encapsular citocromo

El objetivo general de este procedimiento es encapsular citocromo c en sol-gel de sílice. Para procesar críticamente estos geles y formar bioaerogeles, y utilizar estos bioaerogeles para reconocer rápidamente el óxido nítrico mediante una reacción en fase gaseosa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del biosensado y bioanálisis, como por ejemplo qué condiciones son necesarias para que el citocromo c permanezca activo cuando está encapsulado en un aerogel altamente poroso.

La importancia de esta técnica radica en que es un procedimiento sencillo para encapsular una proteína en una matriz en la cual rara vez se ha logrado encapsular proteínas con éxito. Aunque este método puede proporcionar información sobre la citocromo c, también podría conducir a avances metodológicos para encapsular otras proteínas en aerogeles, con posibles implicaciones para dispositivos bioanalíticos futuros. Prepare una solución con una concentración de citocromo c en el rango de 0,7 a milimolar.

Además de una solución diluida de citocromo c de 0,105 milimolar, como se describe en el protocolo escrito. Luego, etiquete un vaso de precipitados desechable de polipropileno de 50 mililitros, Vaso A. Coloque el vaso sobre el platillo de una balanza analítica y use una pipeta Pasteur de vidrio para agregar 1,88 gramos de tetrametoxisilano al vaso. Pese a cero la balanza.

Luego, pipetee 2.88 gramos de metanol dentro del vaso A. Cubra el vaso A con parafilm. A continuación, agregue una barra de agitación magnética a un vaso desechable de polipropileno de 50 mililitros etiquetado como vaso B y colóquelo sobre el platillo de una balanza analítica. Utilice una pipeta de vidrio para añadir 0.75 gramos de agua y 3.00 gramos de metanol antes de cubrir el vaso B con parafilm.

Comience a agitar el contenido del vaso B en una placa agitadora dentro de una campana extractora. Luego, utilice una jeringa para insertar 5 microlitros de una solución de hidróxido de amonio al 28,0-30,0 % a través de la cubierta de parafilm en la mezcla mientras se agita. Tan pronto como se complete este paso, añada el contenido del vaso A al vaso B. Agite la mezcla durante 20 minutos manteniéndola cubierta con parafilm.

Mientras se mezcla la mezcla de sol de sílice, obtenga de ocho a nueve viales de centelleo de polipropileno y sus tapas correspondientes. Coloque una envoltura de plástico sobre el extremo del vial donde va la tapa para crear una superficie plana sobre la cual se formará el gel. Luego coloque la tapa encima.

Asegúrese de que la envoltura de plástico permanezca intacta dentro de la tapa. Coloque los viales con la tapa hacia abajo sobre la superficie de trabajo y las aberturas hacia arriba. Luego corte trozos de parafilm que se utilizarán para cubrir cada vial.

Tras finalizar la mezcla del sol, añada 3 mililitros de la mezcla de sol a un vaso de polipropileno desechable limpio de 50 mililitros. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para depositar muy lentamente 500 microlitros de la solución diluida de citocromo c de 0,105 milimolar por la pared del vaso dentro de la mezcla de sol de 3 mililitros durante aproximadamente un minuto. Asegúrese de agitar suavemente la mezcla mientras añade el citocromo c para evitar la formación de grandes grumos rojos.

Pipetee 0,5 mililitros del sol de sílice de citocromo c resultante en cada molde preparado. También pipetee 0,5 mililitros del sol de sílice simple restante en uno o dos moldes para usar como muestras control durante el proceso de secado supercrítico. Cubra las aberturas superiores de los moldes con parafilm y colóquelos en el refrigerador durante la noche, o al menos 12 horas, para producir geles sol.

Saque los moldes del refrigerador. Retire el parafilm de la parte superior de un molde que contenga un gel sol de citocromo c, y también retire la tapa y el envoltorio de plástico de la base. Después de agregar un poco de etanol desde un frasco lavador al molde, utilice el extremo circular del émbolo de una jeringa para empujar cuidadosamente el gel fuera del molde y dentro de un frasco de vidrio limpio de 20 mililitros que contenga aproximadamente 5 mililitros de etanol.

Repita este procedimiento de eliminación del gel hasta que todos los geles de citocromo c se hayan agregado al vial, y todos los geles de sílice se hayan agregado a un vial separado. Luego, llene los viales hasta arriba con etanol. Tape y almacene entre 2 y 8 grados centígrados.

