Name: En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a medir daño directo y oxidativo en el ADN a nivel unicelular mediante el ensayo cometa alcalino modificado con enzimas en hígado de rata. Este método sensible y versátil es útil para evaluaciones de seguridad regulatoria e investigación del cáncer.

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Este trabajo fue apoyado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. Agradecemos la publicación original del estudio de CPA por parte de Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Análisis de dosis-respuesta específica por sexo de la genotoxicidad en ratas F344 tratadas con acetato de ciproterona. Investigación de mutaciones 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Ética declaración: Los procedimientos que implican animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en el / Centro Nacional de Investigación de la FDA para toxicológica. NOTA: El diseño del estudio descrito aquí se basa en el protocolo desarrollado por el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (JaCVAM) para su validación de la prueba in vivo de roedores cometa alcalino 18, y aún más modifica en función de las recomendaciones de la OCDE directriz TG489 19 . 1. Preparación <ol><li> preparación de los portaobjetos <ol><li> Disolver de agarosa de fusión regular en 1% (w / v) en tampón de fosfato (Ca 2+, Mg 2+ libre y libre de rojo fenol) por calentamiento en un horno de microondas. </li><li> Colocar la solución de agarosa estándar 1% fundido en un baño de agua C 55 ° y equilibrar la temperatura con el baño. microscopio de vidrio por inmersión se desliza dentro de la solución de agarosa, drene el exces agarosa y limpie la parte posterior de las diapositivas limpias. Colocar los portaobjetos en posición vertical sobre una superficie plana y deje que los portaobjetos para secar a temperatura ambiente; almacenar las diapositivas en lugar seco. </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones de ensayo cometa <ol><li> Preparar la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5%. Disolver bajo punto de fusión de agarosa en tampón de fosfato (Ca 2 +, Mg2 +, y rojo de fenol libre) por calentamiento en un horno de microondas. Mantener la solución a 37-45 ° C durante la preparación de diapositivas cometa; Desechar la solución de agarosa restante después. </li><li> Preparar tampón de lisis. Hacer una solución 100 mM de disodio del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA disódico, el Sr. 372,24 g / mol), cloruro de sodio 2,5 M (NaCl, Sr. 58,44 g / mol), y 10 mM Tris hidroximetil aminometano (Tris Base, Mr 121,14 g / mol) en agua purificada, y ajustar el pH a 10 con 10 N de solución de hidróxido de sodio (NaOH, Mr 40 g / mol). En el día de uso, añadir Triton X100 y sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sr. 78,13 g / mol) a la solución para alcanzar concentrat definitivaiones de 1% y 10%, respectivamente, y se agita a 4-10 ° C durante al menos 30 min antes de su uso. </li><li> Hacer tampón de enzima fresco en el día de uso. Preparar una solución que contiene 40 mM de 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanosulfónico (HEPES, Sr. 238,3 g / mol), 100 mM de cloruro de potasio (KCl, Sr. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA disódico, y 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA, Mr 66.463 g / mol) en agua purificada. Ajustar el pH a 8,0 con solución de hidróxido de potasio 10 N (KOH, 56,1 g / mol). Se agita a RT y verificar la disolución completa antes de su uso. </li><li> Preparar una solución de tampón alcalino que contiene NaOH 300 mM y 1 mM EDTA disódico en agua purificada. Se agita a 4-10 ° C durante al menos 30 min antes de su uso. Medir el pH de la solución antes de su uso y asegurarse de que el pH es&gt; 13. </li><li> Preparar una solución de Tris base 0,4 en agua purificada, y ajustar el pH a 7,5 con ácido clorhídrico (HCl, Sr. 36,46). Almacenar la solución a 4-10 ° C. Este es neutralizar buffer. </li><li> hacer fResh picado búfer en el día de uso. Preparar una solución que contiene 20 mM EDTA disódico y 10% DMSO en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, y rojo de fenol libre). Almacenar en hielo hasta su uso. </li><li> Para preparar la solución de tinción, diluir fluorescente ácido solución de tinción de la nucleico con Tris-borato-EDTA (tampón TBE) a 1: 10.000 (v / v). Proteger la solución de la luz usando papel de aluminio. Almacenar a 2-8 ° C y utilizar con seguridad 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de suspensiones de células individuales de hígado de rata <ol><li> La eutanasia a las ratas con CO 2 siguientes métodos de gases recomendadas en las Directrices American Veterinary Medical para la eutanasia de los animales: 2013 Edición 20. <ol><li> Ajuste la velocidad de flujo de CO2 en 2,75. Ponga la rata en la cámara de eutanasia (por ejemplo, el vaso desecador, jaula de ratas con tapa ventilada) y encienda el CO 2 mediante la apertura de la válvula del tanque. Espere a 1,5 a 2,5 min hasta que elrata queda inconsciente. Aumentar el flujo de CO 2 en la posición máxima. Después del cese de la respiración, dejar la rata en la cámara durante aproximadamente 1 min para asegurar la eutanasia. Verificar la eutanasia mediante la palpación de confirmar que la rata no tiene latido del corazón, y pellizcar los dedos de los pies para determinar que la rata no retira su extremidad. </li></ol></li><li> Desinfectar el cabello-piel con etanol al 70%. Abra la cavidad abdominal y eliminar el hígado intacto con tijeras quirúrgicas. Después de retirar el hígado, eliminar el lóbulo lateral izquierdo del hígado restante con tijeras quirúrgicas. Coloque el lóbulo lateral izquierdo en una tabla de cortar y cortar dos gruesas secciones transversales adyacentes 3-4 mm utilizando una cuchilla desechable de un solo filo de afeitar. </li><li> Coloque una sección transversal en papel de filtro (para evitar que se