Name: Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos En Vivo registros intracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a determinar la sensibilidad espectral de fotorreceptores individuales en ojos compuestos de insectos mediante grabación intracelular in vivo. Esta técnica permite predecir el rango de visión cromática en mariposas.

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Agradecemos a finales Rudy Limburg para fabricar el perímetro del brazo de cardán, Kimberly Jamison, Mateo McHenry, y Raju Metherate por prestarnos el equipo, y Almut Kelber y Kentaro Arikawa, para el estímulo. Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Ciencia (NSF) Licenciado beca de investigación para KJM y NSF IOS-1.257.627 a ADB

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

registro intracelular puede ser una técnica difícil de dominar debido a los muchos pasos técnicos involucrados. Para los experimentos con éxito varios puntos importantes deben ser considerados. En primer lugar, es importante tener una mesa adecuadamente aislado vibratoriamente-en el que se realiza el experimento. Muchos investigadores utilizan mesas de aire, que separan completamente de la mesa de la base, dando el aislamiento de vibración superior. Nuestra configuración consiste en una mesa de mármol de espesor con una...

Las propiedades eléctricas de las células tales como neuronas se observan mediante la medición de flujo de iones a través de las membranas celulares como un cambio en el voltaje o la corriente. Una variedad de técnicas electrofisiológicas han sido desarrollados para medir eventos bioeléctricos en las células. Las neuronas que se encuentran en los ojos de animales son accesibles y sus circuitos a menudo es menos compleja que en el cerebro, por lo que estas células buenos candidatos para el estudio electrofisiológico. Las aplicaciones más comunes de electrofisiología en el ojo incluyen el electrorretinograma (ERG) 1,2 y el registro intracelular de microelectrodos. ERG consiste en colocar un electrodo en o sobre el ojo de un animal, la aplicación de un estímulo de luz, y midiendo el cambio en la tensión como una suma de las respuestas de todas las células cercanas 3-6. Si uno está interesado específicamente en la caracterización de las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales, a menudo múltiples tipos de células responden de forma simultánea en diferentes puntos fuertes a un estímulo determinado; Por lo tanto,puede ser difícil de determinar las sensibilidades de los tipos celulares específicos a partir de datos ERG especialmente si hay varios tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente similares en el ojo. Una posible solución es crear transgénico con el gen de Drosophila fotorreceptor (opsina) de interés se expresa en las células mayoría R1-6 en el ojo y después realizar ERGs 7. Las posibles desventajas de este método son que no a baja expresión de la proteína fotorreceptor 8, y el período de tiempo largo para la generación y detección de animales transgénicos. Para los ojos con un menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintas, la adaptación del ojo con filtros de color puede ayudar con la reducción de la contribución de algunos tipos de células a la ERG, permitiendo de ese modo la estimación de máximos sensibilidad espectral 9. registro intracelular es otra técnica en la que una multa electrodo empala una célula y se aplica un estímulo. Los registros de electrodos sólo eso IndivLa respuesta de las células idual de manera que a grabar y analizar varias celdas individuales puede producir sensibilidades específicas de los diferentes tipos de células fisiológicamente 10-14. Aunque nuestro protocolo se centra en el análisis de sensibilidad espectral, los principios básicos de intracelular de grabación con electrodos afilados son modificables para otras aplicaciones. El uso de una preparación diferente de una muestra, por ejemplo, y el uso de electrodos de cuarzo afilados, se puede grabar de más profundo en el lóbulo óptico o de otras regiones en el cerebro, dependiendo de la pregunta que se hace. Por ejemplo, los tiempos de respuesta de las células fotorreceptoras individuales 15, la actividad de células en la óptica lóbulos 16 (lámina, médula o lobula 17), cerebro 18 o otros ganglios 19 también se pueden grabar con técnicas similares, o estímulos de color podría sustituirse con polarización 20 -22 o moción estímulos 23,24. Fototransducción, el proceso por el cual la luzla energía es absorbida y convertida en una señal electroquímica, es un antiguo rasgo común a casi todos los presentes el día 25 filos animales. El pigmento visual que se encuentra en las células fotorreceptoras y responsable de iniciar la fototransducción visual es la rodopsina. Rhodopsins en todos los animales se componen de una proteína opsina, un miembro de la familia 7 transmembrana G receptor acoplado a la proteína, y un cromóforo asociado que se deriva de la retina o una molécula similar 26,27. Opsin secuencia de aminoácidos y la estructura de cromóforo afectar la absorbancia de la rodopsina a diferentes longitudes de onda de luz. Cuando un fotón es absorbida por el cromóforo de la rodopsina se activa, iniciando una cascada de proteína G en la célula que en última instancia conduce a la apertura de los canales iónicos de membrana 28. A diferencia de la mayoría de las neuronas, las células fotorreceptoras se someten a posibles cambios graduales que se pueden medir como un cambio relativo en la amplitud de la respuesta con el cambio de estímulo luminoso. Normalmente, un dadotipo de fotorreceptor expresa sólo un gen de la opsina (aunque existen excepciones 8,10,29-31). la visión del color sofisticado, de la que se encuentra en muchos vertebrados y artrópodos, se consigue con un ojo complejo de cientos o miles de células fotorreceptoras cada que expresan uno o más tipos de vez en cuando rodopsina. La información visual se captura mediante la comparación de las respuestas sobre el mosaico fotorreceptor través de la señalización neural aguas abajo complejo en el ojo y el cerebro, dando como resultado la percepción de una imagen completa con el color y el movimiento. Después de medir las respuestas primas de una célula fotorreceptora a diferentes longitudes de onda de luz a través de registro intracelular, es posible calcular su sensibilidad espectral. Este cálculo se basa en el principio de univariante, que establece que la respuesta de una de las células fotorreceptoras depende del número de fotones que absorbe, pero no en las propiedades particulares de los fotones que absorbe 32. Cualquier fotón que es absorbed por rodopsina inducirá el mismo tipo de respuesta. En la práctica, esto significa que la amplitud de la respuesta en bruto de una célula aumentará ya sea debido a un aumento en la intensidad de la luz (más fotones para absorber), o a un cambio en la longitud de onda hacia su sensibilidad pico (mayor probabilidad de rodopsina de absorción de esa longitud de onda). Hacemos uso de este principio en relacionar las respuestas celulares a una intensidad conocida y la misma longitud de onda de respuestas a diferentes longitudes de onda y la misma intensidad pero la sensibilidad relativa desconocida. Los tipos de células a menudo se identifican por la longitud de onda a la que sus picos de sensibilidad. Aquí se muestra un método para el registro y análisis de sensibilidad espectral de los fotorreceptores en el ojo de una mariposa intracelular, con un enfoque en lo que este método sea más accesible para la comunidad científica en general. Aunque registro intracelular sigue siendo común en la literatura, particularmente con respecto a la visión de color en los insectos, hemos encontrado that descripciones de materiales y métodos son por lo general demasiado breve para permitir la reproducción de la técnica. Presentamos este método en el formato de vídeo con el fin de permitir su replicación más fácil. También describimos la técnica utilizando un equipo fácil de obtener y asequible. Nos dirigimos advertencias comunes que a menudo no son reportados, que ralentizan la investigación la hora de optimizar una nueva y compleja técnica.