Cada cuatro horas durante el día, retire los geles del refrigerador. Decapte el etanol de los geles y reemplácelo con etanol fresco. Durante tres días adicionales, sumerja los geles húmedos en acetona, decantando y agregando acetona fresca tres veces al día.

Enfríe un aparato de secado por punto crítico a 10 grados Celsius, ajustando la temperatura de un circulador acoplado a ocho grados Celsius. Una vez que el aparato haya alcanzado 10 grados Celsius, realice una prueba de fugas en el aparato según se describe en el protocolo del texto. Después de asegurarse de que el aparato no tiene fugas, vierta cuidadosamente los geles húmedos de los viales de centelleo, junto con la mayor parte de la acetona, en las tres secciones largas de la embarcación de transferencia.

Agregue más acetona si es necesario para asegurar que todos los geles queden completamente sumergidos en acetona antes de sellar la embarcación dentro del aparato. Abra la válvula de llenado del aparato para agregar dióxido de carbono. Al observar que el dióxido de carbono se hunde en la parte inferior del aparato a través de la ventana del mismo, abra la válvula de drenaje para liberar la acetona durante cinco minutos.

Este filtrado de la acetona hacia el fondo ocurrirá antes de que el aparato se llene completamente con dióxido de carbono. Por lo tanto, mantenga la válvula de llenado abierta durante el vaciado para que el aparato siga llenándose. Luego, cierre la válvula de drenaje.

Mantenga la válvula de llenado ligeramente abierta. Al principio, la mezcla que sale contiene agua, porque la acetona no es anhidra. Es posible que se produzcan congelación, obstrucción y acumulación de presión en el tubo de drenaje.

Si se detecta un bloqueo, cierre la válvula de drenaje hasta que el bloqueo se derrita. Cinco minutos después, abra la válvula de drenaje durante cinco minutos adicionales y ajuste la válvula de llenado para que esté abierta lo suficiente como para que el aparato permanezca lleno durante todo el tiempo de drenaje. Después de cinco minutos, cierre la válvula de drenaje y mantenga la válvula de llenado ligeramente abierta.

Luego, repita este paso de drenado una vez más, cinco minutos después. Una vez completados los pasos de drenado, cierre la válvula de llenado y drene el dióxido de carbono líquido, de modo que el nivel permanezca visible apenas por encima de las púas del bote a través de la ventana del aparato. A continuación, ajuste la temperatura del circulador acoplado al aparato a 40 grados celsius para asegurar que el dióxido de carbono líquido supere su temperatura y presión críticas.

Después de aproximadamente 15 minutos, observe a través de la ventana del aparato la transición del líquido al fluido supercrítico, cuando el menisco líquido sobre las puntas del barco desaparece. Después de al menos 15 minutos de tiempo de equilibrio, abra ligeramente la válvula de ventilación para comenzar la liberación del fluido supercrítico. Durante un período de aproximadamente 45 minutos, continúe abriendo progresivamente la válvula de ventilación cada vez más, de modo que pueda escucharse un silbido constante pero muy leve del fluido en liberación, y se observe que el manómetro disminuye lentamente hasta cero.

Después de que la presión del aparato haya descendido a cero, abra la puerta del aparato. Retire la lancha. Y use pinzas para colocar los aerogeles recién secos en viales de vidrio limpios para centelleo.

Los aerogeles de citocromo c en sílice ya están listos para usarse en la detección de la presencia de gas óxido nítrico, tras la caracterización descrita en el protocolo del texto. Se muestran aerogeles que encapsulan citocromo c a 15 micromolar en tampón fosfato de potasio a 4,4 milimolar, 40 milimolar y 70 milimolar, en comparación con una moneda de diez centavos. Aquí se muestra un espectro representativo del citocromo c en tampón comparado con el citocromo c encapsulado en aerogeles bajo diversas condiciones.

El pico soret del citocromo c a 409 nanómetros permanece esencialmente sin cambios dentro de los aerogeles y presenta un corrimiento al rojo característico cuando los biogeles se exponen al óxido nítrico en fase gaseosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar geles sol-gel de sílice, encapsular citocromo c en estos geles sol-gel y secar estos geles sol-gel compuestos para convertirlos en aerogeles. Se puede encontrar más información en el protocolo escrito sobre la caracterización de los biogeles y sobre el uso de los biogeles para detectar el óxido nítrico en fase gaseosa.