Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas In Vitro

El objetivo general de este experimento es imitar la transfusión de plaquetas in vitro y probarla mediante hemostasia sobre colágeno, con flujo hidrodinámico y microscopía en tiempo real. Los pacientes con trombocitopenia se tratan con concentrados de plaquetas almacenados. Nuestro método está destinado a ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis y la hemostasia, con énfasis específico en la calidad y función de dichos concentrados de plaquetas almacenados.

El valor añadido de esta técnica es que imita el flujo sanguíneo y, por lo tanto, tiene en cuenta las influencias de la reología en las células y biomoléculas participantes. El método actual evalúa la unión de las plaquetas al colágeno. Sin embargo, también se puede aplicar a otros tejidos adhesivos, como la placa aterosclerótica, las células endoteliales o proteínas específicas de la matriz como el factor de Von Willebrand y el fibrinógeno.

Comience con la preparación del biochip. Agitar y diluir un caldo de colágeno de uno a 20 en la solución de glucosa isotónica del fabricante hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro. A continuación, pipetea 0,8 microlitros en los carriles de un nuevo biochip desechable.

Llene todos los carriles en un extremo del chip y márquelo como el extremo de salida. Luego inspeccione el chip para asegurarse de que cada carril esté lleno 5/6 del camino con la solución y que no haya burbujas de aire. Luego, incube el chip a cuatro grados centígrados durante cuatro horas o toda la noche en un recipiente humidificado y cerrado.

Más tarde, bloquee los canales codificados pipeteando el búfer de bloqueo en el otro extremo de los carriles. Luego, para cada carril, corte longitudes de tubería de 12 centímetros y conecte un alfiler a cada longitud de tubería para que se puedan conectar al biochip. Enjuague los tubos con agua destilada de una jeringa y un conector.

Luego, sature con tampón de bloqueo y séllelos en un recipiente humidificado durante al menos una hora. A continuación, prepare la bomba y el colector. Primero, enjuague la bomba y el colector con agua destilada para eliminar las burbujas de aire.

A continuación, conecte el biochip a la platina del microscopio automatizado. Coloque un extremo de las longitudes en un tubo de 1,5 mililitros lleno de HBS, luego conéctelos con el otro extremo a las entradas del biochip. Coloque las clavijas del colector en las salidas del biochip.

A continuación, enjuague el sistema con HBS utilizando la bomba. De este modo, se eliminará cualquier tampón bloqueante restante o colágeno mal adherido. Esto completa los preparativos de la cámara de flujo.

Comience agrupando las muestras de sangre recientes de voluntarios sanos en un tubo centrífugo cónico. Gire la muestra durante unos 15 minutos a 250 Gs.Do no use el freno, ya que alterará la fase inferior poco compacta. Retire y deseche el plasma rico en plaquetas y la capa leucocitaria.

Guarde los glóbulos rojos empaquetados que contengan la menor cantidad posible de plaquetas para producir la sangre reconstituida. Ahora, comience a descongelar cuatro mililitros de plasma tipo AB a 37 grados centígrados durante cinco minutos y 20 segundos. Mientras tanto, determine el hematocrito de los glóbulos rojos empaquetados preparados utilizando un analizador de hematología automatizado.

A continuación, determine la concentración de plaquetas de un concentrado de plaquetas preparado por un banco de sangre para utilizarlo en la reconstitución de la sangre completa. Calcular los volúmenes necesarios para un mililitro de sangre reconstituida con un 40% de hematocrito y 250.000 plaquetas por microlitro. Ahora, con una punta de pipeta recortada, transfiera el volumen requerido de glóbulos rojos, plasma y concentrado de plaquetas a la concentración deseada y un volumen final de un mililitro.

Mezcle la sangre reconstituida con inversiones suaves y realice un hemograma completo. Luego, obtenga un tubo de microcentrífuga preparado que contenga calceína AM y agréguele un mililitro de sangre reconstituida. Mezcle la sangre con el tinte usando inversiones suaves.