<table><tbody><tr><td>Pupas</td><td></td><td></td><td>de mariposa Varias especies locales disponibles, necesitan permisos del USDA para su envío. Carolina Bio Supply tiene varias especies de insectos que se pueden pedir dentro de los EE. UU. sin necesidad de permisos adicionales Cilindro</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de plástico grande</td><td>Cualquier cámara que permanezca humidificada funcionará</td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, tamaño 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>Miel de mezquite del desierto 100% Trader</td><td>Joe's</td> Cualquier solución de <td></td><td>miel o sacarosa funcionará</td></tr><tr><td>Lámpara de arco de xenón</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation Fuente de</td></tr><tr><td>alimentación universal</td><td>Oriel</td><td>Instruments 68805</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Portador de riel, pequeño (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Adaptador de rosca, 8-32 macho a 1/4-20 macho, paquete de 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td>Poste de</tr><tr><td>montaje óptico, 1.0 pulg., 0.5 pulg. Diámetro Inoxidable, 8-32 y 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de poste óptico antideslizante, 2 pulg., 0.5 pulg. Diámetro de los postes, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Montura de lente fija, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Montura de lente fija, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de lente de condensador</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Lente de sílice convexa, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Rueda de filtro de seis posiciones, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de montaje de rueda de filtro</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Lente de sílice cóncava, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de colimador</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de haz de colimación</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Convertidor de férula, terminación SMA a férula estándar de 11 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Este adaptador permite que la fibra óptica encaje en el soporte del colimador&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; m diámetro cable obstico de fibra UV-vis</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel ahora es parte de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Obturador con unidad motriz</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 3.0 OD</td><td>Lámpara Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal</td> Ocean <td>Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td>Ocean Optics Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de interferencia, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr>Jaula <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>Funcionará cualquier estructura metálica que pueda conectarse a tierra y que se adapte a la configuración experimental.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico, 6X, 12X, 25X, aumento de 50X</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Cualquier microscopio estereoscópico servirá</td></tr><tr><td>Soporte de microscopio con brazo oscilante y base pesada</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Cualquier base pesada con brazo servirá</td></tr><tr><td>Brazo</td><td></td><td></td> cardán <td>Hecho a medida, ver Figura 4</strong</td></tr><tr><td>>Fiber-lite iluminador de alta intensidad</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Para la muestra</td></tr><tr><td>de iluminación Guía de luz de cuello de cisne de fibra</td> ligera <td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Cualquier guía de luz de cuello de cisne servirá</td></tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td><td></td>de mármol</tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td> de madera elevada <td>Se debe cortar un agujero a través de esta mesa para que la caja de arena pueda descansar sobre la mesa de mármol debajo</td></tr><tr><td>Caja de madera llena de arena</td><td></td><td></td><td>hecha a medida, cualquier caja con arena</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos Etapa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>muestra</td></tr><tr><td>Alambres de pinza de cocodrilo para conexión a</td><td></td><td></td><td></td>tierra</tr><tr><td>Alambre</td><td></td><td></td><td></td>de cobre aislado</tr><tr><td>Alambre de plata, 0,125 mm de diámetro</td><td></td><td>Cables</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>AGW0510 BNC de World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplificador con cabecera</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Reductor de ruido</td><td>Quest Scientific</td><td>Osciloscopio Humbug</td><td></td></tr>, <tr><td>30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, sin sonda</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC Adaptador</td><td></td><td></td><td></td>en T</tr><tr><td>Hardware Powerlab 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Software Labchart ADI</td><td>instruments</td><td>Chart 5</td><td></td>Generador</tr> de <tr><td>impulsos de 10 MHz</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas de vidrio</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td>de <td>plástico ranurado</td></tr><tr><td>Cera</td><td></td><td></td><td></td>de baja temperatura de fusión</tr><tr><td>Soldador</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma con base magnética de bola y casquillo</td><td>Hama foto y vídeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de acero al carbono de doble filo, rompible</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; en vivo</em&gt; registros intracelulares

