Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje In Situ La hibridación para comparar dominios de expresión génica en Drosophila Los embriones

El objetivo general de Chromogenic Multi-target WISH es facilitar el mapeo de los patrones de distribución de ARNm dentro de embriones intactos de Drosophila. Con este método, las localizaciones de ARNm de tres genes diferentes se pueden comparar directamente dentro del mismo embrión. El WISH multicolor se puede utilizar para generar mapas de expresión génica en organismos en desarrollo de forma rápida y fiable. Esto puede proporcionar pistas importantes sobre las interacciones reguladoras de los genes, el desarrollo activo y embrionario o la organogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que los patrones de expresión de ARNm de diferentes genes se visualizan en colores distintivos y contrastantes. De esta manera, los sitios de expresión únicos y superpuestos se pueden resaltar con alta precisión. Utilizando procedimientos estándar, recolecte, descorione, fije y devitellinice los embriones requeridos. Guárdelos en metanol en el congelador hasta que los necesite. Ahora, comienza con los embriones a temperatura ambiente. Coloque un inserto en el primer pocillo de una placa de 12 pocillos y agregue dos mililitros de metanol. Transfiera la cantidad deseada de embriones al inserto que se utiliza para transportar los embriones durante todo el procedimiento. Ahora, rehidrate los embriones usando incubaciones de tres minutos en una serie de metanol decreciente. Comience con 75% de metanol en PBS. Siga con 50% de metanol en PBS-T. Luego, use un 25% de metanol en PBS-T y termine con dos incubaciones en PBS-T puro. A continuación, prefije los embriones en paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire el fijador con cuatro lavados en PBS-T. Durante los pasos de lavado, descongele y prepare las soluciones de trabajo para la proteinasa K y la glicina. Después de los lavados, permeabilizar los embriones en Proteinasa K recién preparada durante tres minutos a temperatura ambiente. Detenga la reacción usando dos lavados de un minuto en la glicina recién preparada. A continuación, coloque el prefijo de los embriones en paraformaldehído al 4% hecho en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el paraformaldehído con cuatro lavados en PBS-T tres minutos por pieza. A continuación, transfiera los embriones al tampón de prehibridación. Se pueden almacenar en el congelador hasta que se necesiten. Comience distribuyendo los embriones en tampón de prehy en tubos de dos mililitros. Alícuota de unos 15 microlitros de embriones asentados en cada tubo. Ahora, incuba los embriones en un 65