Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

El objetivo general de estos experimentos es examinar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión y liberación de colorante de microportaobjetos es útil para el descubrimiento funcional de nuevos antimicrobianos con actividad lítica frente a dianas específicas, como una bacteria patógena de interés. Las principales ventajas de estas técnicas son que son sencillas de ejecutar, proporcionan flexibilidad para la variación de los parámetros experimentales y se pueden realizar con equipos de laboratorio que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios de microbiología.

Antes de comenzar el ensayo de difusión de microportaobjetos, la concentración de la enzima antimicrobiana que se va a evaluar debe determinarse utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realice una dilución en serie de la enzima antimicrobiana, utilizando PBS como tampón de reacción. Dispense la proteína en tubos de microfuga individuales y ajuste los volúmenes a 20 mililitros usando PBS.

A continuación, prepare una solución de agarosa al 0,5% disolviendo 0,25 gramos de agarosa en 50 mililitros de PBS. Caliente esta solución hasta que hierva hasta que la agarosa se disuelva por completo. Determine el agua perdida durante el proceso de fusión en peso y vuelva a agregarla a la solución.

Para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes durante la incubación del ensayo, agregue 15 microlitros de azida de sodio al 10% en agua a la solución de agarosa y ajuste la temperatura de la solución a 50 grados Celsius en un baño de agua. Si se utilizan células viables como sustrato, omita la azida de sodio de la solución de agarosa. Descongele el sustrato bacteriano matado por calor en hielo.

Vuelva a suspender el sustrato bacteriano en 12 mililitros de la solución de agarosa para que coincida aproximadamente con la turbidez de un estándar de turbidez de equivalencia de McFarland 2.0. Comparar las turbidez de las soluciones visualizando una línea negra sobre un fondo blanco a través de las soluciones, añadiendo sustrato bacteriano a la agarosa hasta conseguir la turbidez aproximada. Inmediata pero cuidadosamente, pipetee tres mililitros de la solución de sustrato de agarosa en cada microportaobjetos, asegurándose de que la solución no se desborde del microportaobjetos.

Una vez que los portaobjetos se hayan solidificado, utilice un perforador de corcho de 4,8 milímetros de diámetro para perforar tres pocillos en la capa de sustrato de agarosa de cada portaobjetos. Agregue 20 microlitros de cada dilución en serie de proteína ajustada a los pocillos respectivos. Utilizar albúmina sérica bovina en un pozo de control negativo.

Como control positivo, utilice enzimas bacteriolíticas conocidas y apropiadas para el sustrato, como la lisozima. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad a 37 grados centígrados, o la temperatura óptima de actividad de la enzima. La duración de la incubación depende de la concentración y la actividad específica de la enzima antimicrobiana.

Un tiempo de reacción típico es de aproximadamente 16 horas. Una vez finalizada la incubación, observe los portaobjetos bajo luz indirecta y capture imágenes del ensayo en desarrollo. Utilice una cámara réflex digital de un solo lente con una lente de 60 milímetros a una distancia focal de aproximadamente 30 centímetros.

En el ensayo de liberación de colorante que se demostrará en el siguiente segmento, el sustrato se une covalentemente al colorante Remazol Brilliant Blue R o RBB. Comience este protocolo haciendo una solución RBB de 200 milimolares. Disuelva 1,25 gramos de RBB en una solución de hidróxido de sodio recién preparada.

A continuación, vuelva a suspender las células bacterianas muertas por calor a una concentración de 0,5 gramos de peso húmedo en 30 mililitros de solución RBB. Para el peptidoglicano purificado, vuelva a suspender el peptidoglicano a una concentración de 0,3 gramos de peso húmedo en 30 mililitros de solución RBB. Dado que los pasos posteriores son los mismos, independientemente del sustrato utilizado, el etiquetado se demostrará solo para las células bacterianas.

Incubar la mezcla de reacción en una plataforma giratoria durante seis horas a 37 grados centígrados con una mezcla suave. Después de seis horas, transfiera la mezcla de reacción a una incubadora de cuatro grados centígrados e incube durante 12 horas adicionales con una mezcla suave. Una vez finalizada la incubación, coseche el sustrato teñido por centrifugación a 3000 x g durante 30 minutos.

Decanta la solución de tinte del pellet de sustrato. Vuelva a suspender completamente el pellet en agua Tipo I seguido de centrifugación. Riegue las células marcadas con tinte de tres a cinco veces de esta manera para eliminar el tinte soluble no unido covalentemente de los sustratos.