encrespa de la sección), y coloque la sección en formalina al 10% tamponada neutra (NBF). Asegúrese de que la proporción de 10% NBF al tejido es 10: 1 o mayor. Después de un tiempo de fijación de por lo menos 72 horas, procESS el hígado para histopatología (véase la sección 7, a continuación). </li><li> Coloque la segunda sección transversal de hígado en 5 ml de tampón enfriado con hielo picado (sección 1.2.6) en una placa de 6 cm Petri y enjuagar 3 veces para eliminar la sangre residual. </li><li> La transferencia de la sección de hígado a un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml que contiene 1 ml de tampón de picar carne enfriada con hielo. Picar la sección del hígado bien enjuagado, con un par de tijeras finas para liberar las células. Colar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los grumos de tejido. </li><li> Coloque la suspensión de células individuales en hielo y utilizar para hacer diapositivas dentro de 1 hora. Verificar la concentración de células por recuento (por ejemplo, con un hemocitómetro o un contador de células electrónico) para asegurar que su concentración es de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml. </li></ol> 3. Preparación de las diapositivas Comet <ol><li> Mezclar un volumen de la suspensión de células individuales con 10 volúmenes de fundido, 37 ° C, la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% (sección 1.2.1).Inmediatamente pipeta 100 l en un portaobjetos recubierto con agarosa de punto de fusión normal (sección 1.1). Inmediatamente colocar un cubreobjetos sobre la mezcla de células de agarosa. Haga por lo menos 8 diapositivas para cada muestra. NOTA: Todas las diapositivas deben ser identificados por un número o código similar y su identidad registran, por lo que las diapositivas se pueden calificar de forma ciega (véase 6.2.2, a continuación). </li><li> Sentar las diapositivas plana y enfriar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Después de que el gel se haya solidificado, retire con cuidado la cubierta se desliza y sumergir los portaobjetos en tampón de lisis enfriado previamente (sección 1.2.2). Proteger a las diapositivas de la luz y mantener los portaobjetos en el tampón de lisis a 4 ° C de 1 hora (mínimo) a S / N (máximo). </li></ol> 4. El tratamiento enzimático de Comet Diapositivas <ol><li> Retire 6 de los 8 portaobjetos preparados a partir de cada muestra de tejido del tampón de lisis y enjuague 3 veces durante 5 min cada una con tampón de enzima (sección 1.2.3) a TA. Utilice las dos diapositivas restantes para el ensayo cometa alcalino without enzima-tratamiento (ver 5.1, más abajo). Después de aclarar, eliminar el exceso de líquido mediante el drenaje y secante las diapositivas con los tejidos. </li><li> Diluir las existencias de enzimas hOGG1 y Endo III con tampón de enzima a 1: 1.000 (v / v). Colocar en hielo hasta su uso. </li><li> Aplicar 200 l de las siguientes soluciones a los portaobjetos preparados a partir de cada grupo de tratamiento: 200 l de tampón de enzima sola (2 diapositivas utilizadas como diapositivas de referencia), 200 solución de l hOGG1 (2 diapositivas) o 200 l solución Endo III (2 diapositivas). </li><li> Ponga los portaobjetos en placas de Petri llenas de toallas de papel humedecidas, cubrir los portaobjetos con Parafilm, y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos para Endo III-tratada y diapositivas de referencia y 30 minutos para las diapositivas tratados con hOGG1. </li><li> Después de la incubación, enjuague los portaobjetos con agua destilada y continuar el proceso tal como se describe en el punto 5.2, a continuación. </li></ol> 5. El desenrollar y Electroforesis <ol><li> Para las diapositivas no tratados con enzimas, retire las diapositivas desde el tampón de lisis, La fuga de los portaobjetos y enjuagar una vez con tampón de neutralización en frío (sección 1.2.5) durante 5 minutos para eliminar los residuos de detergente y sales. </li><li> Colocar los portaobjetos de los Pasos 4.5 y 5.1 al azar en un tanque de electroforesis en gel horizontal, evitando cualquier espacio. Llenar el depósito con pH&gt; 13 tampón de electroforesis recién hecho (sección 1.2.4) hasta que el nivel del líquido solo cubre las diapositivas (evitar las burbujas sobre la agarosa y asegúrese de que el tanque esté nivelado). Registrar el pH del tampón y la temperatura en el inicio de la anulación de ADN. </li><li> Deje que los portaobjetos se mantienen en el tampón alcalino durante 20 min para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión de daños alcalino-responsable. </li><li> Durante el desenrollado, el programa de la fuente de alimentación para producir 0,7 V / cm en el tanque de electroforesis (V / cm = voltios dividido por la distancia en cm entre los electrodos positivos y negativos). </li><li> Después de desenrollar, pulse el botón de ejecución de la fuente de alimentación. Si es necesario, ajustar la corriente de 300 mA levantando o bajando el nivel de búfer. Mantenga THnivel de tampón e justo por encima de la superficie de los portaobjetos. Realizar electroforesis a 4 ° C durante 20 min. Registrar la colocación de diapositivas, la temperatura de la memoria intermedia y la corriente (amperios) al inicio y al final de la electroforesis. NOTA: El exceso de tampón se traducirá en tensiones más bajas que pueden interferir con la migración del ADN. </li><li> Después de la electroforesis, neutralizar el exceso de álcali levantando suavemente los portaobjetos del tanque y la inmersión en tampón de neutralización (sección 1.2.5) durante 5 min. Escurrir las diapositivas y repite dos veces más. </li><li> Fijar los portaobjetos por inmersión en etanol frío 100% durante 5 min. Deje que los portaobjetos se sequen al aire y colocar en un lugar seco para el almacenamiento. </li></ol> 6. La tinción de ADN, el cometa de visualización y análisis <ol><li> tinción de ADN <ol><li> Colocar los portaobjetos en una bandeja de cartón o metal y añadir 200 