Name: Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales nasales de niños y reprogramarlas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Este método no invasivo permite obtener una población homogénea para investigar el desarrollo del asma y enfermedades respiratorias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean reconocer la Facilidad de células madre pluripotentes y la Imagen confocal Core en el Hospital de Niños de Cincinnati. Este trabajo fue apoyado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) y 2U19AI70235 (GKKH).

El siguiente protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación humana instituciones. 1. El muestreo de la mucosa nasal NOTA: Obtener muestras de sujetos que no presentan signos de infección viral respiratoria. <ol><li> Preparar una fresca 15 ml cónica antes de la visita de los participantes y añadir 2 ml BEGM (epitelial bronquial medio de crecimiento celular), además de 20 l estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> cepillo de citología abierta justo antes de tomar la muestra, y asegúrese de mantener el cepillo estéril y no lo toque a cualquier superficie además de las superficies nasales. </li><li> Pregunta participante para permanecer sentado y la inclinación de la cabeza hacia el techo. Tienen más pequeño o más hijos inquietos se sientan en sus manos y / o acostado para evitar golpear con fuerza el cepillo de distancia. </li><li> Objetivo del cepillo en la parte posterior de la nariz, donde el paso se estrecha (se parece a un pequeño agujero negro). Deslice el cepillo hacia abajo y girar las muñecas mientras el cepillo se retira de nostril. </li><li> Coloque el cepillo en forma cónica y sumergirse en BEGM. Corte el exceso de cepillo y coloque la tapa en el tubo. NO HACER vórtice. NOTA: Si el participante está dispuesto, obtener un segundo cepillo de la misma manera pero en la segunda fosa nasal. La obtención de un cepillado de ambas fosas nasales se traducirá en una mayor probabilidad de que el muestreo sea un éxito. El muestreo de la misma fosa nasal puede causar sangrado y probablemente no mejorará la muestra. </li><li> Mantener las muestras lo más cercano a 37 ° C como sea posible durante el transporte usando un vaso de precipitados con agua tibia. </li></ol> 2. Recuento de Células y Cytospin <ol><li> Agitar suavemente el cepillo en BEGM y tomar 10 l de la muestra para un recuento de células usando un hemocitómetro. Añadir 10 l de una mancha en vivo / muerto y contar sólo las células vivas con un microscopio. </li><li> Tomar 50 l de la muestra y diluir a 200 l con 1x PBS. Añadir al embudo de citospina unido a portaobjetos de vidrio y centrifugado a 300 rpm durante 2 min. Dejarlo deslizar seca O / N y tinción de diapositivas following instrucciones del fabricante. Deje secar O / N, preferiblemente en la oscuridad. </li><li> Slide mancha con Hema 3 mancha <ol><li> Transferir cada solución (fijador Hema, azul claro; Hema 3 Solución I, rosa, y Hema 3 Solución II, azul profundo) en una placa de tinción; Mantenga cubiertos cuando no estén en uso. Insertar diapositivas en barco de tinción de portaobjetos </li><li> diapositivas Dip continuamente en fijador durante 30 segundos, a continuación, permiten que el exceso se escurra. Dip desliza continuamente en la solución I durante 30 segundos, y luego permitir que el exceso se escurra. Dip desliza continuamente en la solución II durante 30 segundos, y luego permitir que drene el exceso </li><li> Enjuague con agua desionizada hasta que el agua salga clara. Deje secar O / N, de preferencia en la oscuridad </li></ol></li><li> Mira la diapositiva bajo el microscopio las células y el recuento, determinar el porcentaje de células epiteliales. Debe ser de 90% o más si el muestreo es bueno. </li></ol> 3. Las células de siembra NOTA: Llevar a cabo todos los procedimientos de cultivo de células en un cultivo tisular adecuado y certificadocampana mediante una técnica estéril. <ol><li> placas de capa con bovina de colágeno dérmico (BDC), el tipo 1. Añadir 0,5 ml de 3 mg / ml BDC diluido en 49,5 ml de PBS 1x. Preparar menos si se utilizan sólo unas pocas placas. Escudo un matraz T25 con 2 ml y se incuban en BDC O campana estéril / N o a 37 ° C durante 2 horas, si es necesario. </li><li> Después de la incubación, aspirar cualquier líquido restante. Exponer frascos a la luz UV durante 30 minutos en la campana estéril. frascos para almacenaje de hasta un mes a 4 ° C, pero los lleva a RT o 37 ° C antes de la siembra de células. </li><li> Mantenga cepillo y las células en BEGM a 37 ° C hasta el momento de sembrar. Cepille suavemente buches interior cónica, pero no lo hacen vórtice. <ol><li> Placa de 7 x 10 5 células en un matraz T25. Si