Name: Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a evaluar la función hemostática de plaquetas almacenadas mediante cámaras de flujo microfluídico con sangre reconstituida. Este método permite analizar la adhesión plaquetaria sobre colágeno en condiciones de flujo hidrodinámico.

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Los autores no tienen agradecimientos.

Este protocolo sigue las directrices éticas institucionales para la investigación en muestras humanas y el consentimiento informado se obtuvo de todos los donantes involucrados. La aprobación de los experimentos descritos aquí se obtuvo de la junta de revisión institucional del Hospital de la Universidad de Amberes. Nota: Las indicaciones de temperatura son siempre la temperatura ambiente, a menos que se especifique. 1. Configuración de la cámara de flujo Preparación <ol><li> Los carriles se preparan, intubación y prendedores <ol><li> Vortex la suspensión de colágeno vigorosamente y se diluye 1/20 en la solución de glucosa isotónica suministrado por el proveedor para una concentración final de 50 mg / ml. NOTA: Nosotros usamos colágeno de tendón equino, hecha principalmente de tipo I fibrillas. El equino colágeno tipo I se refiere a menudo como &quot;Horm&quot; colágeno y es el estándar de oro para este tipo de ensayo 9, tanto por razones históricas, así como biológicos. humano de tipo colágeno III también se puede utilizar, pero THe fibrillas capa menos bien y la respuesta de las plaquetas no es tan fuerte. Otras superficies de revestimiento también se pueden utilizar, por ejemplo factor de von Willebrand (VWF), el fibrinógeno, la fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 o combinaciones de éstos 16. </li><li> Tome un nuevo biochip desechable desde el recipiente del proveedor. Las dimensiones de los biochips utilizados aquí son 0.4W x 0,1H x 20L en mm 3. </li><li> Pipetear 0,8 l en el carril (s) del biochip de microfluidos en un extremo del chip y la marca como de salida. Asegúrese de que el carril está vacío 5/6 ° con el colágeno que contiene la solución de revestimiento preparada en el apartado 1.1.1. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Nota: Los canales están revestidos parcialmente para evitar la acumulación de fibras de colágeno en la entrada del canal (véase la discusión). </li><li> Se incuba a 4 ° C durante 4 horas o durante la noche en un recipiente humidificado y cerrada. </li><li> Bloquear los canales revestidos pipeteando tampón de bloqueo (1,0% (w v) de suero / albúmina bovina unad 0,1% (w / v) de glucosa en mM solución salina 10 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tamponada (HBS; 0.9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) en el otro extremo y la marca como entrada. Asegúrese de que el carril está completamente lleno con el tampón de bloqueo evitando las burbujas de aire. </li><li> Cortar un tubo a igual longitud (12 cm). Utilice uno por carril y conectar cada tubo con un alfiler. Por ejemplo, un experimento que compara dos condiciones, por duplicado requerirá cuatro tramos de tubería y cuatro pasadores para ser preparados. </li><li> Enjuague el tubo con agua destilada utilizando una jeringa y una aguja de 26 G o los conectores que se acompañan. </li><li> Saturar el tubo con tampón de bloqueo. Almacenar en un recipiente cerrado y humidificado durante un mínimo de 1 hora. </li></ol></li><li> Preparación de la bomba y el colector <ol><li> Enjuagar la bomba y el colector con agua destilada, eliminar las burbujas de aire. </li><li> Aspirar el tampón de bloqueo fuera del carril (s) biochip usando la punta 10 l fija en la salida. Limpiar la superficie deel biochip con un polvo de precisión sin pelusa y alcohol desnaturalizado para eliminar huellas y polvo. </li><li> Fijar el biochip en una platina del microscopio automatizado. Si se utiliza más de un carril de forma simultánea en una sola carrera, conectar el divisor múltiple de ocho carriles a la salida de biochips. Nota: El divisor de colector de ocho carriles es una pieza de hardware (Figura S1) conectado a la bomba y el biochip. Se permite el funcionamiento de todos los carriles (ocho) disponibles en un biochip o una combinación de carriles que pueden ser definidas por el operador en el software adjunto. </li><li> Utilice las clavijas en el tubo para fijarlos en la entrada del biochip. Coloque el otro extremo del tubo (sin pin) en un tubo de ensayo cónico de 1,5 ml lleno con HBS. Enjuague todos los tubos y sus carriles conectados con 1 ml de HBS usando la bomba, a fin de eliminar resto tampón de bloqueo y mal adheridas colágeno. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de muestras de sangre <ol><li> Recogida y separación desangre total fresca de un voluntario sano. 17 <ol><li> Recoger los primeros ml de sangre en un tubo al vacío que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y utilizar exclusivamente esta muestra para recuento sanguíneo completo (CBC) con un analizador hematológico automatizado. </li><li> Recoger un volumen de sangre en un anticoagulante adecuado utilizando tubos de vacío. anticoagulantes estándar para experimentos en cámara de flujo son heparina o hirudina cuando formación de fibrina no es parte del protocolo de estudio y citrato de sodio cuando es. Nota: La heparina se utiliza como anticoagulante para todos los experimentos descritos en los resultados. Nota: La cantidad de sangre depende del número de experimentos a realizar. Aproximadamente 1 tubo (7 ml) durante 3 carriles. </li><li> Colocar los tubos en un rotador a la espera de la reconstitución de la sangre. Nota: El ensayo debe ser completado dentro de 3 horas de la flebotomía. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico en plaquetas (PRP). No utilice la ruptura centrífuga para evitar la perturbación de la pastilla sin apretar. <ol><li> Cuando se recogió más de un tubo, en común la sangre en un único tubo de centrifugación cónico. Nota: La centrifugación se puede hacer más lenta o menos largo, en función del rendimiento de PRP y la &quot;contaminación&quot; diferencial celular preferida. </li></ol></li><li> Retire y deseche el PRP y la capa leucocitaria produciendo glóbulos rojos empaquetados con pocas plaquetas. Nota: El número de plaquetas en la fracción de glóbulos rojos es de 13 ± 5 x 10 3 por l (media ± SD, n = 12) en promedio en nuestras manos. </li></ol></li><li> La reconstitución de sangre <ol><li> grupo sanguíneo AB deshielo (Rhesus D negativo) de plasma a 37 ° C durante 5 min y 20 seg por 4 ml. </li><li> Determinar el hematocrito de los glóbulos rojos concentrados preparados en 2.1.5 utilizando un analizador de hematología automatizado. </li><li> Determinar la concentración de plaquetas en el banco de sangre preparado de plaquetas concentrado that se utilizó para reconstituir la fracción de glóbulos rojos por encima. </li><li> Calcular el volumen de glóbulos rojos empaquetados y concentrado de plaquetas que producirán el 40% de hematocrito y 250 x 10 $ ³ $ plaquetas / l en una muestra de 1 ml. Nota: Otros títulos de destino de las células se pueden fijar arbitrariamente, dependiendo del protocolo de estudio. </li><li> Transferencia de glóbulos rojos empaquetados y plasma en un tubo fresco usando una punta de pipeta recortado y agregar el concentrado de plaquetas hasta que se alcanza un volumen de muestra de 1 ml. Nota: En función de las variables estudiadas, la fracción de plasma debe ser igual en todas las muestras reconstituidas porque plasma tiene una influencia significativa en la tasa de formación de trombos. Por ejemplo, ciclos de congelación-descongelación o plasma tomado de diferentes donantes o en diferentes anticoagulantes puede influir en el resultado. </li><li> Mezclar la sangre reconstituida suavemente por inversión y realizar un hemograma completo. </li><li> Preparar una muestra de control &quot;en blanco&quot; en el que se sustituye el volumen de la fracción de plaquetaspor el mismo volumen de 0,9% (m / v) de cloruro sódico en agua para determinar la concentración de plaquetas endógenas (es decir, las plaquetas de banco no sanguíneos) en la sangre reconstituida usando un CBC. </li></ol></li><li> etiquetado <ol><li> Pipetear 1 ml reconstituidos sangre en un tubo de ensayo que contiene 1 l 5 mM de calceína AM (5 M de concentración final). Nota: Otros colorantes cubetas se pueden utilizar 14. </li><li> Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de su uso. </li></ol></li></ol> 3. Ensayo de perfusión <ol><li> Enfoque el objetivo sobre las fibras de colágeno adheridas en la parte inferior de los carriles. Lo ideal es utilizar la configuración de contraste diferencial de interferencia (DIC) de contraste de fase o de esta estrategia de enfoque. Seleccione &#39;Z actual Conjunto para las regiones de azulejos seleccionados&#39; en el software experimento para corregir