l de solución de trabajo nucleico mancha fluorescente de ácido (sección 1.2.7) para cada diapositiva y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Proteger a las diapositivas deluz permiten que las diapositivas permanecen en contacto con la solución de tinción durante al menos 30 minutos antes de la puntuación. Tinción de las diapositivas en lotes de 20 a la vez. </li><li> Antes de leer cada diapositiva, suavemente seque el exceso de solución de tinción, teniendo cuidado de no perturbar la cubierta de vidrio. </li></ol></li><li> Visualización cometa y de puntuación <ol><li> Utilizar una cámara de vídeo conectada a un microscopio de fluorescencia para ver imágenes en directo de la diapositiva cometa en el monitor de la computadora. </li><li> Aleatoriamente elegir un campo del microscopio que contiene células. El uso de un ratón, seleccione una celda. Haga clic en el centro de la &quot;cabeza del cometa&quot; con el botón izquierdo del ratón. NOTA: El software ordenador calcula todos los parámetros de medición para la célula y añade los datos a un archivo de datos. </li><li> Puntuación todas las células en el campo actual (véase el paso 6.2.4), y luego utilizar los controles de la etapa del microscopio y el video en pantalla para encontrar otro conjunto de células. Puntuación estas células como se describe en 6.2.2. </li><li> Anotar la diapositiva from derecha a izquierda y de abajo a arriba. Elige unos 10 campos al azar. Durante este proceso, cualquier célula adecuada cometa que aparece en el campo de vista debe marcó sin sesgo. NOTA: No marcar si un cometa cualquiera de las siguientes situaciones: 1) que se encuentra en cualquiera de los bordes de la diapositiva; 2) dos o más cometas se superponen; 3) hay restos en la cola; 4) el software no puede diferenciar entre la cabeza y la cola; o 5) la tinción del núcleo y / o la cola es muy diferente de otras cometas de la diapositiva. NOTA: Los cometas con casi toda su fluorescencia del ADN en la cola se refieren a menudo como los cometas &#39;erizo&#39;. cometas erizo no deben ser puntuados, pero el número de erizos detectados durante el marcador de diapositivas deben ser registrados y aparecen como un porcentaje del total de los cometas. </li><li> Analizar al menos 75 cometas por diapositiva, la lectura se desliza por dos órganos / tejidos para obtener al menos 150 células / muestra de cometas en total. Después de que el número requerido de células de una diapositiva tener estaren anotó, el resultado se guarda como un archivo de hoja de cálculo para el análisis de datos más adelante. </li></ol></li></ol> 7. Análisis Histopatología <ol><li> Después de un mínimo de la fijación 72 hr en NBF al 10%, seguido por el tejido de recorte 21, de forma rutinaria procesar e incrustar el lóbulo hepático lateral izquierdo de las muestras en una parafina-cera a base medio 22. Sección de las muestras a aproximadamente 5 micras y recoger en portaobjetos de vidrio. </li><li> Manchar las secciones con hematoxilina y eosina (H &amp; E): <ol><li> Calentar los portaobjetos con las secciones de tejido de parafina en un horno de 60 ° C durante 2 horas antes del procedimiento de tinción. </li><li> Use xileno para Desparafinar los lados. Rehidratar los portaobjetos con etanol clasificado (EtOH) con un enjuague con agua corriente del grifo. </li><li> Colocar los portaobjetos en 450 ml de hematoxilina durante 2 min y 40 seg. Lavar los portaobjetos con ácido (ácido acético glacial 2 ml a 450 ml de agua desionizada) durante 4 segundos después de 5 minutos enjuagar con agua corriente del grifo. </li><li> Coloque el deslizadoES en 450 ml 70% de EtOH que contiene 1 ml de hidróxido de amonio durante 2 min, seguido de funcionamiento del grifo enjuague de agua durante 2 min y 30 seg, y 70% de enjuague EtOH durante 1 min. </li><li> Incubar los portaobjetos con 450 ml de solución de eosina Y que contiene ácido acético glacial 4 ml durante 3 min. </li><li> Deshidratar las diapositivas con EtOH graduada. Limpiar los portaobjetos con xileno (tres veces 1 min cada uno), y mantenga los portaobjetos en xileno hasta cubreobjetos se colocan en las diapositivas. </li></ol></li><li> Examinar los portaobjetos de microscopio de luz, los resultados de registro, y las lesiones no neoplásicas grado de severidad que 1 (mínimo), 2 (leve), 3 (moderado) o 4 (marcado). NOTA: El grado de severidad solicitado una lesión específica se basa en la proporción relativa del hígado con la lesión (= mínimo &lt;1-15%; leve = 16-35%; moderado = 36-60%; y marcado = 61- 100%). </li></ol> análisis 8. Datos <ol><li> El animal se considera la unidad experimental para evaluaciones estadísticas. daño en el ADN se expresa como% DNA en la cola. </li><li> daño oxidativo del ADN se calcula de la siguiente manera: los toboganes de referencia (sin tratamiento enzimático) proporcionan una estimación de las roturas de la cadena de ADN de fondo (SB). NOTA: Los portaobjetos tratados con enzimas proporcionan una medida de roturas de la cadena y bases oxidadas (SB + OX). Suponiendo una respuesta lineal a la dosis para el% de ADN en la cola como una función de daño en el ADN, la resta de SB de SB + OX da una estimación de roturas de la cadena de ADN de oxidados pirimidinas / purinas alterados 23. </li><li> Analizar el ADN% en la cola como una función de la dosis por ANOVA de una vía, seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones por pares de las respuestas en los animales tratados al control del vehículo. NOTA: Todas las pruebas son de una cola y un valor de p inferior a 0,05 se establece como criterio para la significación estadística. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF">http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF</a> (2000).</li>
<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o intereses contrapuestos. La información en estos materiales no es una difusión formal de información por parte de la FDA y no representa la posición o política de la agencia.