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

registro intracelular es una técnica poderosa utilizada para determinar cómo una sola célula puede responder a un estímulo dado. En la investigación de la visión, el registro intracelular ha sido históricamente una técnica común utilizada para estudiar la sensibilidad de las células fotorreceptoras individuales a diferentes estímulos luminosos que se sigue utilizando hoy en día. Sin embargo, sigue habiendo una escasez de metodología detallada en la literatura para los investigadores que desean replicar experimentos registro intracelular en el ojo. Aquí se presentan los insectos como modelo para examinar la fisiología del ojo de manera más general. células fotorreceptoras de insectos se encuentran cerca de la superficie del ojo y por lo tanto son fáciles de alcanzar, y muchos de los mecanismos implicados en la visión se conservan a través de filos animal. Se describe el procedimiento básico para la grabación intracelular in vivo de las células fotorreceptoras en el ojo de una mariposa, con el objetivo de hacer que esta técnica sea más accesible a los investigadores con poca experiencia previa en el correolectrophysiology. Introducimos el equipo básico necesario, cómo preparar una mariposa en vivo para la grabación, la forma de insertar un microelectrodo de vidrio en una sola celda, y, finalmente, el procedimiento de grabación en sí. También se explica el análisis básico de datos de respuesta primas para la determinación de la sensibilidad espectral de distintos tipos de células. Aunque nuestro protocolo se centra en la determinación de la sensibilidad espectral, otros estímulos (por ejemplo, luz polarizada) y variaciones del método son aplicables a esta configuración.

Para muchos elementos de la configuración de la grabación, una descripción escrita no proporciona suficiente detalle. La Figura 1 es un esquema de los componentes involucrados en el sistema de grabación completa. En la Figura 2, los espectros se trazan para la luz blanca y cada filtro de interferencia para dar una idea de por qué se necesita un factor de corrección y lo que se necesita para calcular esta corrección. La figura 3 muestra fotos y un diagrama del b...