hay menos, utilizar un recipiente más pequeño, tal como un pocillo de una placa de 6 pocillos. Esta placa de tamaño requiere aproximadamente 3 x 10 5 células. NOTA: Si no hay esta cantidad de células, no es aconsejable continuar. </li></ol></li><li> Bajo una campana estéril, tomar el cepillo de tubo y gently girar el cepillo en la superficie del matraz recubierto, teniendo cuidado de no rayar el revestimiento. Desechar el cepillo en un contenedor de residuos sanitarios apropiados. </li><li> Lentamente pipetear las células restantes en BEGM fuera de la cónica y en el matraz T25. Observar las células bajo el microscopio. Se observó un número de células flotantes y puede haber algunos restos de la nariz, que es aceptable en esta etapa (figura 3A). </li></ol> 4. Cultura de la célula <ol><li> Después de la siembra de células, se dejan reposar durante 48 horas sin interrupción (Figura 3). Después de 48 horas, lenta y suavemente añadir 2 ml cálida BEGM y 20 l estéril Penicilina / estreptomicina / Fungizone (P / S / F). NOTA: NO aspirar los originales 2 ml de medio. </li><li> En el 4º día después de la siembra, aspirar cuidadosamente todo el líquido, y reemplazar con 4 ml frescas, se calienta más el BEGM 1x penicilina / estreptomicina (Fungizone ya no es necesario). Cambiar el medio cada dos días y evaluar células para adjuntarción, el crecimiento y la confluencia. Cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia, normalmente en 2-3 semanas, que están listos para ser pasado. </li><li> Un matraz T25 (alrededor de 2,5 x 10 6 células cuando confluente) puede ser pasado en tres matraces T25 o un frasco T75. Después de la primera paso, las células deben ser robustos y saludable, de alcanzar la confluencia cada tres días. </li></ol> 5. Las células pases <ol><li> Se aspira suavemente el soporte de la placa. Añadir 1 ml de solución de tripsina al 0,05% por matraz T25 a la placa y colocar en la incubadora durante aproximadamente 4 minutos, o hasta que las células se desprenden de la placa. Comprobar el nivel de desprendimiento de las células cada 2 min y no deje de tripsina en más de 10 min. </li><li> Añadir 5 ml de solución de tripsina de neutralización (TNS), o medios que contienen suero para neutralizar la enzima. Eliminar todo el líquido y las células del frasco y colocar en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 200 xg (aceleración 0 deceleración 0) durante 5 minutos para obtener un sedimento celular. Aspirar supernatantes células y resuspender en BEGM + P / S en el volumen requerido para los nuevos frascos (4 ml de un matraz T25, 10 ml de un matraz T75) </li><li> Realizar el recuento de células con una tinción Live / muerto como se describe anteriormente (2.1). Añadir la cantidad apropiada de BEGM y las células a los matraces recubiertos y volver a la incubadora. Mantener como se detalla anteriormente o criopreservar en medio de congelación (70% BEGM, 20% de FBS y 10% de DMSO) a una concentración de 0,5-2 x 10 6 células por ml. </li></ol> 6. La reprogramación de células iPS NOTA: Antes de generar células iPS, garantizar el cumplimiento de todas las normas institucionales que rigen la generación y uso de células iPS humanas. La técnica estéril es especialmente importante para las culturas de IPSC, como medio de cultivo no contiene antibióticos de forma rutinaria. Es fundamental que los CNE parece sana y robusta son proliferativa para la reprogramación éxito. <ol><li> La placa 5 x 10 5 CNE por pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. Después de 24 horas, añadir polibrenoa BEGM a una concentración final de 8 mg / ml y transducir CNE mediante la adición de partículas lentivirales que expresan Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc a los medios de comunicación. Tratar de lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 5 ~ 27. <ol><li> Para la determinación de la MOI, preparar diluciones en serie de la madre concentradas-lentiviral y transducir células HT1080 con estas diluciones. Después de la primera detección de la expresión inequívoca dTomato en las células HT1080, calcular el número de &quot;unidades de transducción / ml&quot;, al anotar el número de células positivas dTomato / pequeños grupos de células en cada dilución. NOTA: Por lo general, no será diluciones que son demasiado altos (todo es dTomato positivo) y muy bajo (ninguno o sólo un par de células positivas). </li><li> Realizar la puntuación de las diluciones en las que se identificaron células positivas discretos / pequeños grupos de células. Determinar el título mediante la corrección del número de transducir unidades / ml con el factor de dilución apropiado. MOI es entonces la relación del númerode las células transducidas con