Este protocolo describe la medición simultánea de tanto el daño de ADN directa y oxidativo en el hígado de rata a nivel de células individuales. El protocolo general es aplicable a cualquier tejido del que las células individuales o núcleos se pueden aislar con un mínimo de daño en el ADN de procesamiento inducida (es decir, el daño del ADN inducido no por el agente de ensayo, pero por el manejo y procesamiento de los tejidos animales). En nuestra investigación, hemos llevado a cabo el ensayo del cometa alcalin...

El ensayo cometa alcalino mide roturas de la cadena de ADN a nivel de una sola célula. Las suspensiones de células individuales están incrustadas en agarosa sobre un portaobjetos de microscopio y las células se lisaron para formar nucleoides, que contienen bucles superenrollado de ADN. Electroforesis a pH&gt; 13 resultados en la pérdida de superenrollamiento en los bucles de ADN que contienen roturas de la cadena, con las hebras de ADN liberados que migran hacia el ánodo, creando estructuras parecidas a cometas que pueden ser observadas por microscopía de fluorescencia. La fragmentación de ADN migra de la &quot;cabeza&quot; del cometa en la &quot;cola&quot; en función del tamaño del fragmento, y la fluorescencia relativa de la cola del cometa en comparación con la intensidad total (cabeza y cola) se puede utilizar para cuantificar la rotura de ADN 1 , 2. El ensayo es simple, sensible, versátil, rápido, y relativamente barato 1. La detección de ADN fragmentado causada por agentes que dañan el ADN se utiliza un ensayo para cuantificar el daño del ADN en las células o núcleos aislados a partir de individuales tejidos de animales tratados con el material (s) potencialmente genotóxicos. Debido a sus ventajas, el ensayo cometa in vivo se recomienda como un segundo ensayo in vivo de genotoxicidad (emparejado con el ensayo de micronúcleos in vivo) para la realización de evaluaciones de seguridad de productos en la corriente de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) 3 y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (AESA 4) las directrices reguladoras. En nuestro laboratorio, hemos empleado el ensayo para evaluar el daño del ADN in vivo inducida por ingredientes de alimentos, productos farmacéuticos y los nanomateriales en 5-10. de hígado de rata se utiliza como un ejemplo en este protocolo, pero el ensayo de cometa se puede realizar con otros tejidos / órganos de animales de experimentación, siempre que las células individuales intactos pueden ser aisladas de tejido. Ciertos tipos de daño en el ADN son difíciles de detectar como roturas de la cadena de ADN sin modificar el ensayo cometa alcalino básico. En el caso de daño oxidativo del ADN, hebra breaks se pueden crear en lesiones oxidativas en el ADN por digestión con enzimas de reparación, tales como humano 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilasa 1 (hOGG1, que crea roturas en 8-oxoguanina (8-oxoGua) y metil-Fapy-guanina 11. también, endonucleasa III (Endo III) crea rompe principalmente en pirimidinas oxidadas 1. Así, la adición de una etapa de enzima-digestión hace que el ensayo de un método específico y sensible para medir el daño oxidativo del ADN in vivo 12. Utilizando estos ensayos, hemos demostrado daño oxidativo del ADN tóxico inducido en el hígado de ratas y ratones 6-8 y en el corazón de ratas 10. El ensayo cometa alcalino tiene muchas aplicaciones en la toxicología genética y control biológico humano: 1) como un seguimiento en el ensayo in vivo para genotoxinas sensibles identificados por los ensayos in vitro 3,13, 2) para evaluar los mecanismos de daño en el ADN-xenobióticos inducida en múltiples tejidos 14, 3) para investigar si unacarcinógeno funciona mediante un modo no genotóxico de acción (MOA) 7 genotóxico o, 4) para evaluar el ADN a reparar el daño 15, 5) para investigar enfermedades humanas y las exposiciones ocupacionales 16, y 6) como un ensayo de cribado de alto rendimiento potencial de -órgano específico genotoxicidad 17.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos (n.º 1, 24 x 50 mm)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Fisher disódico</td><td></td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina equilibrada Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ libre)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarosa</td></tr><tr><td>Gammarosa de fusión normal (NMA)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de papel de prueba de pH (pH 7,5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>etiquetas portaobjetos (0,94 x 0,5 pulg.)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&comercio; Oro&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 ml</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células (40 &micro; m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasa III (Nth)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td>Dilución <td>M0241S</td> <td>de New England Biolabs</td><td>1:1.000</td></tr></tbody></table>

