Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

El objetivo general de este protocolo es diferenciar células madre pluripotentes humanas en melanocitos maduros completamente pigmentados. Este método puede ayudar a identificar factores clave durante el desarrollo del melanocito. Además, este protocolo nos permitirá identificar factores que se han alterado durante el desarrollo de enfermedades, así como realizar cribados de fármacos importantes en el descubrimiento de medicamentos.

La principal ventaja de este protocolo es que nos permite producir grandes cantidades de melanocitos completamente pigmentados, mientras que el aislamiento de melanocitos de pacientes generalmente da como resultado un número relativamente bajo de células. Después de fraccionar y congelar la proteína gelatinosa, descongele y resuspenda un alícuota de un mililitro en 19 mililitros de DMEM f12.

Luego, introduzca cinco mililitros de esta mezcla en un solo platillo de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Después de preparar varias placas de este tipo, proceda a incubarlas durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, comience a preparar placas recubiertas con PO, laminina y fibronectina agregando primero PBS que contiene 15 microgramos por mililitro de PO a un platillo de cultivo.

Luego, incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador humedecido. Posteriormente, aspirar la solución y lavar los pocillos tres veces con PBS 1X. Continuar el recubrimiento añadiendo 10 mililitros de PBS que contenga 1 microgramo por mililitro de laminina 1 de ratón y 2 microgramos por mililitro de fibronectina.

Luego, incubar los recipientes como se describió anteriormente. Para comenzar, añadir gelatina al 0,1 % en PBS a un recipiente de 10 centímetros de diámetro. Y dejarlo a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Mientras se recubre esta placa, coloque fibroblastos embrionarios de ratón congelados, o MEFs, en un baño de agua a 37 grados Celsius para descongelarlos rápidamente. A continuación, aspire la gelatina del recipiente y siembre los MEFs a una densidad de aproximadamente 50.000 células por centímetro cuadrado en DMEM suplementado con 10 por ciento de suero bovino fetal. Tras incubar el recipiente durante la noche a 37 grados Celsius, aspire el medio y lave la placa de MEFs preparada con PBS 1X.

Proceda a agregar 10 mililitros de medio para hESC previamente preparado que contiene células madre pluripotentes humanas, abreviadas como hPSC, a una placa de 10 centímetros. Después de sembrar las células a una densidad de 5 millones de células por placa, incube las placas a 37 grados Celsius en presencia de dióxido de carbono al 5 %. Proceda a alimentar las células diariamente con 10 mililitros de medio fresco para hESC.

Antes de comenzar la diferenciación, inspeccione la placa en busca de colonias que parezcan contener células diferenciadas, bordes irregulares o centros transparentes. Bajo un microscopio estereoscópico en una cabina de flujo laminar, desprenda mecánicamente con una pipeta cualquier colonia irregular de este tipo. Para realizar el recubrimiento con proteínas gelatinosas como Matrigel, primero alícuote y congele la proteína en partes de un mililitro para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Luego, descongele y resuspenda un alícuota congelado de un mililitro con 19 mililitros de DMEM F12. Proceda a sembrar cinco mililitros de esta mezcla en un recipiente de 10 centímetros y incube los recipientes durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, aspire inmediatamente la proteína gelatinosa justo antes de sembrar las células y lave con DMEM F12. Mientras se recubre este recipiente, seleccione una placa donde las hPSC se encuentren aproximadamente al 80 % de confluencia.

Proceda a aspirar el medio de las CSEh. A continuación, lave las células con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % a la placa.

Agite vigorosamente la placa horizontalmente durante dos minutos hasta que se observe al microscopio que los MEF comienzan a desprenderse como células individuales. Durante este tiempo, espere que las colonias de hPSC permanezcan adheridas a la placa. Proceda a aspirar la tripsina una vez que los MEF se hayan desprendido, pero antes de que las colonias de hPSC se hayan separado.

Luego, agregue a la placa 10 mililitros de medio para células madre embrionarias humanas que contenga 10 micromolares de clorhidrato de Y-27632, un inhibidor de ROCK. Posteriormente, desprenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre las colonias. A continuación, regrese al recipiente con una proteína gelatinosa y aspire la solución.

Lave este recipiente con DMEM F12 para eliminar cualquier agregado. Y siembre las hPSC en una relación de 1 a 2. A continuación, agregue al recipiente medio para hESC que contenga 10 micromolares de Y-27632 dihidrocloruro hasta un volumen de 10 mililitros.

Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche. Alimente las células diariamente con medio suplementado con inhibidor de ROCK. Cuando las hPSC alcancen una confluencia del 80 %, proceda a iniciar la diferenciación neural y designe este punto temporal como Día 0.

