analizando En Vivo Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función de un gen candidato en el control de la migración celular in vivo mediante el trasplante celular combinado con imágenes vivas en el embrión de pez cebra. Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave en el campo de la migración celular, como la determinación del papel y la importancia de los nuevos genes candidatos en la migración celular in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que crea embriones en mosaico que permiten una buena imagen y adenomiosis celular.

Para preparar las agujas de trasplante de células, utilice un microextractor de pipetas para extraer un capilar de vidrio. Luego, con una microforja, corte la punta de la aguja en el punto donde el diámetro interior es de 35 micrómetros. Con un micromolinillo, biselar el extremo cortado del capilar en un ángulo de 45 grados.

Para eliminar los residuos de vidrio, inserte la aguja en un soporte de aguja montado en una jeringa, luego use ácido fluorhídrico al 2% para enjuagar el interior de la aguja tres veces aspirando la solución hacia adentro y hacia afuera. A continuación, enjuague la aguja con acetona tres veces. Para preparar platos para inyección o trasplante de células, prepare agarosa al 1% calentando 50 mililitros de medio embrionario que contenga 0,5 gramos de agarosa en un microondas durante un minuto a plena potencia.

Enfríe el gel de agarosa a unos 60 grados centígrados y vierta todo el volumen en una placa de Petri de 90 milímetros. Inserte un molde para crear líneas para inyección o para crear pocillos para el trasplante de células. Cuando el gel de agarosa esté listo, use pinzas para quitar el molde.

Para inyectar embriones de donantes, bajo un microscopio estereoscópico, use fórceps para exprimir suavemente los embriones transgénicos recolectados en las líneas de una placa de inyección llena de medio embrionario. Con pinzas, oriente los embriones con las células hacia la parte superior, luego incube la placa a 28 grados centígrados hasta que los embriones hayan alcanzado la etapa de cuatro células. A continuación, cargue una aguja de inyección con dos microlitros de una solución inyectable previamente preparada que contenga el dominio de unión a actina de la proteína de unión a actina de levadura 140 unida a mcherry.

A continuación, inserte la aguja en un portaagujas conectado a un micromanipulador y a un transjector de aire. Abra la aguja usando pinzas finas para tocar suavemente la punta de la aguja o pellizcando su extremidad. A continuación, inserte la aguja en una de las cuatro células e inyecte la solución para llenar el 70% del volumen de la célula.

Inyectar 30 embriones de manera similar. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa esfera, utilice una pipeta de plástico para pastos para transferir los embriones GFP transgénicos transgénicos del huésped y los embriones de donantes previamente inyectados en placas de Petri separadas de 35 milímetros recubiertas con agarosa de un milímetro en el medio embrionario y rellenas con medio embrionario Pen/Strep. Con unas pinzas finas se extraen manualmente los embriones de sus coriones.

A continuación, coloque los embriones en la incubadora a 28 grados centígrados. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de escudo bajo un microscopio fluorescente, seleccione embriones de donantes que expresen ABP140 mcherry dentro del escudo verde. Usando una pipeta de pasto pulida al fuego, transfiera los embriones del huésped a una fila de pocillos en el plato de trasplante de células lleno de Pen/Strep EM. A continuación, coloque los embriones de la donante en la fila vecina.

A continuación, con una pestaña, oriente cuidadosamente los embriones con el escudo hacia arriba. Luego, usando un soporte de aguja conectado a una jeringa, enjuague la punta de la aguja aspirando y expulsando etanol al 70%. Seca la aguja aspirando aire en ella.

Cuando la aguja esté seca, insértela en el portaagujas conectado a la jeringa Hamilton con el bisel hacia arriba. Para realizar el trasplante de escudo a escudo, introduzca el escudo de un embrión donado con la aguja de trasplante y extraiga unas 10 a 20 células marcadas con ABP140 mcherry. Evite con cuidado extraer la yema.

Trasplante las células en el escudo del embrión huésped y repita la transferencia celular hasta que todos los embriones huéspedes hayan sido trasplantados. Cuando se complete el trasplante, use una pipeta de pasto pulida al fuego para eliminar los embriones dañados. Incubar los embriones trasplantados a 28 grados centígrados durante unos 30 minutos para permitir que se recuperen.