en vivo alcalina comet assay y comet assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el adn strand y daño oxidativo del adn en el hígado de rata

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

El daño no reparado en el ADN puede provocar inestabilidad genética, lo que a su vez puede mejorar el desarrollo del cáncer. Por lo tanto, la identificación de posibles agentes dañinos para el ADN es importante para proteger la salud pública. El ensayo de cometa alcalino in vivo, que detecta el daño en el ADN a medida que se rompe la hebra, es especialmente relevante para evaluar los peligros genotóxicos de los xenobióticos, ya que sus respuestas reflejan la absorción, distribución tisular, metabolismo y excreción (ADME) in vivo de productos químicos, así como el proceso de reparación del ADN. En comparación con otros ensayos de daño del ADN in vivo, el ensayo es rápido, sensible, visual y económico, y, al convertir el daño oxidativo del ADN en roturas de hebras utilizando enzimas de reparación específicas, el ensayo puede medir el daño oxidativo del ADN de una manera eficiente y relativamente libre de artefactos. La medición del daño en el ADN con el ensayo cometa se puede realizar utilizando diseños de estudio de toxicología aguda y subcrónica, y al integrar el ensayo cometa con otras evaluaciones toxicológicas, el ensayo aborda los requisitos de bienestar animal al aprovechar al máximo los recursos animales. Otra ventaja importante de los ensayos es que solo requieren una pequeña cantidad de células, y las células no tienen que derivarse de poblaciones celulares en proliferación. Los ensayos también se pueden realizar con una variedad de muestras humanas obtenidas de individuos expuestos clínica u ocupacionalmente.

El ensayo cometa alcalino in vivo se llevó a cabo en conjunción con el ensayo de cometa modificado por la enzima para medir tanto la lesión directa del ADN y oxidativo en el hígado de ratas tratadas con acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA es un fármaco hormonal sintético que induce tumores de hígado de rata de una manera específica de un sexo, con cinco veces las dosis más altas necesarias para inducir tumores de hígado en ratas macho en comparación con hembras d...

El ensayo del cometa alcalino mide las roturas de la cadena de ADN en las células eucariotas. Al agregar un paso de digestión de endonucleasa III o 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilasa humana, el ensayo puede detectar de manera eficiente el daño oxidativo del ADN. Describimos los métodos para usar estos ensayos para detectar daños en el ADN en el hígado de rata.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