Luego, incuba la sangre reconstituida durante cinco minutos a 37 grados centígrados. En el software, seleccione la región de interés en el carril de perfusión. Concéntrese en las fibras de colágeno adheridas en la parte inferior de los carriles con un aumento de 100x.

Lo ideal es utilizar el contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial. Elija la opción Establecer Z actual para las regiones de mosaico seleccionadas para fijar digitalmente las posiciones Z seleccionadas. El foco óptico antes de la perfusión debe estar en el colágeno ameloblasto, pero esto puede ser complicado.

Una alternativa es establecer el enfoque del microscopio en las plaquetas adheridas inicialmente. Ahora, mezcle suavemente las muestras y colóquelas junto al biochip. A continuación, coloque el tubo conectado al carril observado en la sangre reconstituida.

A continuación, utilizando el software que controla la bomba, aplique una presión de 50 dinas por centímetro cuadrado para mover la muestra de sangre al carril e iniciar el experimento. Durante el experimento, grabe imágenes cada 15 segundos durante cinco minutos. Determine la cinética de crecimiento del trombo utilizando un software de análisis de imágenes.

En este caso, se utiliza Zen 2012. Comience abriendo el análisis de imagen del complemento para determinar la cobertura de la superficie de las plaquetas. Establezca el umbral de fluorescencia en la pestaña interactiva analizar para definir la intensidad de píxeles que se correlaciona con una señal positiva, que provendría de las plaquetas adheridas.

A continuación, utilice crear tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo con una lista de las áreas de superficie de las señales positivas para cada punto de tiempo. Guarde estas hojas de cálculo en formato XML y ábralas en un programa de hojas de cálculo para realizar cálculos posteriores. En cada punto de tiempo, calcule las áreas de superficie totales de los objetos seleccionados y exprese este valor como el porcentaje de superficie que está cubierto.

A continuación, represente los datos en función del tiempo de perfusión y calcule la pendiente mediante regresión lineal. Esto modela la cinética de crecimiento del trombo de esa condición experimental en particular. Tres muestras idénticas de sangre entera reconstituida se perfundieron simultáneamente sobre superficies recubiertas de colágeno.

Esto dio como resultado un coeficiente de variación del 8,7%, lo que sugiere una variación aceptable dentro del ensayo y dentro del laboratorio para la comparación de las pruebas. La transfusión se simuló reconstituyendo la sangre con el componente deficitario. Se realizaron varias reconstituciones con concentraciones plaquetarias decrecientes.

Como era de esperar, los recuentos de plaquetas más bajos resultaron en una menor adherencia en función del tiempo de perfusión. A continuación, se investigó el efecto de la disminución de las temperaturas después de la recolección de sangre y durante la perfusión. Se encontró que los trombos se acumulaban más lentamente cuando la sangre se enfriaba a temperatura ambiente.

En comparación con una muestra mantenida a 37 grados centígrados durante todo el estudio. Mientras circulan, las plaquetas se unen a los sitios de lesión de los vasos en condiciones de tensión elevada en la pared. Como se esperaba, la variación de la velocidad en las cámaras de flujo microfluídico cambió la adhesión total de las plaquetas.

Estas condiciones también cambian la cinética de crecimiento del trombo. Después de ver este video, uno debe tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de cámara de flujo microfluídico utilizando sangre reconstituida para probar la calidad y la función de los concentrados de plaquetas almacenados. Esta técnica se puede realizar en aproximadamente siete horas.

Los experimentos con cámara de flujo microfluídico allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la transfusión de plaquetas exploraran el impacto de las variables de donación, preparación y almacenamiento. Un ejemplo relevante es la inactivación de patógenos. Hemos dado el ejemplo de un solo sujeto experimental.

Sin embargo, las variaciones en la concentración de calcio, la tensión pura y los recubrimientos superficiales se pueden utilizar para abordar diferentes preguntas de investigación. De manera similar a este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones en cámaras de flujo microfluídicas para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, el rendimiento de las plaquetas almacenadas a la coagulación en el flujo.