digitalmente los Z-posiciones seleccionadas. </li><li> Seleccionar una región de interés (ROI) en el carril (xy) en el software de experimento de la microscope que será grabado durante el experimento. Nota: El rendimiento de la inversión puede ser cualquier superficie escogida arbitrariamente dentro de un carril de perfusión. Es aconsejable no para analizar la formación de trombos cerca de la entrada y salida de un carril para que para evitar efectos secundarios del perfil de flujo variable en esa región, a pesar de que esto es relativamente pequeño. El área de superficie ROI debe contener un número significativo de plaquetas o trombos para permitir la nivelación de la señal. En este protocolo la ROI es un agregado cosido digital de tres imágenes del mismo tamaño de lado a lado que resulta en 0,62 mm 2 en el medio de los 2 cm de largo carril. </li><li> Mezclar suavemente las muestras por inversión y la posición de éstas junto al biochip en el escenario automatizado. </li><li> Coloque el tubo que está conectado con la entrada del biochip en los tubos de ensayo que contienen las muestras de sangre reconstituidas. </li><li> Poner en marcha la bomba a 50 dinas / cm 2 (u otras tensiones tangenciales como se desee) para los canales vinculados a tubos de ensayoque contiene las muestras de sangre reconstituidos utilizando el software de la bomba. Nota: Otros esfuerzos de corte pueden ser utilizados. </li><li> grabar imágenes cada 15 segundos durante 5 minutos en tiempo real usando el software de adquisición y el experimento del microscopio. Nota: Otra serie de tiempo se puede utilizar dependiendo de la configuración experimental. Nota: Generalmente usamos un aumento de 100X (10X y 10X objetivo lentes), pero mayor (o menor) de ampliación se puede utilizar fácilmente como una alternativa. </li></ol> 4. Enjuague <ol><li> Lavar todos los tubos unido a la salida y conectado al colector de multicanal o de la bomba con agua destilada, seguido de hipoclorito de sodio (lejía) 0,5% (v / v) y, finalmente, NaOH 0,1 M en agua. Desechar el tubo fijado a la entrada del biochip como residuos peligrosos. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Determinar la cinética de crecimiento de trombos con el software de análisis de imágenes. Los siguientes comandos son específicos para ZEN2012. <ol&gt; <li> Análisis abrir el complemento de imagen para determinar la cobertura de la superficie de las plaquetas. </li><li> Establecer el umbral de fluorescencia en la pestaña Analizar interactiva para definir la intensidad de los píxeles que se correlaciona con una señal positiva, es decir, un plaquetas adheridas o plaquetas adheridas. </li><li> Utilice Crear tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo que contendrá las superficies separadas (en m 2) de esos &quot;objetos&quot; que contienen píxeles con una señal entre los umbrales seleccionados. Esto se realiza para cada punto de tiempo. Nota: Una vez que los umbrales de fluorescencia han sido elegido, el software de análisis detecta automáticamente &quot;objetos&quot; en el campo de visión de que cumplan los criterios. Estos objetos son trombos, pequeños agregados de plaquetas o plaquetas individuales y cubren un número de píxeles. Cada objeto aparece en la hoja de cálculo por separado. </li><li> Guarde estas hojas de cálculo en formato XML y abrirlos en una hoja de cálculopara los cálculos posteriores. </li><li> Total de las zonas de la superficie de los objetos seleccionados por la suma y dividir el resultado por el área total del campo de medición (m 2). Esto dará lugar a la cobertura de la superficie relativa (%). Hacerlo para cada punto de tiempo. </li><li> Trazar estas coberturas de superficie en función del tiempo de perfusión y calcular la pendiente por regresión lineal, obteniéndose la cinética de crecimiento de trombos de esa condición particular. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Experimentos en cámara de flujo de microfluidos son una excelente herramienta para investigar la función de las plaquetas en la sangre que fluye y se utilizan para evaluar la hemostasia in vitro en diversos contextos experimentales. A pesar de su falta de estandarización entre laboratorios 9, se demuestra que dentro de nuestro laboratorio de la variación experimental es aceptable. Esto permite comparar de forma fiable muestras pareadas () dentro de un determinado estudio. Este fue validado usando el ...