El objetivo general del ensayo cometa alcalino in vivo y del ensayo cometa alcalino modificado con enzimas es medir simultáneamente el daño directo y oxidativo en el ADN a nivel de célula individual. Este método fue propuesto inicialmente como una herramienta regulatoria para el análisis de seguridad de productos regulados por la FDA. Puede ayudar a responder preguntas clave en campos que van desde la evaluación regulatoria de seguridad hasta la epidemiología molecular y la investigación básica del cáncer.Esta técnica es sensible y versátil, y además es relativamente económica. Es capaz de detectar daño en el ADN en prácticamente cualquier tejido animal. En general, las personas sabían que este método tendría dificultades para preparar rápidamente suspensiones de células individuales a partir de diversos tejidos, y que podría ser un desafío.La demostración visual de este método es fundamental porque requiere cierta dosis de arte, además de ciencia. Después de sacrificar las ratas con gas de dióxido de carbono, según el protocolo descrito, palpe para confirmar que la rata no tiene latidos cardíacos y pellizque los dedos de los pies para verificar que la rata no retire la extremidad. Utilice etanol para desinfectar la piel, luego use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad abdominal, antes de extraer el hígado intacto.Con tijeras, separe el lóbulo lateral izquierdo del resto del órgano y colóquelo sobre una tabla de cortar. A continuación, utilizando una cuchilla desechable de un solo filo, corte dos secciones transversales adyacentes de 3 a 4 milímetros de grosor. Coloque una sección transversal sobre papel de filtro y luego en formalina tamponada neutra al 10%, o NBF.Coloque la segunda sección de hígado en cinco mililitros de tampón de picado frío con hielo en una placa de Petri de seis centímetros y enjuáguela tres veces para eliminar la sangre residual. A continuación, transfiera la sección de hígado a un nuevo tubo cónico de dos mililitros que contenga un mililitro de tampón de picado frío con hielo. Con tijeras finas, pique la sección para liberar las células y luego, utilizando un filtro celular de 40 micrómetros, filtre la suspensión celular para eliminar cualquier grumo de tejido.Coloque la suspensión celular individual en hielo y, con un hemocitómetro, verifique que la concentración sea aproximadamente dos veces 10 a la sexta células por mililitro. Para preparar las láminas de cometa, mezcle un volumen de la suspensión celular individual con 10 volúmenes de solución de agarosa de punto de fusión baja al 0,5 % fundida a 37 grados Celsius. Inmediatamente, pipetee 100 microlitros sobre una lámina previamente recubierta con agarosa y use un cubreobjetos para cubrir la mezcla de agarosa y células.Coloque las laminillas en posición horizontal y enfríe a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Una vez que el gel haya solidificado, retire cuidadosamente las cubreobjetos e introduzca las laminillas en tampón de lisis previamente enfriado. Incube a oscuras a cuatro grados Celsius durante una hora hasta toda la noche.Después de la incubación, retire seis de los ocho portaobjetos preparados para cada muestra de tejido del tampón de lisis, y use el tampón enzimático a temperatura ambiente para enjuagarlos tres veces durante cinco minutos cada vez. Luego, use tejidos para absorber el exceso de solución. A continuación, use el tampón enzimático para diluir las soluciones madre de las enzimas hOGG1 y Endo III, uno a mil, y colóquelas en hielo.Coloque los portaobjetos en placas de Petri forradas con toallas de papel humedecidas, luego aplique 200 microlitros de las siguientes soluciones sobre los portaobjetos en cada grupo de tratamiento. Añada solo tampón enzimático a dos portaobjetos, solución de hOGG1 a dos portaobjetos y solución de Endo III a dos portaobjetos, y cubra los portaobjetos con Parafilm. A continuación, coloque los portaobjetos a 37 grados Celsius, incubando los portaobjetos tratados con Endo III y los portaobjetos de referencia durante 45 minutos, y los portaobjetos tratados con hOGG1 durante 30 minutos.Después de la incubación, drene las láminas y, para las láminas de referencia, use tampón de neutralización frío para eliminar detergentes y sales residuales. Luego, enjuague las láminas tratadas con enzima con agua destilada. Coloque aleatoriamente las láminas en un tanque horizontal de electroforesis en gel, evitando dejar espacios.Luego, agregue tampón de electroforesis recién preparado al tanque, evitando burbujas, hasta que apenas cubra los portaobjetos. Configure la fuente de alimentación a 0,7 voltios por centímetro e incube los portaobjetos en el tampón alcalino durante 20 minutos, para permitir la desnaturalización del ADN y la expresión del daño alcali-labile. Registre la ubicación de los