El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada Plasmodium

El objetivo general de este conjunto de procedimientos es inmunizar ratones con parásitos plasmodio atenuados por radiación. Facilitar el análisis del reclutamiento de células mieloides en la piel del ratón y en los ganglios linfáticos drenantes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la malaria, como cuáles son los actores celulares involucrados en la respuesta inmunológica innata a los parásitos vivos atenuados.

Entre 18 y 25 días después de la infección, se alimenta de sangre, se recogen y anestesian en frío los mosquitos infectados en un tubo de 15 mililitros con hielo. A continuación, invierta cuidadosamente el tubo en una placa de Petri sobre hielo y exponga a los insectos a una dosis de 12 kilorad de irradiación gamma o X. Recoja las glándulas salivales del mosquito irradiadas en 15 microlitros de DPBS en hielo.

Y luego, triture suavemente las glándulas para liberar los esporozoítos. La inyección de una suspensión de parásitos altamente concentrada en un volumen pequeño es fundamental, por lo que es importante recolectar un número suficiente de glándulas salivales de mosquitos bien infectados, como lo demuestra la expresión robusta de fluorescencia verde. Vuelva a suspender la suspensión del parásito antes de la filtración a través de un filtro de 35 micrómetros adaptado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Usando una cámara de conteo de microscopio, cuente el número total de esporozoítos aislados y ajuste la suspensión del parásito a una concentración de esporozoítos de 8,3 veces diez al cuarto por microlitro en DPBS frío en hielo. Antes de inyectar los esporozoítos, confirme el nivel adecuado de sedación del animal de experimentación mediante un pellizco en los dedos de los pies y aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Luego, trabajando rápidamente, use cinta adhesiva transparente para fijar suavemente el lado ventral del pabellón auricular bajo un microscopio estereoscópico y cargue una jeringa de diez microlitros, equipada con una aguja de calibre 35, con 0,6 microlitros de parásitos resuspendidos.

A continuación, inserte con cuidado la aguja, con el lado bisel hacia arriba, debajo de la epidermis en el lado dorsal de la oreja e inyecte 0,15 microlitros de esporozoítos en el sitio. Se observará una pápula característica en el lugar de la inyección. Después de inyectar la dermis tres veces más, como se acaba de demostrar, retire con cuidado la cinta y controle el ratón hasta que se recupere por completo.

En el momento deseado después de la inoculación con esporozoíto, sacrifique el ratón e inicie el procedimiento inmediatamente. Asegúrese de que el ratón muestre signos de muerte clínica. Desinfecte el oído y la región correspondiente del cuello con etanol al 70 por ciento.

A continuación, con unas tijeras y fórceps estériles, realice una incisión en la zona yugulo-carotidiana. Luego, estire la incisión con dos pinzas para exponer el ganglio linfático drenante de aspecto gris. Pellizque y extraiga con cuidado el tejido conectivo directamente sobre el ganglio linfático y extráigalo con un segundo par de pinzas, colocadas debajo.

Transfiera el ganglio linfático a un colador de 70 micras en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos, que contiene 4,5 mililitros de medio estándar, suplementado con colagenasa y DNasa. A continuación, extraiga toda la oreja inoculada y use dos pinzas para pellizcar y separar la oreja en los aspectos dorsal y ventral. A continuación, coloque cada lado de la oreja en un pocillo de una segunda placa de seis pocillos, que contenga 4,5 mililitros por pocillo de medio suplementado con enzimas digestivas, teniendo cuidado de que cada tejido esté completamente sumergido en el medio.

Para aislar las células inmunitarias de los ganglios linfáticos, incube la placa de tejido linfoide a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2 bajo una agitación suave. Después de 15 minutos, agregue diez milimolares de EDTA a cada pocillo y coloque la placa sobre hielo. A continuación, para cada ganglio linfático, use el extremo de un nuevo émbolo de jeringa de cinco milímetros y presione el ganglio linfático contra el colador con movimientos circulares para disociar el tejido.

Cuando solo quede tejido conectivo blanco, enjuague el colador dos veces con 500 microlitros de DPBS que contengan FBS y EDTA y transfiera el lavado a un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, lave el pocillo dos veces más con 500 microlitros del DPBS suplementado y transfiera el lavado al tubo colocado sobre hielo. Para aislar las células inmunitarias del oído, incube las valvas del oído a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2 con una agitación suave.

Pasados los 20 minutos, corte los tejidos en trozos más pequeños para facilitar su digestión y devuelva las muestras a la incubadora. Después de 40 minutos, detenga la digestión con diez milimolares de EDTA y coloque la placa sobre hielo. Con una pipeta de un mililitro con una punta cortada, transfiera todo el contenido de cada pocillo a nuevos pocillos que contengan filtros de 70 micras.

Y use un émbolo de jeringa de cinco mililitros para disociar los fragmentos de tejido del oído con movimientos circulares como se acaba de demostrar. Cuando solo queden tejido conectivo blanco y cabello, lave los coladores y los pocillos con DPBS más FBS y EDTA como se acaba de demostrar, agrupando los lavados en un tubo de 50 mililitros con hielo. Finalmente, lave el pocillo dos veces con DPBS suplementado y transfiera el lavado al tubo colocado en hielo.

En este video, se puede ver la migración de esporozoítos atenuados por radiación a la piel del ratón 15 minutos después de la inyección intradérmica de los parásitos. 24 horas después de la inyección intradérmica de esporozoíto, las células totales se aíslan de la piel y del ganglio linfático de drenaje. Como se observa en esta figura, la frecuencia de células mieloides en la piel y los ganglios linfáticos que drenan aumenta considerablemente en comparación con los ratones naïve.

Una vez dominados, los primeros pasos del protocolo para la irradiación de mosquitos a la inyección de esporozoítos se pueden completar en cuatro horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el esporozoito aislado de las glándulas salivales de los mosquitos pierde rápidamente su infectividad. Por lo tanto, deben inyectarse lo más rápido posible.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las células mieloides de la piel del ratón y el ganglio linfático de drenaje para explorar la respuesta inmunológica a la inyección intradérmica de parásitos plasmodium vivos atenuados.