el número de partículas de virus 27. NOTA: Cada dTomato celular positiva / pequeña masa se supone que surgen de una sola partícula de virus. </li></ol></li><li> Alrededor de 3 horas después de la transducción, retire y vuelva a colocar los medios de comunicación con BEGM fresco. Desechar los medios de comunicación que contienen lentivirus utilizando procedimientos aprobados institucionalmente. Volver CNE transducidas a la incubadora durante 3 días. </li><li> El día 3, sustitución de los medios con BEGM fresca, y luego se incuba durante otros 3 días. Aspirar pasó medios de comunicación, se lavan las células con PBS 1x y añadir 1 ml de solución de tripsina al 0,05% al ​​pozo. las células con tripsina de paso lo escrito anteriormente (sección 5). aspirar cuidadosamente las células sobrenadante y resuspender en 4 ml BEGM + P / S. Las células pueden ser pasados ​​a un nuevo pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con BDC, o se añaden a cultivos de MEF, si listo (véase el paso siguiente). </li><li> Preparar placas recubiertas MEF. En el día 4 añadir solución de gelatina al 0,1% (1 ml / pocillo) a 2 pocillos de una de 6 pocillos (+/- para realizar Thiazovivin (SPT), véase el paso 6.6). En el siguientedía, descongelar un vial de 28 MEFs inactivadas. </li><li> Coloque MEFs en 10 ml de medio DMEM (MEF + 1x NEAA + 10% DFCS). Centrifugado a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Resuspender en medios MEF. Gelatina Aspirar de placa de 6 pocillos y añadir 1,87 x 10 5 MEFs por pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta con gelatina. Incubar O / N a 37 ° C, o durante un mínimo de 24 horas. </li><li> Pasar 2 ml de BEGM que contiene células transducidas por pocillo en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos recubiertos previamente e incubar S / N. En el día siguiente, reemplazar BEGM con 2,5 ml por pocillo de medio de células madre estándar que contienen factor de 4 ng / ml de crecimiento fibroblástico básico. Alimentar las células con medio fresco +/- células madre SPT al día durante 10 días NOTA: Es posible añadir un cóctel de moléculas pequeñas (SB431542, PD0325901 y Thiazovivin (SPT) cóctel) para mejorar la eficiencia y la cinética de la reprogramación para CNE 23. </li><li> Después de diez días, seguir alimentando a diario usando los medios de comunicación células madre sin SPT. Alimentar las culturas diaria hasta que las colonias de células madre similares aaparecerá (Figura 5A, P0 colonia). Identificar las colonias que albergan iPSCs putativos por su gran núcleo: citoplasma y nucleolos prominentes. </li><li> Manual sobre el consumo y la transferencia de colonias con morfología similar a células madre para separar los pozos de cultivo y expansión como líneas separadas en un sistema libre de alimentador. colonias extirpados deben adaptarse rápidamente a estas condiciones. <ol><li> Después de colonias de chapado extirpado estas líneas de IPSC putativos discretos ahora se consideran el paso 1 (P1). culturas alimentación diaria con mTeSR1. Pasaje y ampliar las líneas de IPSC utilizando procedimientos estándar. Puede tomar varios días a una semana de colonias p1 para alcanzar el tamaño en el que se debería realizar pases. </li></ol></li></ol> 7. El mantenimiento de células iPS en Cultura <ol><li> Alimentar y evaluar las culturas diaria. Manualmente las zonas especiales que presenta la diferenciación manifiesta raspando con una pipeta de vidrio estéril o micro punta de la pipeta. Cambiar los medios de comunicación después de la recolección diaria. </li><li> células de paso después de approximatamente cada cuatro días: Suavemente medios de aspirado, se añade 1 ml de dispasa caliente (1 mg / ml) por pocillo de una placa de 6 pocillos (la mitad del volumen de la alimentación), y luego se incuban a 37 ° C durante unos 4 minutos. Los bordes de las colonias empezarán a levantar, que se parece a un contorno blanco alrededor de la colonia. Se aspira suavemente la dispasa y se lava 3 veces con DMEM calentado / F12. </li><li> Añadir 2 ml mTeSR1 y usar un levantador de células para levantar las colonias de la placa. Utilice una pipeta serológica de 5 ml o micropipeta P1000 para triturar suavemente las células hasta que las colonias se dividen en grupos más pequeños. <ol><li> Evitar la producción de muy pequeños grupos o las células individuales, como la supervivencia y la posterior proliferación será sub-óptima. Cuando re-plating colonias, una mezcla 1: 4 a 1: 6 dividida mantendrá densidad de las colonias óptima. Retire con cuidado las colonias y los medios de comunicación de la placa y añadir a nuevos pozos, matrigel-revestido. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Células epiteliales nasales (CNE) son una plataforma accesible para el estudio de la enfermedad de las vías respiratorias, y NEC-iPSCs ofrecen una buena posibilidad para explorar el desarrollo de la enfermedad, el tratamiento y la terapia 1,31,32. CNE se puede obtener fácilmente sin procedimientos nocivos potencialmente estresantes o 6,23. En nuestra experiencia, la toma de muestras de la mucosa nasal como se describe en este protocolo parece ser menos estresante y sentir mejor, que la extracción d...