Para los lavados finales, transfiera la porción de gránulos que se utilizará en el ensayo de liberación de tinte a tubos de microfuga de 1,5 mililitros. El sobrenadante del último lavado debe ser transparente mientras que el sustrato permanece azul. Guarde el sustrato teñido suspendido en una cantidad mínima de agua a 20 grados centígrados hasta que esté listo para su uso.

Para prepararse para el ensayo de liberación de colorante, deje que el sustrato teñido congelado vuelva a temperatura ambiente y lave dos veces con el tampón de ensayo que se determinó empíricamente para la enzima. En este caso se utiliza PBS. Calcule el volumen de la suspensión de sustrato que se necesita multiplicando el volumen de reacción de 200 microlitros por el número de ensayos de liberación de colorante que se realizarán.

Para preparar la suspensión del sustrato, primero agregue el sustrato teñido hasta el volumen apropiado de PBS. Haga una dilución uno a uno y tome una medida inicial de la densidad óptica a 595 nanómetros, usando PBS como blanco. Agregue cantidades incrementales del sustrato teñido a la suspensión hasta lograr una densidad óptica de 2.0 a 595 nanómetros.

En esta demostración, se utilizará el ensayo de liberación de colorante para determinar las condiciones óptimas de incubación de una proteína antimicrobiana. En primer lugar, prepare una suspensión antimicrobiana de proteína madre ajustando la concentración a un miligramo por mililitro utilizando PBS como se describe en el texto del protocolo. A continuación, diluya la suspensión antimicrobiana de proteína madre a una concentración de 100 nanogramos por microlitro.

Esta concentración da una masa de reacción final de un microgramo de proteína por volumen añadido a la reacción del ensayo. Realizar los ensayos de reacción en tubos de microfuga de 0,5 mililitros para evaluar el rango térmico. Para cada condición térmica, agregue 10 microlitros de la proteína madre a 200 microlitros de suspensión de sustrato preparada.

Incubar en un termociclador durante ocho horas con mezcla por inversión una vez por hora. Después de la incubación, detenga las reacciones agregando 25 microlitros de etanol a cada tubo de microfuga. Para eliminar el sustrato insoluble no digerido, centrifugar a 3000 x g durante dos minutos.

Después de eso, teniendo cuidado de no alterar el pellet de sustrato no digerido, transfiera 150 microlitros del sobrenadante de reacción para cada mezcla de reacción a una microplaca de fondo plano de 96 pocillos. Para cuantificar la actividad enzimática, utilice un espectrofotómetro de microplacas para medir la absorbancia del sobrenadante a 595 nanómetros. El aumento de la absorbancia por el colorante soluble liberado en el sobrenadante desde el sustrato marcado es una medida cuantitativa de la actividad enzimática.

El ensayo de difusión de microportaobjetos se utilizó para evaluar cualitativamente la actividad de una proteína antimicrobiana desconocida contra el sustrato de células enteras de Salmonella enterica muerto por calor. El antimicrobiano se añadió en cantidades crecientes desde los pocillos A a F, y se utilizó PBS para los controles negativos. Después de seis horas, se observó el tamaño de la zona clara de hidrólisis que se formaba alrededor de cada pozo.

La alta actividad enzimática se relaciona cualitativamente con una zona más grande, mientras que la baja actividad enzimática se relaciona cualitativamente con una zona más pequeña. Se utilizó el ensayo cuantitativo de liberación de colorante para determinar la temperatura de reacción óptima para una proteína antimicrobiana. Como se ve en las cantidades de color azul en los sobrenadantes de reacción y las unidades de actividad derivadas de las mediciones de absorbancia a 595 nanómetros, 35 grados Celsius es la temperatura óptima.

El ensayo de liberación de colorante también se utilizó para determinar el rango de actividad de una proteína antimicrobiana desconocida contra el sustrato matado por calor de Bacillus subtilis. Una comparación con el rango de actividad de la alfa-quimotripsina reveló que la enzima antimicrobiana desconocida tiene casi el doble de afinidad por el sustrato. Además, mientras que la actividad de la alfa-quimotripsina comienza a estabilizarse alrededor de los 0,3 microgramos, la actividad de la enzima desconocida continuó aumentando en todas las cantidades de enzimas.

Una vez dominado, el ensayo de difusión de microportaobjetos puede completarse en 30 minutos. El ensayo de liberación de tinte puede completarse en una hora. Los tiempos de incubación de cada ensayo dependerán de la actividad enzimática y de sus concentraciones.

Ampliando estos procedimientos, el método de liberación de colorante puede modificarse para determinar las influencias químicas que afectan a la actividad enzimática de la enzima antimicrobiana mediante la manipulación de aspectos de la reacción como el pH y la salinidad del tampón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas mediante los ensayos de difusión de microportaobjetos y liberación de colorantes.