La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

El objetivo general de este método de registro intracelular es determinar la sensibilidad espectral de células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de un insecto in vivo. Este método puede indicarnos si las longitudes de onda de la luz a las que es sensible una célula se ven afectadas por pigmentos filtrantes. La principal ventaja de esta técnica es que, al conocer las sensibilidades espectrales de fotorreceptores individuales, podemos predecir qué rango de colores puede ver un animal.Para prepararse para la grabación, encienda la lámpara de xenón al menos 45 minutos antes del experimento y encienda el micropipeteador al menos 30 minutos antes de tirar de los electrodos de vidrio. A continuación, encienda todo el equipo de grabación. Asegúrese de que el obturador esté cerrado por defecto, para que no pase luz a través del cable de fibra óptica.Luego, tire de microelectrodos finos de vidrio borosilicatado utilizando el tirador de microelectrodos. Rellene los electrodos por detrás con cloruro de potasio tres molar. Para preparar la muestra, bajo el microscopio, sujete una mariposa individual dentro de un tubo de plástico pequeño con cera caliente, de modo que la cabeza quede inmóvil y sobresalga por un extremo del tubo.Luego, sujete el probóscide, las antenas y las alas con cera. Después, presione el abdomen con un trozo de cera seca. Mantenga el tubo humedecido colocando un trozo de tejido húmedo en su interior, detrás del abdomen del espécimen.Asegúrese de que el espécimen esté completamente inmóvil. A continuación, monte el tubo utilizando un pequeño trozo de cera sobre una plataforma pequeña con una articulación de bola y cuenca que esté unida a una base magnética. Bajo un microscopio estereoscópico, inserte un alambre de plata en la cabeza a través de la parte bucal, como electrodo de referencia.Antes del experimento, fije permanentemente el alambre a la plataforma. A continuación, corte un pequeño orificio en la córnea izquierda utilizando una cuchilla de afeitar, y selle el orificio con vaselina para prevenir la desecación. Una vez realizada la incisión en la córnea, inserte el electrodo de registro en el ojo lo más rápidamente posible, ya que la hemolinfa dentro del ojo se endurecerá rápidamente y dificultará la inserción del electrodo.Si es posible, realice la disección en el equipo donde se llevará a cabo la grabación. Luego, conecte el cable de tierra del cabezal al electrodo de referencia en la plataforma del espécimen, utilizando las pinzas cocodrilo. Monte el electrodo en el porta-electrodos.Posteriormente, inserte el alambre de plata en la solución de cloruro de potasio dentro del microelectrodo. Utilice una fuente de luz con accesorios de cuello de ganso para iluminar la muestra bajo un estereoscopio mientras introduce el electrodo en el ojo. Ajuste el porta-electrodos de manera que el microelectrodo quede directamente encima del orificio previamente cortado en la córnea.Luego, baje el microelectrodo dentro del ojo utilizando el micromanipulador, hasta que se complete un circuito. Una vez dentro del ojo, gire el estereoscopio hacia el exterior de la jaula de Faraday. Apague la fuente de luz que ilumina la muestra y deje al insecto en la oscuridad durante 10 a 20 minutos para la adaptación oscura.Verifique la resistencia del electrodo aplicando una corriente de un nanoamperio y observando el cambio en el voltaje. La resistencia normalmente debe estar en el rango entre 100 y 250 megaohmios. A continuación, active el generador de pulsos para emitir un destello de luz durante toda la duración del experimento, y dirija el cable de fibra óptica hacia el ojo.Verifique en el osciloscopio el cambio de voltaje con cada destello de luz. Un cambio negativo en el voltaje indica que el electrodo aún no ha entrado en la célula. Mueva el cable de fibra óptica alrededor del espécimen hasta observar una respuesta máxima de voltaje.Para generar una respuesta luminosa despolarizante, gire el micromanipulador hacia adelante y hacia atrás, lo que provocará pequeños movimientos verticales del electrodo, mientras golpea ligeramente la base del porta-electrodos o utiliza la función