Hemostasis requiere la actividad combinada y regulada de células, proteínas, iones y tejidos en un contexto espacio-temporal restringida 1. actividad no controlada puede conducir a hemorragia o trombosis y la morbilidad o la mortalidad en un espectro de trastornos relacionados con la coagulación de la sangre. Un experimento de la cámara de flujo de microfluidos es una técnica difícil que imita hemostasis in vitro. Este enfoque permite la investigación de la compleja interacción de procesos que intervienen en la hemostasia con el protagonismo de las plaquetas sanguíneas. Después de una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las proteínas de la matriz subendotelial expuesta (glico) para prevenir la pérdida de sangre. Después de la adhesión, las plaquetas se activan y el agregado en respuesta a auto- y señalización paracrina que finalmente conduce a la formación de una red de plaquetas, fibrina y estabilizada por lo que resulta en una firma, la herida trombo 2 de sellado. A diferencia de la mayoría de las otras pruebas de la función plaquetaria, expetos con cámaras de flujo tienen en cuenta el parámetro físico del flujo sanguíneo y por lo tanto la influencia de la reología en las células y biomoléculas 3,4 participantes. experimentos en cámara de flujo han proporcionado multitud de datos de la señal en la hemostasia y la trombosis mediante la variación de los parámetros clave que influyen hemostático (sub) procesos, incluyendo los perfiles de matriz adhesiva, reología y de flujo, composición celular, presencia de toxinas o drogas, fuerza iónica y muchos más. En las últimas dos décadas, experimentos con la cámara de flujo bajo rendimiento que requieren grandes volúmenes de muestra (10-100 ml) se han desarrollado para cámaras de microfluidos menudo consisten en pequeñas cámaras de placas paralelas y que incluyen la tecnología moderna para la perfusión de sangre total en condiciones controladas muro de corte 5. Microscaling ha aumentado significativamente el rendimiento de ensayo sobre todo porque la instalación del hardware ha simplificado y se requiere menos volumen (sangre), lo que hace el experimento más accesible y VersatiLe. Por ejemplo, la sangre de los animales pequeños de laboratorio ahora puede ser utilizado sin la necesidad de sacrificar los animales. De este modo muestras de sangre de ratones modificados genéticamente han ayudado en la identificación de moléculas clave promover o inhibir la hemostasis y en nuevos conocimientos básicos 6. Laboratorios de investigación especializados a menudo todavía utilizan cámaras de flujo a la medida, por ejemplo de polidimetilsiloxano (PDMS) 7 que polimeriza en moldes litografiado que puede ser blueprinted por software. La cámara resultante es barato, desechable y se puede desmontar fácilmente para el análisis post hoc. Por otra parte, básicamente cualquier diseño de embarcaciones, incluyendo las bifurcaciones o giros bruscos se puede construir en el comando. Esta ventaja es también su lado negativo porque su normalización ya era el principal problema con experimentos en cámara de flujo, y PDMS encargo cámaras no han ayudado esto. En la parte superior de este tema en particular, recubrimiento (condiciones), sondas fluorescentes, anticoagulante, tempratura y el tiempo entre el muestreo y análisis están mal estandarizados 8. La estandarización de estas variables es un reto, pero no obstante necesario para permitir la comparación de resultados entre laboratorios. Este tema es el tema principal de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia en subcomité científico y Normalización en Biorheology 9,10. Los concentrados de plaquetas (PC) se transfunden en pacientes que sufren de diversas enfermedades que causan trombocitopenia y / o sangrado. Pero plaquetas en PC son conocidos para desensibilizar, especialmente en función del tiempo de almacenamiento 11, un proceso de deterioro relacionado con el envejecimiento y comúnmente conocida como lesión de almacenamiento de plaquetas. A veces se afirma que tales plaquetas restaurar en circulación una vez transfundida 12, pero la evidencia de esto es escasa. Además, la funcionalidad de las plaquetas que forman un PC no se prueba de forma rutinaria debido a que la relación entre tales ensayos yla eficacia terapéutica o profiláctica está claro 13. cámaras de flujo de microfluidos ofrecen un medio para investigar la función plaquetaria en PC para optimizar la cadena de manipulaciones entre la recogida y entrega. Es una poderosa herramienta de investigación para las comparaciones directas (pares) de PC como hemos previamente publicados 14,15 y se describe aquí.