portaobjetos, la temperatura del tampón y la corriente.Después de la incubación para la desnaturalización, coloque el tanque de electroforesis a cuatro grados Celsius. Luego, presione el botón Ejecutar en la fuente de alimentación y, si es necesario, ajuste la corriente a 300 miliamperios elevando o bajando el nivel del tampón, manteniéndolo justo por encima de los portaobjetos. Ejecute las muestras durante 20 minutos, antes de registrar nuevamente la colocación de los portaobjetos, la temperatura del tampón y la corriente.Tras la electroforesis, retire cuidadosamente los portaobjetos del tanque e introdúzcalos en un tampón de neutralización para neutralizar el exceso de álcali. Luego, escurra los portaobjetos y repita la neutralización otras dos veces. Fije los portaobjetos con etanol frío al 100 % durante cinco minutos.Deje que las laminillas se sequen al aire y guárdelas en un ambiente seco. Para teñir el ADN, coloque las laminillas sobre una bandeja de cartón o metal e incorpore 200 microlitros de solución de trabajo del colorante fluorescente para ácidos nucleicos a cada laminilla, antes de cubrirlas con una cubreobjetos. Proteja las laminillas de la luz e incube durante al menos 30 minutos.Luego, para leer las laminillas, elimine suavemente con absorción el exceso de solución de tinción, teniendo cuidado de no perturbar el cubreobjetos. A continuación, coloque la laminilla de cometa sobre la platina de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de video y seleccione aleatoriamente un campo que contenga células. Después de abrir el software de ensayo de cometa, usando el ratón, seleccione una célula y haga clic izquierdo en el centro de la cabeza del cometa de la célula.El software calculará los parámetros para la célula y los agregará a un archivo de datos. Una vez que se hayan puntuado todas las células en el campo actual, pase a otro campo y repita la puntuación de cualquier célula cometa adecuada que aparezca, sin sesgo. Puntúe 10 campos aleatorios y al menos 75 cometas por portaobjetos.Finalmente, guarde los datos en una hoja de cálculo para su análisis posterior. Como se informó previamente, el CPA es un fármaco hormonal sintético que induce tumores hepáticos en ratas de manera específica al sexo, requiriendo dosis cinco veces más altas para inducir tumores hepáticos en ratas macho en comparación con las hembras. Como se muestra aquí, el ensayo cometa alcalino in vivo y el ensayo cometa modificado con enzimas demostraron que se necesitaba una dosis cinco veces mayor de CPA para inducir un aumento significativo en el daño del ADN en hígados de ratas macho, en comparación con las hembras.La hidroxisteroide sulfotransferasa, o HST, se expresa en niveles 15 veces más altos en ratas adultas hembras en comparación con los machos adultos. El metabolismo de la HST es una etapa limitante en la activación del CPA a metabolitos que se unen al ADN. Como se observa aquí, el daño oxidativo en el ADN inducido por CPA fue generalmente mayor en hígados de ratas macho en comparación con hembras, y por lo tanto, es menos probable que sea una etapa limitante en la formación de tumores en ratas macho.Como se informa en estas tablas, la evaluación histopatológica de hígados de ratas tratadas con CPA no mostró evidencia de apoptosis o necrosis inducida por el agente, lo que confirma conclusiones previas de que los resultados positivos en el ensayo del cometa no fueron un efecto secundario de la citotoxicidad. Durante este procedimiento, es importante obtener una suspensión de células individuales y preparar las laminillas para el ensayo del cometa lo más rápidamente posible. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la toxicología genética exploraran cuantitativamente el daño y la reparación del ADN en prácticamente cualquier tejido animal y también en muestras humanas.Después de ver este video, esperamos que pueda comprender mejor cómo utilizar el ensayo de cometa alcalino in vivo junto con el ensayo de cometa modificado con enzimas, para medir simultáneamente roturas del ADN y daño oxidativo del ADN, a nivel de célula individual en tejidos animales. Tenga presente que trabajar con reactivos que causan daño al ADN puede ser extremadamente peligroso. Use siempre el equipo de protección personal cuando realice estos procedimientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos un ensayo de electroforesis alcalina de una sola célula para cuantificar roturas de ADN de cadena simple y doble en células tratadas con doxorrubicina. Las condiciones alcalinas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de ADN, lo que resulta en el desenrollado completo y la separación de las hebras de ADN. Esto permite la migración diferencial de fragmentos de ADN dañados y no dañados en gel de agarosa tras la electroforesis, revelando una...

