaciones ricas en actina.Curiosamente, el fenotipo de Sin1 puede revertirse mediante la expresión de una forma constitutivamente activa de Rac1, lo que sugiere fuertemente que el complejo TOR C2 controla la dinámica del actina y la formación de protrusiones celulares a través de Rac1. Esta técnica también se utilizó para analizar el papel de arpin, un inhibidor del complejo ARP2/3, en la migración celular. Como se muestra aquí, la pérdida de función de arpin conduce a un aumento en la frecuencia de protrusiones, ya sea por una formación más frecuente de protrusiones o por un incremento en la estabilidad de las mismas.La medición de la duración de las protrusiones en ausencia de arpin reveló que la persistencia temporal de las protrusiones se duplicó, lo que indica un aumento en la estabilidad. Una vez dominada, la trasplantación de aproximadamente 30 embriones puede realizarse en 45 minutos. Durante el intento de este procedimiento, es importante vigilar el desarrollo de los embriones, ya que todos los pasos están críticamente sincronizados.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal en vivo para obtener imágenes más detalladas y abordar preguntas sobre la organización subcelular de los elementos del citoesqueleto, marcadores de polaridad, proteínas adicionales o cualquier otro componente celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar trasplantes de precursores de la placa prequiral para analizar el papel de cualquier gen candidato en la migración celular in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Pez cebra trasplante de células permite la combinación de la genética y la embriología para generar quimeras tejido específico. Este vídeo demuestra gástrula etapas trasplantes de células que han permitido a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones de astro y señales específicas de orientación durante la formación de la comisura del cerebro anterior.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Este video describe un método de microinyección para la administración de células de cáncer de mama en el espacio perivitelino de embriones transgénicos de pez cebra. Después de la incubación, visualizamos el embrión bajo un microscopio fluorescente para observar la invasión, diseminación y metástasis de las células cancerosas.

zPDX-Análisis de invasividad: investigación del comportamiento invasivo de células de cáncer metastásico en xenoinjertos de embriones de pez cebra

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

En este trabajo se presenta un protocolo para trasplantar células con alta resolución espacial y temporal en embriones y larvas de pez cebra en cualquier etapa entre al menos 1 y 7 días después de la fertilización.

Trasplante celular de alta resolución en embriones y larvas de pez cebra

Aprende a analizar la migración celular in vivo mediante trasplante de células e imagen en tiempo real en embriones de pez cebra Danio rerio. Este método permite estudiar la función de genes candidatos en procesos de desarrollo.

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