Células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras humanas (hiPSCs) son una tecnología en rápido desarrollo de la investigación de células madre. Ellos ofrecen una alternativa a la investigación con células madre embrionarias (células madre) con muchos menos inconvenientes éticos y morales 1,2. Aunque no son idénticos a epigenetically CMEh 3-5, hiPSCs ofrecen una forma única para modelar desarrollo y la enfermedad fenotipos, y que se pueden derivar de tejidos relevantes para el estado de la enfermedad 5-8. Se están explorando constantemente nuevos métodos de generación de hiPSCs para identificar tipos de células óptimas para empezar, como una manera de preparar iPSCs GMP calidad adecuadas para el trasplante, y también para aumentar la rapidez y la eficacia del proceso de reprogramación 6,9-11. Las células epiteliales de las vías respiratorias son fundamentales en el desarrollo de la inflamación alérgica 12, y el epitelio es un importante motor de las respuestas alérgicas y remodelación de las vías a través de la interacción con Immune y del estroma células. El epitelio de la vía aérea juega un papel esencial en el origen y persistencia de enfermedades pulmonares tales como asma. Sin embargo, las células epiteliales de las vías respiratorias inferiores son difíciles de obtener en un entorno clínico, en especial a partir de pacientes de control sanos y los niños. Los datos de varios estudios apoyan la premisa de que las células epiteliales de la mucosa nasal son un indicador válido y práctico para las células epiteliales de la vía aérea inferior 13-20, especialmente en el estudio de las respuestas a los contaminantes del aire y los alergenos. La mucosa nasal se compone de más del 90% de las células epiteliales de las vías aéreas ciliadas y el muestreo de estas células epiteliales nasales (CNE) se puede realizar fácilmente en niños a partir de cuatro o cinco años, ya que es menos invasivo que otras técnicas de muestreo de células / tejidos y está asociado con un riesgo mínimo de efectos adversos tales como la infección 20-23. Ofrece una forma rápida y sencilla a la muestra tanto en niños sanos y enfermos, sin tiempo, innecesaria, ya menudo dolorosa procedi broncoscopiares que requieren sedación. Estudios previos han encontrado que los subtipos de enfermedad relacionados con la gravedad del asma se pueden distinguir tanto en la mucosa nasal, así como muestras de células bronquiales tomadas de niños asmáticos, y la expresión génica entre los dos tipos de tejido fue similar en aproximadamente 90% de los genes no ubicuos 22 , 24. Como fuente para iPSCs, CNE ofrecen ventajas sobre otros tipos de células utilizadas con frecuencia. Los fibroblastos se utilizan a menudo para la generación de IPSC, pero aunque estas células pueden cultivarse fácilmente a partir de una biopsia de la piel, este proceso normalmente requiere anestesia local, una incisión, y las suturas, y se asocia con algún riesgo de infección. Por lo tanto, obtener el consentimiento informado de los pacientes de este tipo de biopsia puede ser difícil 25. Una alternativa a los fibroblastos son células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Sin embargo, puede ser difícil de obtener sangre suficiente para la generación de IPSC de pacientes pediátricos. Además, existen limitaciones de aguas abajo apcomplicaciones de fibroblastos y células iPS derivadas de células sanguíneas, especialmente su capacidad de diferenciación de ciertos tipos de células 5,26. Por lo tanto, dada la accesibilidad relativa y el bajo riesgo de efectos secundarios después de su recolección, CNE representan una fuente ideal de células para la generación de IPSC de la población pediátrica. iPSCs han recibido mucha atención recientemente como una plataforma para el estudio del desarrollo humano, la generación de nuevos modelos de enfermedad, y como una fuente potencial de células para terapias personalizadas. Antes de que el pleno potencial de esta tecnología se puede realizar, las bases moleculares del proceso de reprogramación necesitan ser dilucidado, pero por ahora este protocolo y los procedimientos descritos en aclararán los estudios de investigación se centraron en las exposiciones de las vías respiratorias, así como proporcionar una plataforma para estudiar los efectos de la medicina personalizada que involucra células iPS. El trabajo de colaboración de varios laboratorios ha llevado a la generation de una técnica con éxito, no sólo para el muestreo de la mucosa nasal, pero también el cultivo de los CNE, y la reprogramación de estas células a iPSCs 23. En este artículo se presenta un esquema de un protocolo para el muestreo óptimo, el cultivo, y las condiciones de reprogramación.

