Imágenes de vídeo y mapas espacio-temporales para Analizar la motilidad gastrointestinal en ratones

El objetivo general de esta técnica consiste en identificar cambios en la regulación neural de la motilidad colónica en ratones mediante el uso de imágenes de video. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el campo de la neurociencia entérica, como por ejemplo si mutaciones genéticas sutiles en genes neuronales afectan la motilidad colónica. La principal ventaja de este método es que el tejido se encuentra aislado sin la influencia del sistema nervioso central, lo que permite investigar la participación del sistema nervioso entérico en el control de la motilidad gastrointestinal.

Esta técnica se extiende hacia la terapia de enfermedades neurodesarrolladas como el autismo, ya que mutaciones genéticas que alteran la función sináptica en el cerebro también podrían alterar la motilidad intestinal. Comience utilizando pinzas de disección y tijeras para realizar una incisión a través de la epidermis que recubre las capas musculares abdominales inferiores. Abra la cavidad abdominal a lo largo de la línea media hasta el esternón.

Humedezca el tejido con solución salina fisiológica y use la pinza para levantar suavemente el ciego cuatro o cinco centímetros por encima del abdomen. Luego, utilizando tijeras de disección finas, corte el mesenterio, teniendo cuidado de no manipular, estirar ni cortar el tejido gastrointestinal. Retire la vejiga, los testículos y cualquier otro tejido sobrante.

Luego, utilizando tijeras de disección gruesas, realice dos incisiones verticales aproximadamente a 0,5 centímetros de la línea media en el hueso pélvico a cada lado del colon, y use las tijeras finas para separar el recto del tejido pélvico adyacente. Recorte el mesenterio del colon y enjuague el tejido del colon completo en un vaso de precipitados que contenga solución salina fisiológica. Para eliminar los pellets fecales y otros contenidos intestinales, primero recorte aproximadamente un centímetro del extremo de una pipeta de 200 microlitros y conecte la pipeta a una jeringa de cinco mililitros llena con solución salina fisiológica.

Luego, después de retirar el ciego y el recto, coloque un alfiler de insecto en el extremo más proximal del colon, en el lugar donde sean visibles las estriaciones en la mucosa, para orientar el tejido. Ahora, sostenga suavemente el tejido por el extremo proximal e inserte la punta de la pipeta en la luz y pase la solución salina a través del colon hacia un recipiente de desecho. A continuación, con la misma jeringa y punta de pipeta, pase salino fisiológico fresco para eliminar cualquier residuo de los tubos conectados a un baño de órganos de dos cámaras.

Configure el baño de órganos de modo que las cámaras sean continuamente perfundidas con solución salina fisiológica burbujeada con carbógeno y utilice una sonda de temperatura para confirmar regularmente que la temperatura de la solución salina se mantenga entre 33 y 37 grados Celsius. Utilice un tapón de goma con un tubo de vidrio de cinco milímetros de diámetro interno insertado a través del centro para mantener la presión en el depósito de entrada. Luego, sumerja completamente un segmento de colon de cinco a siete centímetros de longitud en la cámara del baño de órganos y utilice pinzas e hilo de algodón estándar para suturar el extremo proximal del colon al tubo de entrada y el extremo distal del colon al tubo de salida.

Después de determinar la distancia basal entre las cánulas proximal y distal del colon, equilibre el tejido en solución salina fisiológica durante 30 minutos. Para registrar los movimientos intestinales, mientras el colon se aclimata, coloque una cámara de video a 10-15 centímetros por encima del baño de órganos sobre un soporte universal de laboratorio estándar y configure el software adecuado para la captura de video. Cuando la cámara esté lista, grabe cuatro segmentos de video de 15 minutos del colon en condiciones controladas.

A continuación, se realiza la superperfusión del fármaco de interés en el baño de órganos durante 30 a 60 minutos, capturando otros cuatro segmentos de video de 15 minutos cada uno. Finalmente, se reemplaza la solución de tratamiento con solución salina fisiológica fresca y se registran cuatro segmentos de video más de 15 minutos durante el período de lavado de una hora. Luego se pueden generar mapas espacio-temporales del colon en respuesta a los diferentes períodos de tratamiento.

Para evaluar si las mutaciones sinápticas alteran los complejos motores migratorios colónicos, o CMMC, cuando el sistema nervioso entérico se perturba farmacológicamente, en este experimento se agregó el antagonista de los receptores 5-HT3 y 4, tropisetron, a la cámara del baño de órganos con preparación de colon. En presencia de tropisetron, los ratones NL3R451C mostraron una disminución en la frecuencia de CMMC en comparación con sus hermanos de tipo silvestre. Aunque no se observaron diferencias significativas entre la contractilidad de tipo silvestre y NL3R451C durante condiciones controladas, el tropisetron redujo significativamente la frecuencia de CMMC tanto en ratones de tipo silvestre como en NL3R451C.

Además, el tropisetron ejerció un efecto mayor sobre la frecuencia de las CMMC en ratones NL3R451C en comparación con animales de tipo silvestre. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro horas si se realiza adecuadamente. Al intentar esta técnica, asegúrese de que el baño de órganos se mantenga a una temperatura constante, de que tenga un suministro continuo de carbogeno y de que se evite el desbordamiento de la solución salina fisiológica mediante un vacío.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como la inmunocitoquímica para responder preguntas adicionales, tales como si existen cambios en las proporciones neuronales o en el número de células en ratones que presentan una motilidad colónica alterada. Desde su desarrollo, este método ha permitido una variedad de estudios sobre la motilidad intestinal en cobayas y conejos, ratas y otras especies, y especialmente en este caso en el ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar cambios en la regulación neuronal de la motilidad colónica utilizando imágenes de video.