Para trasplantar células pregenitoras de una sola placa precordal después de decorionar embriones, como se demostró anteriormente, use una pipeta de pasto pulida al fuego para transferir tres embriones donantes a una placa de trasplante de células llena de anillos libres de calcio Pen/Strep. Con pinzas finas para cada embrión, diseccione un explante que contenga las células marcadas con ABP140 mcherry inyectadas y deseche rápidamente el resto de los embriones. Con una pestaña, revuelva suavemente los explantes hasta que las células se disocien.

A continuación, extraiga una sola célula aislada en la aguja de trasplante y trasplántela en el escudo de un embrión huésped, como se ha demostrado anteriormente en el vídeo. Para un control óptimo de la aspiración y el trasplante, mantenga la separación aire/agua a unos 20 centímetros del extremo de la aguja. Para montar los embriones, llene un vial con fondo de vidrio con un milímetro de agarosa caliente al 0,2% en EM. Coloque el vial a 42 grados centígrados en un bloque de calor.

Transfiera un embrión seleccionado a la solución de agarosa y deseche el medio embrionario sobrante de la pipeta. A continuación, extraiga el embrión en la pipeta con agarosa y transfiéralo a una cámara de imagen previamente preparada junto con una gota de agarosa. Antes de colocar la agarosa, use una pestaña para orientar el embrión colocando la placa precordal de perspectiva hacia arriba para obtener imágenes con un microscopio vertical, o en el fondo de vidrio para obtener imágenes con un microscopio invertido.

Habrá unos 40 segundos para orientar el embrión antes de que el gel de agarosa se fragúe, dependiendo de la temperatura ambiente. Orientar el embrión rápidamente manipulando el blastodermo en lugar de la yema, que es muy frágil. Después de que todos los embriones estén montados y la agarosa esté lista, use Pen/Strep EM para llenar la cámara y evitar que los embriones se sequen.

Lleve a cabo imágenes de células vivas y experimentos de dinámica celular de acuerdo con el protocolo de texto. La técnica demostrada en este vídeo se utilizó para analizar el papel de Sin1, uno de los componentes principales del complejo TOR dos, en el control de la migración celular in vivo. Esta película muestra la migración de células pregenitoras de placa precordal trasplantadas.

El marcaje de actina permite visualizar protuberancias citoplasmáticas ricas en actina. A través del análisis de frecuencia y orientación se observó que las células de tipo silvestre producen frecuentemente grandes protuberancias citoplasmáticas, orientadas en la dirección del polo animal, y de migración. Como se ve en esta figura, la pérdida de la función de Sin1 conduce a una reducción drástica en el número de protuberancias y la aleatorización de las protuberancias restantes, lo que demuestra la importancia de Sin1 en el control de la formación de protuberancias ricas en actina.

Curiosamente, el fenotipo Sin1 puede ser rescatado por la expresión de una forma constitutivamente activa de Rac1, lo que sugiere fuertemente que TOR C2 controla la dinámica de la actina y la formación de protuberancias celulares a través de Rac1. Esta técnica también se utilizó para analizar el papel de arpin, un inhibidor del complejo ARP2/3 en la migración celular. Como se muestra aquí, la pérdida de la función del arpin conduce a un aumento en la frecuencia de protuberancias, debido a la formación de protuberancias más frecuentes o a un aumento en la estabilidad de las protuberancias.

La medición de la vida útil de las protuberancias en ausencia de arpin reveló que la persistencia temporal de las protuberancias se duplicó, lo que indica un aumento de la estabilidad. Una vez dominado el trasplante de unos 30 embriones se puede realizar en 45 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante vigilar el desarrollo de los embriones, ya que todos los pasos están cronometrados de manera crítica.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía confocal en vivo, para proporcionar mejores imágenes y abordar preguntas sobre la organización subcelular de los elementos citoscómicos, los marcadores de polaridad, las proteínas de adición o cualquier otro constituyente celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar los trasplantes de pregenitores de placa precordal para analizar el papel de cualquier gen candidato en la migración celular in vivo.