<table><tbody><tr><td>15 ml cónica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocolo Paso 1.1.</td></tr><tr><td>Protocolo BEGM</td><td></td><td>Lonza CC-3170</td><td>Paso 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Estreptococos/Fungicidas</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Paso 1.1 del protocolo.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocolo Paso 4.a.</td></tr><tr><td>Cepillo de citología cytosoft</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocolo Paso 1.2.</td></tr><tr><td>Protocolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Paso 2.1.</td></tr><tr><td>hemacitómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocolo Paso 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocolo Paso 2.2.</td></tr><tr><td>Clips de embudo de citología</td><td>Protocolo Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Paso 2.2.</td></tr><tr><td>embudo cytospin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocolo Paso 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Protocolo de</td><td>A78300003</td><td>Fisher Scientific Paso 2.2.</td></tr><tr><td>diapositiva en blanco</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocolo Paso 2.2.</td></tr><tr><td>Kit de tinción HEMA 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocolo Paso 2.2.</td></tr><tr><td>Cológeno dérmico bovino, tipo 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocolo Paso 3.2.</td></tr><tr><td>Matraz T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocolo Paso 3.3.</td></tr><tr><td>Protocolo de tripsina</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Paso 5.2.</td></tr><tr><td>Solución neutralizante de tripsina</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocolo Paso 5.2.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), esterilizado por calor a 65 &° C para 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocolo Paso 5.5.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Hybri-Max&trade;, filtrado estéril, BioReactivo, apto para hibridomas, &ge; 99.7%</td><td>Protocolo Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Paso 5.5.</td></tr><tr><td>lentivirus policisónico*<</td><td>em>p. ej. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocol Paso 6.4.&nbsp; Se enumera una fuente comercial de vector de reprogramación. Utilizamos de forma rutinaria el plásmido 4 en 1 reportado por Voelkel et al (PMID: 20385817) para generar internamente lentivirus de reprogramación policistrónico pseudotipado por VSV-G. Este plásmido se puede obtener contactando con &nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocolo Paso 6.4.</td></tr><tr><td>MEFs CF1 irradiados</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>Protocolo GSC-6301G</td><td>Paso 6.4.</td></tr><tr><td>Medios hESC</td><td>Consulte la receta incluida en el protocolo</td><td></td><td>Paso 6.11 del protocolo.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Paso 6.11 del protocolo.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Paso 6.11 del protocolo.</td></tr><tr><td>Tiazovivina&nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Paso 6.11 del protocolo.</td></tr><tr><td>Protocolo de 354277 Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td></td> con calificación <td>hESC Paso 6.13.</td></tr><tr><td>Placa Corning, 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocolo Paso 6.13.</td></tr><tr><td>Protocolo mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Paso 6.13.</td></tr><tr><td>Matraz filtrante desechable de 250 ml (0,22 y micro; m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispasa</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocolo Paso 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Paso 7.3 del protocolo.</td></tr><tr><td>elevador de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocolo Paso 7.4.