Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

El objetivo general de este método es monitorear todo el proceso de reproducción sexual en levaduras de fisión mediante microscopía óptica. Este método describe la preparación de células de levadura de fisión para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de varias etapas del ciclo de vida sexual, como la elección de pareja de apareamiento, el crecimiento polarizado, la fusión célula-célula, la miosis y la esporulación. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visualización de una sola célula y, por lo tanto, supera el problema de que las células no entran en la diferenciación sexual de forma sincrónica.

Este método es muy simple, pero la demostración visual es útil para mostrar cómo montar varias deformaciones en paralelo para la microscopía. Demostrando el procedimiento con mi estudiante de doctorado, Omaya Dudin, estará Laura Merlini, una postdoc en mi laboratorio. Existen varias variaciones de este protocolo que se pueden adaptar para estudiar varias etapas del ciclo de vida sexual, utilizando cepas homotálicas o heterotálicas.

En esta demostración se utilizarán cepas homotálicas H90. En estas cepas, el cambio de tipo de apareamiento tiene lugar durante la última división mitótica después de la privación de nitrógeno, lo que resulta en una mezcla de los dos tipos de apareamiento. Por la noche, dos días antes del experimento de apareamiento, inocular las cepas recién rayadas de un medio sólido en tubos de cultivo que contengan 3 mililitros de medio de esporulación mínima con nitrógeno o MSL más N. Incubar durante la noche agitando a 25 grados centígrados.

A la mañana siguiente, si es necesario, diluya las suspensiones celulares en MSL más N para asegurar un crecimiento exponencial a lo largo del día. Por la noche, mida la densidad óptica y diluya las células en 20 mililitros de MSL más N en matraces de 100 mililitros hasta una densidad óptica de 025 Los cultivos celulares de tipo salvaje deben alcanzar una densidad óptica de 600 de aproximadamente 8 a la mañana siguiente. Por lo tanto, la dilución debe ajustarse en consecuencia, si se trabaja con cepas con tiempos de generación más largos.

Incubar los cultivos durante la noche a 30 grados centígrados con agitación. A la mañana siguiente, mida la densidad óptica para verificar que cada cultivo tenga una densidad óptica de 600 alrededor de 8. Granule las células a 1000 x g durante un minuto y transfiéralo a un tubo de 1,5 mililitros.

Lavar las células tres veces en 1 mililitro de medio de esporulación mínima sin nitrógeno o MSL menos N. Después del último lavado, resuspender las células en 3 mililitros de MSL menos N medio. Mida la densidad óptica y diluya las células hasta una densidad óptica de 600 de 1,5. Para comenzar la preparación de las almohadillas de agarosa, primero derrita un Aliquat de MSL menos N agarosa al 2 por ciento en un bloque de calor a 95 grados Celsius durante 10 a 15 minutos.

Mientras tanto, pellet 100 microlitros de la suspensión celular preparada anteriormente a 1000 x g durante un minuto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en los 2 a 4 microlitros residuales de medio. Con las celdas esperando en el banco, agregue 200 microlitros del medio derretido en un portaobjetos de vidrio entre dos espaciadores.

Coloque suavemente otro portaobjetos encima del agar derretido. Una vez que la agarosa se haya solidificado, retire con cuidado los espaciadores. Para quitar el portaobjetos de vidrio superior, gírelo suavemente y tire de él hacia los lados.

Si se van a obtener imágenes de varias cepas simultáneamente, la almohadilla se puede subdividir en cuatro mini almohadillas. Para esto, use una hoja de afeitar y divida la almohadilla por la mitad separando las partes aproximadamente 1 milímetro y repita en la dirección perpendicular. Agregue 1 microlitro de células a la almohadilla de agarosa y espere aproximadamente un minuto.

Cubra las celdas con un cubreobjetos y selle toda la periferia del cubreobjetos con VELAP calentado. Es importante sellar todo el cubreobjetos para evitar que la almohadilla se desece. Deje reposar la almohadilla durante al menos 30 minutos antes de tomar la imagen.

Para garantizar el éxito del protocolo y una alta eficiencia de apareamiento, las células deben mantenerse en crecimiento exponencial hasta la inanición de nitrógeno y montarse sin exceso de líquido para que estén estacionarias en la almohadilla de agarosa. A continuación, se realizan imágenes de células vivas de las células de levadura apareadas a 25 grados centígrados, o temperatura ambiente, siguiendo el procedimiento descrito en el texto del protocolo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten una visualización de las células que experimentan shmooing, fusión y esporulación en las 24 horas posteriores a la inanición de nitrógeno.

Este proceso se ilustra en esta película representativa mediante las dos celdas ampliadas en el recuadro inferior izquierdo. Este protocolo también se puede utilizar para monitorear la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia en las células de apareamiento. Aquí, una cepa H heterotálica que expresa myo52 marcada con 3GFP se acopló con una cepa heterotálica H+ que expresa myo52 fusionada con la proteína tdTomato fluorescente roja, así como GFP citosólica.

La GFP citosólica permite monitorizar el momento de la fusión, visualizado por su entrada en la célula H. Estas imágenes de lapso de tiempo muestran que myo52 inicialmente se formó en zonas dinámicas en toda la corteza celular. La señal de Myo52 se estabilizó en un solo foco justo antes del evento de fusión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las células para un apareamiento eficiente y la investigación de células vivas del proceso de apareamiento de la levadura de fisión.