Mecanismo de regulación de los números de adipocitos en los organismos adultos a través de diferenciación y apoptosis La homeostasis

Los objetivos generales de estos experimentos son analizar la homeostasis y diferenciación de los adipocitos e investigar los mecanismos de la hipoxia y la apoptosis de los adipocitos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo metabólico, como la obesidad y la diabetes tipo II. La principal ventaja de esta técnica es que son procedimientos básicos y económicos es que el análisis de la biología de los adipocitos en su modelo particular de estudios.

Nicole Hannemann, una estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrará los procedimientos. Para cuantificar la hipoxia in vivo, primero se determina el peso corporal del ratón. A continuación, inyecte 60 mg por kg de peso corporal de pirocloruro de pimonidazol sólido por vía intraperitoneal.

Después de 45 minutos, sujete las extremidades del animal y abra la cavidad peritoneal. Extraiga las almohadillas de grasa perigonadal izquierda y derecha de la cavidad y retire los tejidos gonadales de las almohadillas. A continuación, pesa el tejido para determinar la proporción de la almohadilla de grasa por peso corporal en gramos.

Para realizar el análisis histológico de la homeostasis de los adipocitos, primero se desparafinan las secciones de tejido adiposo con tres lavados de cinco minutos en xileno, seguidos de dos rehidrataciones de dos minutos en etanol al 100% y dos rehidrataciones de dos minutos en etanol al 96%. A continuación, lavar las secciones en agua destilada durante cinco minutos y teñirlas con hematoxilina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las secciones en agua durante otros cinco minutos, seguido de una tinción de 30 segundos con una solución de eosina.

Lave las secciones como se acaba de demostrar. A continuación, deshidratar las secciones en etanol al 96% y etanol al 100% dos veces cada una durante dos minutos. Seguido de tres incubaciones de xileno de cinco minutos.

A continuación, monte las secciones con un agente de montaje anhidro. Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos, desparafinar las secciones como se acaba de demostrar, seguido de una digestión de 30 minutos con solución de trabajo de proteinasa K a 37 grados centígrados. Al final de la digestión, enjuague los tejidos en PBS y bloquee la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 10 minutos.

Después de dos lavados posteriores de cinco minutos en PBS, bloquee cualquier unión de anticuerpos no específicos con el suero al 10% en PBS. A continuación, incubar los tejidos y los anticuerpos de interés a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague las secciones con tres lavados de cinco minutos en PBS.

A continuación, incubar los tejidos con los anticuerpos secundarios biotinilados adecuados durante una hora a temperatura ambiente. Durante los últimos 30 minutos del período de marcaje de anticuerpos secundarios, equilibre 50 microlitros de solución de avidina con 50 microlitros de peroxidasa H biotinilada por sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar las secciones dos veces durante cinco minutos cada una en PBS y tratar los tejidos con 100 microlitros de avidina biotina ABC complex a temperatura ambiente.

Después de 45 minutos, lavar las secciones dos veces en PBS e incubar los tejidos en la solución de sustrato de peroxidasa hasta que la tinción alcance el nivel adecuado de intensidad. Ahora lave las secciones durante cinco minutos con agua destilada y contratiña las células con hematoxilina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de contramanchar, vuelva a lavar los pañuelos con agua.

A continuación, deshidrate las secciones y utilice un agente de montaje anhidro para montar las muestras con cubreobjetos. A continuación, las secciones se pueden evaluar bajo un microscopio de campo claro. Comience separando la piel del ratón macho adulto de la parte superior de la pata, el lomo y el flanco, sujetando la piel a medida que se retira.

A continuación, se extrae el tejido adiposo subcutáneo posterior que rodea los ganglios linfáticos inguinales situados en la base de las patas traseras para el cultivo de los adipocitos. Para analizar la diferenciación adipogénica, coloque el cultivo de células adiposas diferenciadas bajo una campana extractora y lave suavemente las células con PBS. A continuación, fije las células en dos ml de formalina al 10% durante 60 minutos.

Al final de la fijación, lavar las células con agua y tratar el cultivo con dos mililitros de isopropanol al 60% durante cinco minutos, seguidos de dos mililitros de solución de trabajo de aceite rojo O. Después de cinco minutos, enjuague las celdas con agua del grifo hasta que el agua salga clara. Y contratinción de las células con hematoxilina como se acaba de demostrar.

A continuación, las células pueden evaluarse bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 100 veces. Los lípidos de los adipocitos aparecerán rojos y los núcleos azules. Aquí se muestran secciones de la almohadilla de grasa de ratones de dieta normal y alta en grasas.

La cuantificación del tamaño y el área de los adipocitos demuestra claramente la hipertrofia de los adipocitos después de seis semanas de una dieta alta en grasas, como lo demuestra el aumento del tamaño de los adipocitos en los animales tratados con una dieta alta en grasas. En ratones que habían sido tratados con el marcador hipóxico pimonidazol, el aumento del estado hipóxico del tejido adiposo se acompaña de un aumento de los adipocitos HIF1 alfa positivos. Además, la tinción en túnel de secciones adiposas de compañeros de camada knock out y control demuestra que un aumento en la apoptosis de los adipocitos se correlaciona con la presencia de hipoxia y la expresión del factor alfa 1 inducible hipóxico.

Como era de esperar, la expresión de Hif1a en los adipocitos aumenta después de 24 horas de hipoxia. Además, la cuantificación de los genes diana de Hif mediante QPCR indica que el aumento de la expresión de Hif1a en condiciones hipóxicas conduce a un aumento de la expresión de ARNm de Inos. Sin embargo, el silenciamiento de Hif1 o 2 alfa por interferencia de ARN rescata a los adipocitos de la apoptosis en condiciones hipóxicas, lo que confirma el papel regulador sensorial de la hipoxia de Hif alfa en la apoptosis de los adipocitos.

Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar todos los ensayos, como la determinación de la resistencia a la glucosa y la insulina, para responder preguntas adicionales sobre el cambio metabólico y la disfunción de los adipocitos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis histológico de los estudios de apoptosis e hipoxia de los adipocitos.