</td></tr><tr>Los componentes del paso 6.11. del protocolo <td>hESC Media**</td><td></td><td></td> <td>deben mezclarse y luego esterilizarse con filtro. Los medios se pueden mantener a 4 & grados; C durante un máximo de dos semanas. Cuando caliente el medio, no lo deje a 37 °C; C más de 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 medios</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Concentración final Suero</td></tr><tr><td>de reemplazo KO (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &micro; g/ml Factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Las células epiteliales nasales (NEC) son la parte de las vías respiratorias que responden a los contaminantes del aire y son las primeras células infectadas con virus respiratorios. También están implicados en muchas enfermedades de las vías respiratorias a través de su respuesta inmunitaria innata y su interacción con las células inmunitarias y del estroma de las vías respiratorias. Las ECN son de particular interés para los estudios en niños debido a su accesibilidad durante las visitas clínicas. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) se han generado a partir de múltiples tipos de células y son una poderosa herramienta para modelar el desarrollo humano y las enfermedades, así como para sus posibles aplicaciones en medicina regenerativa. Este es el primer protocolo que establece métodos para la generación exitosa de iPSC a partir de NEC derivadas de participantes pediátricos con fines de investigación. Describe cómo obtener células epiteliales nasales de niños, cómo generar cultivos primarios de NEC a partir de estas muestras y cómo reprogramar NEC primarias en iPSC bien caracterizadas. Las muestras de mucosa nasal son útiles en estudios epidemiológicos relacionados con los efectos de la contaminación del aire en los niños y proporcionan una herramienta importante para el estudio de las enfermedades de las vías respiratorias. Las células nasales primarias y las iPSC derivadas de ellas pueden ser una herramienta para proporcionar material ilimitado para la investigación específica del paciente en diversas áreas de la biología epitelial de las vías respiratorias, incluida la investigación sobre el asma y la EPOC.

La parte inicial de la nariz, llamado el vestíbulo nasal, es el área rodeada por el cartílago 29. El cepillo tiene que ir sin problemas más allá de esta zona de la nariz, más allá de la válvula nasal (Internum ostium, o el &quot;agujero negro&quot; que se ve en la parte posterior del orificio nasal), y la muestra se obtiene a partir del cornete inferior (Figura 1). Los cornetes nasales son estructuras óseas que aumentan el área de superficie de la nariz 2...

Esta publicación demuestra métodos para el muestreo y cultivo exitosos de mucosa epitelial nasal de niños, y la reprogramación de estas células a Células Madre Pluripotentes (iPSCs) inducidas.

Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células epiteliales nasales obtenidas de niños y reprogramarlas en células madre pluripotentes inducidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades respiratorias, como el desarrollo del asma. La principal ventaja de esta técnica es que permite recolectar células epiteliales de las vías respiratorias de niños sin procedimientos estresantes.En cultivo, estos se encuentran en una población homogénea y sirven como una excelente fuente para generar células madre pluripotentes inducidas o iPSC. Tuvimos por primera vez la idea para este estudio cuando hablamos con los doctores Ji y Hershey sobre su investigación para recolectar células mesoepiteliales de niños con el fin de investigar la variación epigenética en el asma y la contaminación del aire.La demostración visual de estas técnicas es fundamental porque la toma de muestras nasales y la reprogramación a iPSCs de células epiteliales nasales son técnicas difíciles de aprender, ya que se basan en la experiencia personal y no en protocolos establecidos. Antes de la visita del participante, transfiera dos mililitros de medio de crecimiento para epitelio bronquial fresco, abreviado como BEGM, a un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, añada a este medio 20 microlitros de una mezcla de penicilina, estreptomicina y anfotericina B hasta una concentración final del 0,01 %. Cuando el participante llegue, indíquele que se siente en una silla.Luego, abra un cepillo de citología inmediatamente antes de tomar la muestra y no lo toque contra ninguna superficie para asegurar que permanezca estéril. A continuación, indique al participante que permanezca quieto y que incline la cabeza hacia arriba, en dirección al techo. Si está inquieto, pídale que se siente sobre las manos para que no intente apartar el cepillo.A continuación, dirija e introduzca el cepillo hacia la parte posterior de la nariz donde el conducto se estrecha. Posteriormente, retire el cepillo de la fosa nasal deslizándolo hacia abajo con un movimiento de giro de la muñeca. A continuación, coloque el cepillo en el tubo cónico previamente preparado y asegúrese de que quede sumergido en BEGM.Luego corte la porción