<table><tbody><tr><td>Tubo vacutainer BD con EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vacutainer BD con heparina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vacutainer BD con citrato de sodio</td><td>Becton, Dickinson and Company 366575</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de sangre Hirudin</td><td>Roche 6675751</td><td>001</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Aguja de extracción de sangre con soporte preinstalado</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 100-1.000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de precisión</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Nombrado en <fuerte>Figura S1</fuerte> A como 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>Tubing</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Denominados en <fuerte>Figura S1</fuerte> B como 'Tubo desechable'Vena8</td></tr> <tr><td>Agujas</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Nombrados en <fuerte>Figura S1</fuerte> B como '</td></tr><tr><td>Pin'Conectores para cables de entrada simple de biochips</td><td>Cellix</td><td>CONECTORES-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Denominado en <fuerte>Figura S1</fuerte> B como 'Tubo reutilizable' y 'Divisor'Caja</td></tr> <tr><td>humidificada Cellix</td><td></td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software bomba microfluídica</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Colágeno nativo del tendón equino (tipo I) Se complementa</td></tr> <tr><td>la solución isotónica de glucosa para diluir el colágenoSolución salina tamponada (HBS) HEPES</td> <td>preparación interna</td><td>preparación interna</td><td>10 mM Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosolución salina tamponada (HEPES) (0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo</td><td>en la preparación</td><td>interna en la preparación en casa</td><td>1,0% (p/v) de albúmina sérica bovina y 0,1% (p/v) de glucosa en HBS</td></tr><tr><td>Calceína AM</td><td>Sondas moleculares</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Lejía 10%</td><td>en casa preparación</td><td>en casa preparación</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>en casa preparación</td><td>en casa</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol desnaturalizado</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>con Multiflow8. Denominado en <fuerte>Figura S1</fuerte> A como 'Bomba' y 'Colector'Microscopio</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>equipado con un LED colibri y una cámara CCD de alta resolución</td></tr><tr><td>Microscopio de software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Analizador de hematología</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de plaquetas</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua para incubación</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Marca de pipeta</td><td></td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Rodillo de tubo</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de acoplamiento estéril</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de tubos</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de microfluidos cámaras utilizando sangre reconstituida a modelo hemostasia y transfusión de plaquetas<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Las plaquetas sanguíneas preparadas para la transfusión pierden gradualmente la función hemostática durante el almacenamiento. La función de las plaquetas puede investigarse utilizando una variedad de experimentos in vitro (indirectos), pero ninguno de ellos es tan completo como las cámaras de flujo microfluídico. En este protocolo, se utiliza la reconstitución de sangre fresca trombocitopénica con plaquetas almacenadas en el banco de sangre para simular la transfusión de plaquetas. A continuación, la muestra reconstituida se perfunde en cámaras de flujo microfluídicas que imitan la hemostasia de las proteínas de la matriz subendotelial expuestas. Los efectos de la donación de sangre, el transporte, la separación de componentes, el almacenamiento y la inactivación de patógenos se pueden medir en diseños experimentales pareados. Esto permite una comparación fiable del impacto que cada manipulación en la preparación de componentes sanguíneos tiene sobre la hemostasia. Nuestros resultados demuestran el impacto de los ciclos de temperatura, las tasas de cizallamiento, la concentración de plaquetas y la duración del almacenamiento en la función de las plaquetas. En conclusión, este protocolo analiza la función de las plaquetas del banco de sangre y, en última instancia, ayuda a optimizar la cadena de procesamiento, incluida la flebotomía, el transporte, la preparación de componentes, el almacenamiento y la transfusión.