de zumbido en el preamplificador. Continúe realizando pequeños ajustes hasta que aparezca una respuesta luminosa despolarizante en el osciloscopio. Luego, ajuste el cable de fibra óptica para encontrar la señal despolarizante máxima.Realice ajustes pequeños con un micromanipulador y utilice la función de zumbido en el amplificador según sea necesario para asegurarse de que el electrodo esté registrando establemente la célula. Un registro estable debe tener pocos o ningún cambio en el potencial de reposo, bajo ruido de fondo y una respuesta despolarizante consistentemente grande. Es esencial contar con un registro estable en el que el potencial de membrana en reposo no sea ruidoso y no cambie con el tiempo.Las respuestas deben ser grandes y positivas, sin hiperpolarización. Una vez que el sistema esté estable, abra el software y cierre el cuadro de diálogo llamado Galería de experimentos para abrir una ventana emergente con cuatro canales. Ajuste la escala de voltaje en la esquina superior derecha de la ventana del software a 500 milivoltios.Luego, haga clic en Iniciar en la esquina inferior derecha para comenzar la grabación. Minimice los canales tres y cuatro, y ajuste las escalas X e Y. A continuación, permita que el software se ejecute durante toda la duración del experimento.Para la estimulación con luz blanca, registre hasta 10 respuestas individuales, con la rueda de filtros ND ajustada al OD más alto que aún provoque una respuesta. Aquí, el cambio en la respuesta se muestra a 3,0 OD y 2,0 OD. A continuación, registre el mismo número de respuestas desde 3,5 hasta 0,0 OD, en todas las combinaciones posibles, con el fin de obtener una curva logarítmica de intensidad de respuesta. Antes de registrar la respuesta de la célula a todas las longitudes de onda utilizando los filtros de interferencia, primero determine rápidamente la longitud de onda pico.Sin ningún filtro ND en la trayectoria de la luz, coloque un filtro que transmita UV y observe brevemente la amplitud de la respuesta. Repita el procedimiento con un filtro que transmita luz azul, un filtro que transmita luz verde y un filtro que transmita luz roja, lo que debería dar una idea de dónde estará la respuesta máxima. Registre bajo la longitud de onda del filtro que dé la respuesta máxima antes de cambiar a otro filtro de interferencia.Entre las grabaciones con filtros subsiguientes, permita que la célula responda a uno o dos destellos de luz blanca sin ningún filtro en el trayecto de la luz, con el fin de ayudar a monitorear si la respuesta máxima se degrada con el tiempo. Luego, registre con otros filtros de interferencia y permita hasta 10 respuestas por filtro. Este es un ejemplo de un cambio de voltaje negativo grande que se observa justo antes de entrar en una célula.Se muestra aquí una grabación limpia, que tiene poco ruido de fondo y una respuesta despolarizante grande, típicamente de al menos 40 milivoltios. Y aquí hay un ejemplo de una grabación deficiente, debido al cambio de potencial negativo después del pico principal. Este es otro ejemplo de una grabación mala.El potencial de reposo está experimentando grandes fluctuaciones, y la gran cantidad de ruido de fondo puede oscurecer la amplitud de la respuesta. Este es un ejemplo representativo de la sensibilidad espectral derivada de una grabación individual. Los tipos celulares se clasifican según la sensibilidad máxima a una longitud de onda similar y la forma general del espectro de sensibilidad.Luego se promedian los mismos tipos celulares, y se grafica la sensibilidad media con barras de error estándar en cada longitud de onda. Este gráfico muestra las sensibilidades espectrales de tres tipos celulares típicos encontrados en un insecto. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar experimentos conductuales para determinar si todos los tipos de células fotorreceptoras contribuyen o no a la discriminación del color.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video describe el protocolo para el registro electrofisiológico de la actividad de los fotorreceptores en el ojo de una Drosophila inmovilizada, lo que permite una medición precisa de los cambios de voltaje en respuesta a estímulos luminosos.