excesiva del cepillo y coloque la tapa en el tubo. Después de haber recolectado la muestra, colóquela inmediatamente en un vaso de precipitados lleno con agua tibia para mantenerla lo más cercana posible a 37 grados Celsius. A continuación, trasládela al laboratorio.Una vez en el laboratorio, agite suavemente el cepillo en el BEGM. A continuación, retire 10 microlitros de la muestra y añada 10 microlitros de un colorante para células vivas/muertas. Proceda a introducir esta mezcla en un hemocitómetro.Y cuente únicamente las células viables bajo un microscopio. Tras el recuento celular, tome 50 microlitros de la muestra y proceda a diluirla hasta 200 microlitros con PBS 1X. Transfiera el resto de la mezcla celular sin diluir, junto con el cepillo, a un baño de agua regulado a 37 grados Celsius hasta la siembra celular.Proceda a agregar la muestra diluida en PBS a un embudo de citocentrifugación fijado a un portaobjetos de vidrio. Y centrifugue todo el aparato a 400 rpm durante dos minutos. Posteriormente, retire el embudo y deje secar el portaobjetos durante la noche en la oscuridad.Después de teñir el portaobjetos con Hema 3, como se describe en el protocolo del texto, obsérvelo al microscopio y cuente las células. Identifique las células epiteliales por sus características únicas: forma columnar, cilios y un núcleo redondeado, y determine el porcentaje de estas células en la preparación.Para comenzar la siembra, agite suavemente el cepillo dentro del tubo cónico dentro de una campana de cultivo celular certificada y luego retírelo del tubo. Posteriormente, gire suavemente el cepillo sobre la superficie interna de un frasco T25, previamente recubierto con colágeno dérmico bovino, teniendo cuidado de no rayar el recubrimiento. A continuación, deseche el cepillo en un recipiente adecuado para residuos biopeligrosos.Pipetee lentamente las células restantes en BEGM desde el tubo cónico hasta el matraz T25, al menos siete veces diez a la quinta células. Proceda a observar las células bajo un microscopio invertido. Después de cultivar y pasar las células, como se describe en el texto, proceda a sembrar cinco veces diez a la quinta células epiteliales nasales en dos mililitros de BEGM por pocillo en una placa de cultivo celular de seis pocillos.Luego, incubar las células durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Tras la incubación, asegurarse de que las células estén proliferando robustamente. A continuación, añadir Polibreno a cada pozo que contenga BEGM hasta una concentración final de ocho microgramos por mililitro en una campana extractora.Proceda a transducir las células epiteliales nasales agregando partículas lentivirales, que expresan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, al medio en cada pocillo según se describe en el protocolo del texto. Después de incubar las células transducidas durante aproximadamente tres horas, retire el medio que contiene el virus y desecharlo siguiendo los procedimientos aprobados institucionalmente. Luego, reemplace este medio con BEGM y regrese las células epiteliales nasales transducidas al incubador.Después de tres días, reemplace el medio con BEGM fresco. Luego, incube las células transducidas en las mismas condiciones. Al día siguiente, agregue una solución de gelatina al 0,1 % a dos pocillos de una placa de seis pocillos para comenzar a preparar placas recubiertas con fibroblastos embrionarios de ratón.Luego, cubra la placa con su tapa correspondiente e incúbela durante la noche a 37 grados Celsius. El día cinco, proceda a descongelar un vial que contiene aproximadamente 5 veces 10 a la quinta de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados, abreviados como MEFs. Luego, coloque estas células en 10 mililitros de medio para MEFs.Y proceda a centrifugarlos a 200 x g durante cinco minutos. Posteriormente, aspire el sobrenadante y re suspenda los MEFs en el mismo medio. Una vez que se hayan contado estas células, aspire la solución de gelatina de la placa de seis pocillos previamente preparada.A continuación, agregue 1,87 × 10⁵ MEFs en cada pocillo recubierto con gelatina de la placa e incube a 37 °C durante un mínimo de 24 horas. Luego, en el día seis de cultivo, aspire el medio gastado de las células transducidas y lávelas con PBS 1X. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina al 0,05 % en cada pocillo de la placa.Después de que las células se desprendan, proceda a neutralizar con solución neutralizante de tripsina o TNS, luego recolecte y centrifugue las células como se explicó anteriormente. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en cuatro mililitros de BEGM, suplementado con penicilina y estreptomicina. A continuación, introduzca dos mililitros de esta suspensión celular en cada pocillo recubierto con gelatina y MEF de la placa previamente preparada.Después de incubar las células durante la noche, sustituya el BEGM con 2,5 mililitros de medio estándar de células madre embrionarias humanas, abreviado como medio hESC, que contenga cuatro nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico. Proceda a cultivar las células y renueve el medio diariamente con medio hESC fresco hasta observar colonias similares a hESC, que alberguen células madre pluripotentes inducidas putativas, o iPSCs, en los cultivos. Excise manualmente estas colonias y transfiéralas a pozos separados de una placa de 24 pozos para cultivarlas y expandirlas como líneas independientes en un sistema libre de células alimentadoras.Inicialmente, las muestras nasales son una mezcla de tipos celulares y restos celulares. Sin embargo, tras el cultivo y los cambios de medio, las células epiteliales se vuelven predominantes en estas preparaciones, como se muestra en esta imagen tomada un día después del pase celular. Aquí, las células epiteliales, creciendo hasta alcanzar la confluencia, muestran núcleos grandes y citoplasma alargado.Debido a las propiedades de las partículas lentivirales utilizadas en este estudio, cuando tales células epiteliales nasales son transducidas, expresan el marcador fluorescente tdTomato, como se demuestra en la imagen superior derecha de las células, cuatro días posteriores a la transducción. Una comparación con la imagen correspondiente de campo claro revela que no todas las células muestran señal de tdTomato, como lo evidencia la imagen fusionada en la parte inferior. Por lo tanto, no todas las células son transducidas.Sin embargo, la eficiencia de transducción es aproximadamente del 90 %. Cuando las células epiteliales nasales transducidas se cultivan según se describe en el protocolo, dan lugar a colonias de iPSC. Tras la recolección de las colonias de iPSC y su cultivo en condiciones estándar sin células alimentadoras, las células individuales de dichas colonias mostraron una morfología típica semejante a la de las hESC, como forma redondeada, núcleo grande y alta relación núcleo-citoplasma, tal como se observa en esta imagen ampliada. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora y media, si se lleva a cabo adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar la muestra correctamente, mantener las células a 37 grados Celsius y sembrarlas lo más rápidamente posible a la densidad adecuada. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como establecer una interfaz aire-líquido utilizando células epiteliales nasales primarias, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo el epitelio respiratorio responde a alérgenos y patógenos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores modelaran enfermedades como el asma, la EPOC y la fibrosis quística.Esta técnica también ayuda a estudiar los efectos ambientales sobre el desarrollo pulmonar en el sistema humano in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo cultivar células epiteliales nasales de niños y generar iPSCs a partir de esta población. Dado que trabajamos con células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas, recuerde siempre cumplir con las directrices institucionales y nacionales.

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral /...

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Expansión de las células epiteliales del esófago pediátricos humanos que utilizan reprogramación condicional proporciona a los investigadores con una población específica del paciente de las células que puede ser utilizada para la ingeniería de las construcciones de esófago para la implantación autóloga para tratar defectos o lesiones y servir como depósito para ensayos de cribado de terapéuticas.

La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Los avances recientes en los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos permiten la derivación gradual de tipos de células específicas de órganos. Aquí, proporcionamos pasos detallados para el mantenimiento y la expansión de las células basales de las vías respiratorias derivadas de iPSC y su diferenciación en un epitelio mucociliar en cultivos de interfaz aire-líquido.

Generación de cultivos de interfaz aire-líquido de células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas

Aprende a cultivar células epiteliales nasales de niños y reprogramarlas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Este método no invasivo permite obtener una población homogénea para investigar el desarrollo del asma y enfermedades respiratorias.

Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas

Explorar más videos