Para iniciar la diferenciación, alimente las células el Día 0 y el Día 1 con 10 mililitros de medio de diferenciación KSR que contenga 100 nanomolar de LDN-193189, un inhibidor de BMP, y 10 micromolar de SB 431542, un inhibidor de activina y Nodal. Continúe el Día 2 reemplazando el medio por uno que contenga las mismas concentraciones de los inhibidores de BMP y de activina y Nodal, más 3 micromolar de CHIR99021, un agonista de Wnt. Luego, el Día 3, alimente las células con medio de diferenciación KSR suplementado únicamente con 10 micromolar de SB 431542 y 3 micromolar de CHIR99021.

Después de preparar una mezcla del medio de diferenciación 75 %KSR y del medio de diferenciación 25 %N2 que también contiene tres micromolares del agonista de Wnt. Alimente las células con 15 mililitros de este líquido el día 4 y 5. A continuación, los días 6 y 7 alimente las células con 15 mililitros de medio compuesto por el 50 % del medio de diferenciación KSR y el 50 % del medio de diferenciación N2 que también se ha suplementado con tres micromolares de CHIR99021, 25 nanogramos por mililitro de BMP4 y 100 nanomolares de EDN3.

Luego, en los días 8 y 9, alimente las células con 20 mililitros de medio de diferenciación con 25%KSR y 75%N2 suplementado con las mismas concentraciones de factores utilizados en los días 6 y 7. Continúe con la diferenciación neural el día 10 alimentando las células con 20 mililitros de medio de diferenciación N2 que contiene tres micromolar de CHIR99021, 25 nanogramos por mililitro de BMP4 y 100 nanomolar de EDN3. El día 11, aspire la solución de las placas previamente recubiertas con laminina PO 1 y fibronectina.

Luego, deje las placas descubiertas en una cabina de cultivo celular durante aproximadamente 10 a 15 minutos, permitiendo que se sequen completamente. Proceda a eliminar el medio de las células del día 11 y lávelas con PBS. A continuación, agregue cuatro mililitros de solución de separación celular al recipiente e incube a 37 grados Celsius durante 25 minutos.

Después de la incubación, agregue cinco mililitros de medio completo para melanocitos al recipiente y resuspenda las células pipeteando manualmente hacia arriba y hacia abajo hasta que se hayan desprendido de la placa. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros y centrifugue las células durante cinco minutos a 200 G. Después de contar las células utilizando la exclusión con azul de Triypan y un hemocitómetro, resuspenda las células en medio completo para melanocitos a una densidad de 2×10⁶ células por mililitro.

Coloque gotas de 10 microlitros de la suspensión celular sobre las placas secas y recubiertas. Asegúrese de que las gotas estén cercanas entre sí pero sin tocarse, que tengan bordes bien definidos y que no se esparzan. Para permitir que las células se adhieran, deje las gotas en reposo a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos.

Posteriormente, agregue lentamente 10 mililitros de medio completo para melanocitos al recipiente, teniendo cuidado de no perturbar las células adheridas. Luego, transfiera el recipiente al incubador. Alimente las células cada dos o tres días con medio completo para melanocitos.

Y espere observar pigmentación en grupos de células al final de la primera semana. Una vez por semana, pase las células asociándolas primero con la solución de desprendimiento celular como se describió anteriormente. Después de recolectar las células y centrifugarlas, lávelas dos veces con medio neurobasal simple.

Luego, repasen las células en una proporción de uno a seis en medio completo para melanocitos sobre placas recubiertas con PO, laminina 1 y fibronectina. Alrededor de los 30 días de diferenciación, las células aparecerán fuertemente pigmentadas, lo cual es fácil de visualizar cuando se siembran a alta densidad o se centrifugan durante el paso.

Se muestra aquí una imagen de campo brillante de células de una línea de células madre embrionarias humanas transgénicas psox10 GFP cultivadas hasta el día 11 del protocolo de diferenciación descrito, antes de que las células sean replantadas. En estos cultivos son evidentes crestas definidas y oscuras de células. Cuando estos cultivos se analizaron para detectar la señal GFP, las crestas oscuras resultaron enriquecidas en células positivas para sox10.

Dado que sox10 es un factor de transcripción regulado positivamente por las células madre de la cresta neural y que se mantiene en los melanoblastos, estos resultados sugieren que, para el día 11, este método de diferenciación enriquece células que eventualmente darán origen a melanocitos. Como evidencia de ello, en el día 20 del protocolo, los cultivos contenían melanocitos inmaduros sin pigmento, en proceso de maduración y completamente maduros con pigmento. En el día 25, se observan los mismos tipos de células en los cultivos.

La presencia de melanocitos en maduración y pigmentados en estas preparaciones se confirma mediante tinción con dos proteínas productoras de melanina. TYRP2, que sirve como marcador tanto de melanoblastos como de melanocitos, y TYRP1, que es un marcador de melanocitos en etapa tardía expresado únicamente en los melanocitos pigmentados. Una vez dominado, este protocolo puede emplearse para diferenciar células madre pluripotentes humanas en melanocitos maduros completamente pigmentados en 25 días.

El protocolo avanza a través del desarrollo normal del melanocito, pasando primero por el estado de cresta neural y también por la etapa de melanoblasto.