Electroforesis en gel alcalino de una sola célula: una técnica sensible para la estimación cuantitativa del daño en el ADN en células cancerosas individuales después de la quimioterapia

El video muestra el ensayo del cometa para detectar daños en el ADN después de la exposición a agentes nocivos. En condiciones alcalinas, el ADN se desenrolla y se desnaturaliza, y tras la electroforesis, el ADN dañado y no dañado migra de manera diferente en el gel de agarosa, formando una estructura en forma de cometa. El ADN no dañado que migra lentamente forma la cabeza circular del cometa, mientras que los fragmentos de ADN dañados que migran rápidamente forman la cola alargada del cometa.

Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

Ensayo cometa mide roturas en el ADN, inducidas por diferentes factores. Si se mantienen constantes todos los factores (excepto el estrés oxidativo) que causan daño en el ADN, la cantidad de daño en el ADN es un buen parámetro indirecto de estrés oxidativo. El objetivo de este protocolo es usar ensayo cometa para la medición indirecta de estrés oxidativo.

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

Aquí describimos dos modificaciones del ensayo de fibra de ADN para investigar las brechas de ADN de cadena simple en la replicación del ADN después de la inducción de la lesión. El ensayo de fibra S1 permite la detección de huecos post-replicativos utilizando la endonucleasa S1 específica de ssDNA, mientras que el ensayo de llenado de huecos permite la visualización y cuantificación de la reparación de huecos.

Detección de acumulación y reparación de brechas post-replicativas en células humanas utilizando el ensayo de fibra de ADN

El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.

Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular

Aprende a medir daño directo y oxidativo en el ADN a nivel unicelular mediante el ensayo cometa alcalino modificado con enzimas en hígado de rata. Este método sensible y versátil es útil para evaluaciones de seguridad regulatoria e investigación del cáncer.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata (Video) | JoVE Journal

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

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