Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos En Vivo registros intracelulares

El objetivo general de este método de registro intracelular es determinar la sensibilidad espectral de las células fotorreceptoras individuales en un ojo compuesto de insecto in vivo. Este método puede decirnos si las longitudes de onda de la luz a las que una célula es sensible se ven afectadas por el filtrado de pigmentos. La principal ventaja de esta técnica es que al conocer las sensibilidades espectrales de los fotorreceptores individuales, podemos predecir qué gama de colores puede ver un animal.

Para prepararse para la grabación, encienda la lámpara de xenón al menos 45 minutos antes del experimento y encienda el extractor de microelectrodos al menos 30 minutos antes de extraer los electrodos de vidrio. A continuación, encienda todo el equipo de grabación. Asegúrese de que el obturador esté cerrado de forma predeterminada, para que no pase luz a través del cable de fibra óptica.

A continuación, extraiga los microelectrodos finos de vidrio de borosilicato con el extractor de microelectrodos. Rellene los electrodos con cloruro de potasio de tres molares. Para preparar el espécimen, bajo el microscopio, coloque una mariposa individual dentro de un pequeño tubo de plástico con cera caliente, de modo que la cabeza quede inmóvil y sobresalga de un extremo del tubo.

Luego, fije la probóscide, las antenas y las alas con cera. Después de eso, sujeta el abdomen con un trozo de cera seca. Mantenga el tubo humidificado colocando un pañuelo húmedo en su interior, detrás del abdomen de la muestra.

Asegúrese de que el espécimen esté completamente inmóvil. A continuación, monte el tubo con un pequeño trozo de cera en una pequeña plataforma con una rótula que está unida a una base magnética. Bajo un microscopio de disección, inserte un alambre de plata en la cabeza a través de la parte de la boca, como electrodo de referencia.

Antes del experimento, fije permanentemente el cable a la plataforma. A continuación, corte un pequeño agujero en la córnea izquierda con una cuchilla de afeitar y selle el agujero con vaselina para evitar la desecación. Una vez que se corta la córnea, inserte el electrodo de registro en el ojo lo más rápido posible, ya que la hemolinfa en el ojo se endurecerá rápidamente y hará imposible insertar un electrodo.

Si es posible, realice la disección en el equipo donde se llevará a cabo la grabación. A continuación, conecte el cable de tierra de la etapa principal al electrodo de referencia en la plataforma de muestras, utilizando las pinzas de cocodrilo. Monte el electrodo en el portaelectrodos.

Posteriormente, inserte el alambre de plata en la solución de cloruro de potasio en el microelectrodo. Use una fuente de luz con accesorios de cuello de cisne para iluminar la muestra debajo de un estereoscopio mientras baja el electrodo en el ojo. Ajuste el portaelectrodos para que el microelectrodo quede directamente sobre el orificio previamente cortado en la córnea.

Luego, baje el microelectrodo en el ojo usando el micromanipulador, hasta que se complete un circuito. Una vez en el ojo, balancee el estereoscopio fuera de la jaula de Faraday. Apague la fuente de luz que ilumina el espécimen y deje el insecto en la oscuridad durante 10 a 20 minutos para que se adapte a la oscuridad.

Verifique la resistencia del electrodo aplicando una corriente de nanoamperio y notando el cambio en el voltaje. Por lo general, la resistencia debe estar en el rango entre 100 y 250 megaohmios. A continuación, active el generador de pulsos para emitir un destello de luz durante el experimento y dirija el cable de fibra óptica hacia el ojo.

Verifique el cambio de voltaje del osciloscopio con cada destello de luz. Un cambio negativo en el voltaje significa que el electrodo aún no ha ingresado a la celda. Mueva el cable de fibra óptica alrededor de la muestra hasta que se observe una respuesta de voltaje máxima.

Para generar una respuesta de luz despolarizante, gire el micromanipulador hacia adelante y hacia atrás, lo que da como resultado pequeños movimientos verticales del electrodo, mientras golpea ligeramente la base del portaelectrodos o usa la función de zumbido en el preamplificador. Continúe haciendo pequeños ajustes hasta que aparezca una respuesta de luz despolarizadora en el osciloscopio. Luego, ajuste el cable de fibra óptica para encontrar la señal despolarizadora más grande.

Realice pequeños ajustes con un micromanipulador y utilice la función de zumbido del amplificador según sea necesario, para asegurarse de que el electrodo registra la célula de forma estable. Una grabación estable debe tener poco o ningún cambio en el potencial de reposo, poco ruido de fondo y una respuesta despolarizante consistentemente grande. Es esencial tener un registro estable donde el potencial de membrana en reposo no sea ruidoso y no cambie con el tiempo.

Las respuestas deben ser grandes y positivas, sin hiperpolarización. Una vez que la configuración sea estable, abra el software y cierre el cuadro de diálogo llamado Galería de experimentos para abrir una ventana emergente con cuatro canales. Ajuste la escala de voltaje en la esquina superior derecha de la ventana del software a 500 milivoltios.

A continuación, haz clic en Iniciar en la esquina inferior derecha para empezar a grabar. Minimice los canales tres y cuatro, y ajuste la escala X e Y. A continuación, deje que el software se ejecute durante el experimento.

Para la estimulación con luz blanca, registre hasta 10 respuestas individuales, con la rueda de filtros ND configurada en el diámetro exterior más alto que aún provoca una respuesta. Aquí, el cambio en la respuesta se muestra en 3.0 OD y 2.0 OD. A continuación, registre el mismo número de respuestas de 3,5 a 0,0 OD, en cada combinación, para proporcionar una curva de intensidad logarítmica de respuesta. Antes de registrar la respuesta de la celda a todas las longitudes de onda utilizando los filtros de interferencia, primero encuentre rápidamente la longitud de onda máxima.

Sin ningún filtro ND en la trayectoria de la luz, coloque allí un filtro transmisor de rayos UV y observe brevemente la amplitud de la respuesta. Repita el procedimiento con un filtro transmisor azul, un filtro transmisor verde y un filtro transmisor rojo, lo que debería dar una idea de dónde estará la respuesta máxima. Grabe bajo la longitud de onda del filtro que da la respuesta máxima antes de cambiar a otro filtro de interferencia.

Entre la grabación con filtros posteriores, permita que la celda responda a uno o dos destellos de luz blanca sin ningún filtro en la trayectoria de la luz, para ayudar a monitorear si la respuesta máxima se degrada con el tiempo. A continuación, graba con otros filtros de interferencia y permite hasta 10 respuestas por filtro. Este es un ejemplo de un gran cambio de voltaje negativo que se ve justo antes de ingresar a una celda.

Aquí se muestra una grabación limpia, que tiene poco ruido de fondo y una gran respuesta de despolarización, generalmente de al menos 40 milivoltios. Y aquí hay un ejemplo de una mala grabación, debido al cambio de potencial negativo después del pico principal. Este es otro ejemplo de una mala grabación.

El potencial de reposo está experimentando grandes fluctuaciones, y la gran cantidad de ruido de fondo puede oscurecer la amplitud de la respuesta. Este es un ejemplo representativo de sensibilidad espectral derivada de una sola grabación. Los tipos de células se clasifican por la sensibilidad máxima a una longitud de onda similar y la forma general del espectro de sensibilidad.

A continuación, se promedian los mismos tipos de células y se traza la sensibilidad media con barras de error estándar en cada longitud de onda. Este gráfico muestra las sensibilidades espectrales de tres tipos de células típicas que se encuentran en un insecto. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas dos horas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar experimentos de comportamiento para determinar si todos los tipos de células fotorreceptoras contribuyen o no a la discriminación del color.