Registro electrofisiológico de las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de la retina de Drosophila a los estímulos luminosos

El video muestra el registro de la actividad eléctrica en las neuronas fotorreceptoras del omatridio de Drosophila mediante el establecimiento de una configuración de célula completa. Destaca la activación de los canales de potencial receptor transitorio por pulsos de luz, lo que da lugar a protuberancias cuánticas medibles.

Grabaciones de pinzas de voltaje de celda completa de fotorreceptores de Drosophila

Este video muestra el procedimiento para el registro intracelular in vivo de células fotorreceptoras en el ojo de una mariposa y la determinación de la sensibilidad espectral de los tipos de células individuales. Esta técnica permite el estudio de las sensibilidades de las células fotorreceptoras individuales a diferentes estímulos luminosos.

Registro intracelular in vivo de la sensibilidad espectral de las células fotorreceptoras en una mariposa

Fuente: Wagner, K. et al., Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra la visualización del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas TRPL marcadas con eGFP. En él se detalla la preparación de moscas transgénicas para la obtención de imágenes, la captura de imágenes de fluorescencia de células fotorreceptoras y la...

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila

Los microelectrodos afilados permiten una caracterización electrofisiológica precisa de la salida de fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila viva. Aquí mostramos cómo usar este método para registrar respuestas de voltaje de alta calidad de células individuales a la estimulación de luz controlada. Este método es ideal para estudiar el procesamiento de la información neuronal en ojos compuestos de insectos.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Se presenta un protocolo para el estudio de la desensibilización y la recuperación de la sensibilidad de los fotorreceptores de cangrejo sin efecto en función del tiempo circadiano.

Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

Este vídeo demuestra un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. Disociada neuronas comisurales son útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento axonal y orientación.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Aprende a determinar la sensibilidad espectral de fotorreceptores individuales en ojos compuestos de insectos mediante grabación intracelular in vivo. Esta técnica permite predecir el rango de visión cromática en mariposas.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos En Vivo registros intracelulares (Video) | JoVE Journal

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos

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