Para demostrar la variación intra-ensayo, tres idénticas muestras de sangre entera reconstituidas fueron perfundidos simultáneamente sobre superficies revestidas de colágeno (Figura 1). Esto dio lugar a un coeficiente de variación de 8,7%. Esta estadística sugiere intra-ensayo aceptable y la variación intralaboratorio que permite una comparación fiable entre muestras relacionadas. La entrada de la cámara de fl...

La transfusión y hemostasia de plaquetas se modeló utilizando cámaras de reconstitución de sangre y flujo microfluídico para investigar la función de las plaquetas de los bancos de sangre. Los datos demuestran las consecuencias de la lesión por almacenamiento de plaquetas sobre la hemostasia, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

El objetivo general de este experimento es imitar in vitro la transfusión de plaquetas y evaluarla mediante la hemostasia sobre colágeno, con flujo hidrodinámico y microscopía en tiempo real. Los pacientes con trombocitopenia son tratados con concentrados de plaquetas almacenados. Nuestro método tiene la finalidad de ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis y la hemostasia, con énfasis específico en la calidad y función de dichos concentrados de plaquetas almacenados.El valor añadido de esta técnica es que imita el flujo sanguíneo y, por lo tanto, tiene en cuenta las influencias de la reología sobre las células y biomoléculas participantes. El método actual evalúa la unión de plaquetas al colágeno. Sin embargo, también puede aplicarse a otros tejidos adhesivos, incluyendo placas ateroscleróticas, células endoteliales o proteínas matriciales específicas como el factor de von Willebrand y el fibrinógeno.Comience preparando el biochip. Agite en vórtex y diluya un stock de colágeno uno a 20 en la solución isotónica de glucosa del fabricante hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Luego, pipetee 0,8 microlitros en los canales de un biochip desechable nuevo.Llene todas las carreras en un extremo del chip y marque este extremo como la salida. Luego, inspeccione el chip para asegurarse de que cada carrera esté llena hasta cinco sextos de su capacidad con la solución y no contenga burbujas de aire. A continuación, incube el chip a cuatro grados celsius durante cuatro horas o durante la noche en un recipiente cerrado y humedecido.Posteriormente, bloquee los canales codificados pipeteando tampón de bloqueo en el otro extremo de las bandas. Luego, para cada banda, corte trozos de tubo de 12 centímetros de longitud y coloque un pasador en cada trozo de tubo para poder fijarlos al biochip. Enjuague los trozos de tubo con agua destilada utilizando una jeringa y un conector.Luego, sáturelos con tampón de bloqueo y colóquelos en un recipiente humedecido durante al menos una hora. A continuación, prepare la bomba y el colector. En primer lugar, enjuague la bomba y el colector con agua destilada para eliminar cualquier burbuja de aire.A continuación, fije el biochip al portaobjetos del microscopio automatizado. Introduzca un extremo de los tubos en un tubo de 1.5 mililitros lleno con HBS, luego conéctelos por el otro extremo a las entradas del biochip. Coloque los pasadores del colector en las salidas del biochip.Luego, enjuague el sistema con HBS utilizando la bomba. De esta manera se eliminará cualquier tampón de bloqueo residual o colágeno adherido deficientemente. Esto completa los preparativos de la cámara de flujo.Comience reuniendo recolecciones recientes de sangre de voluntarios sanos en un tubo cónico para centrífuga. Centrifugue la muestra durante aproximadamente 15 minutos a 250 G. No utilice el freno, ya que perturbaría la fase inferior poco compacta. Retire y deseche el plasma rico en plaquetas y la capa leucocitaria (buffy coat).Guarde los glóbulos rojos concentrados que contengan la menor cantidad posible de plaquetas, para preparar la sangre reconstituida. Ahora, comience a descongelar cuatro mililitros de plasma del tipo AB a 37 grados Celsius durante cinco minutos y 20 segundos. Mientras tanto, determine el hematocrito de los glóbulos rojos concentrados preparados utilizando un analizador hematológico automatizado.Luego, determine la concentración de plaquetas de un concentrado de plaquetas preparado por un banco de sangre para usar en la reconstrucción de la sangre completa. Calcule los volúmenes requeridos para un mililitro de sangre reconstruida con un hematocrito del 40 % y 250.000 plaquetas por microlitro. Ahora, utilizando una punta de pipeta recortada, transfiera los volúmenes necesarios de glóbulos rojos, plasma y concentrado de plaquetas a la concentración deseada y un volumen final de un mililitro.Mezcle la sangre reconstituida mediante inversiones suaves y realice un recuento sanguíneo completo. Luego, tome un tubo de microcentrífuga preparado que contenga Calcein AM y añádale un mililitro de sangre reconstituida. Mezcle la sangre con el colorante mediante inversiones suaves.Luego, incubar la sangre reconstituida durante cinco minutos a 37 grados celsius. En el software, seleccionar la región de interés en el canal de perfusión. Enfocar las fibras de colágeno adheridas en el fondo de los canales con un aumento de 100x.Lo ideal es utilizar contraste de fase o contraste de interferencia diferencial. Seleccione la opción de establecer la Z actual para regiones de mosaico seleccionadas para fijar digitalmente las posiciones Z seleccionadas. El enfoque óptico antes de la perfusión debe estar en el colágeno de los ameloblastos, aunque esto puede ser complicado.Una alternativa consiste en ajustar el enfoque del microscopio sobre las plaquetas adheridas inicialmente. A continuación, mezcle suavemente las muestras y colóquelas junto al biochip. Luego, introduzca el tubo conectado al canal observado en la sangre reconstituida.A continuación, utilizando el software de control de la bomba, aplique una presión de 50 dinas por centímetro cuadrado para mover la muestra de sangre hacia el carril e iniciar el experimento. Durante el experimento, registre imágenes cada 15 segundos durante cinco minutos. Determine la cinética de crecimiento del trombo mediante software de análisis de imágenes.En este caso, se utiliza Zen 2012. Comience abriendo el complemento de análisis de imágenes para determinar la cobertura superficial de las plaquetas. Establezca el umbral de fluorescencia en la pestaña analizar interactiva para definir la intensidad de píxel que se correlaciona con una señal positiva, que procedería de las plaquetas adheridas.Luego, utilice la creación de tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo con una lista de las áreas superficiales de las señales positivas para cada punto temporal. Guarde estas hojas de cálculo en formato XML y ábralas en un programa de hojas de cálculo para realizar cálculos adicionales. En cada punto temporal, calcule el área superficial total de los objetos seleccionados y exprese este valor como el porcentaje de superficie cubierta.Luego, represente los datos como una función del tiempo de perfusión y calcule la pendiente mediante regresión lineal. Esto modela la cinética de crecimiento del trombo para esa condición experimental particular. Tres muestras idénticas de sangre total reconstituida fueron perfundidas simultáneamente sobre superficies recubiertas con colágeno.Esto dio como resultado un coeficiente de variación del 8,7 %, lo que sugiere una variación aceptable dentro del ensayo y dentro del laboratorio para la comparación de pruebas. Se simuló la transfusión mediante la reconstitución de la sangre con el componente deficiente. Se realizaron varias reconstituciones con concentraciones decrecientes de plaquetas.Como era de esperar, recuentos más bajos de plaquetas dieron como resultado una menor adhesión en función del tiempo de perfusión. A continuación, se investigó el efecto de las temperaturas reducidas tras la extracción de sangre y durante la perfusión. Se observó que los trombos se formaban más lentamente cuando la sangre se enfriaba a temperatura ambiente.En comparación con una muestra mantenida a 37 grados Celsius durante todo el estudio. Durante la circulación, las plaquetas se unen a los sitios de lesión vascular en condiciones de estrés cortante elevado en la pared. Como era de esperar, variar la velocidad de cizalladura en las cámaras de flujo microfluídicas cambió la adhesión plaquetaria total.Estas condiciones también alteran la cinética de crecimiento del trombo. Tras ver este video, uno debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos con cámaras de flujo microfluídicas utilizando sangre reconstituida para evaluar la calidad y función de los concentrados de plaquetas almacenados. Esta técnica puede realizarse en aproximadamente siete horas.Los experimentos con cámaras de flujo microfluídicas allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la transfusión de plaquetas exploraran el impacto de las variables de donación, preparación y almacenamiento. Un ejemplo relevante es la inactivación de patógenos. Hemos dado un ejemplo de solo un sujeto experimental.Sin embargo, las variaciones en la concentración de calcio, el esfuerzo cortante y los recubrimientos superficiales pueden utilizarse para abordar diferentes preguntas de investigación. De forma similar a este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones en cámaras de flujo microfluídicas para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, el rendimiento de las plaquetas almacenadas en la coagulación bajo flujo.

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

Un método para la cultura de una monocapa de células endoteliales en toda la superficie interior en 3D de un dispositivo de microfluidos con microvascular del tamaño de los canales (&lt;30 micras) se describe.

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En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

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In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

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Un modelo de bucle hemodinámico In Vitro para investigar la hemocitocompatibilidad y la activación de células host de dispositivos médicos vasculares

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Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

Dielectroforesis (DEP) es un método eficaz para manipular células. Placas de circuito impreso (PCB) puede proporcionar electrodos de bajo costo, reutilizables y eficaz para el contacto libre de la manipulación de células dentro de los dispositivos de microfluidos. Mediante la combinación de PDMS basado en canales de microfluidos con cubreobjetos sobre los PCB, se demuestra la manipulación de cuentas y la separación dentro de la célula y multicanal dispositivos de microfluídica.

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Aprende a evaluar la función hemostática de plaquetas almacenadas mediante cámaras de flujo microfluídico con sangre reconstituida. Este método permite analizar la adhesión plaquetaria sobre colágeno en condiciones de flujo hidrodinámico.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas

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