Name: La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos E. coli Para la cristalografía de rayos X (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a producir y purificar el dominio P del norovirus humano en E. coli para cristalografía de rayos X. Este protocolo rápido genera proteína altamente pura en menos de cuatro semanas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La financiación de este estudio fue proporcionada por la fundación CHS. Reconocemos la plataforma de cristalización de proteínas dentro del clúster de excelencia CellNetworks de la Universidad de Heidelberg para el cribado de cristales y la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón para la provisión de instalaciones de radiación sincrotrón.

1. P dominio Clonación <ol><li> Determinar la región de dominio de código P por la alineación de secuencias de cepas de norovirus (por ejemplo, la cepa GII.10, GenBank: AF504671, AP-ID: 3ONU) 6. Además, eliminar la región flexible en el extremo C-terminal del dominio P (Figura 2A). Codon-optimizar el ADN para E. coli expresión e incluyen BamHI (C-terminal) sitios de restricción (N-terminal) y NotI con el fin de sub-clon de la P dominio región codificante en el vector de expresión pMalc2x 6,7. Nota: La región de codificación de dominio P se optimiza y se sintetiza por un servicio comercial. El dominio P región codificante (inserto) es de aproximadamente 1 kb de longitud y entregado en un vector de transferencia estándar. </li><li> Digerir 2 g del vector de transferencia con cada 1 BamHI mu l (20.000 U / ml) y NotI (10.000 U / ml) enzimas de restricción durante 1 hora a 37 ° C con el fabricante suministra buffers. </li><li> Separar el inserto digerido en un gel de agarosa al 1%durante 20 minutos a 135 V y purificar el ADN de inserto a partir del gel utilizando un kit comercial. </li><li> Preparar el vector de expresión pMalc2x por digestión de 2 g de este vector con cada 1 l BamHI (20000 U / ml) y NotI (10.000 U / ml) enzimas de restricción durante 1 hora a 37 ° C. Se purifica el vector de un gel de agarosa como se describe anteriormente (1.3). Nota: Las dos muestras (1.2 y 1.4) se pueden almacenar a -20 ° C. </li><li> Ligar el inserto purificado en el vector pMalc2x digerido en los sitios de restricción BamHI y NotI con 1 l de ligasa T4-ADN (400.000 U / ml) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) (Figura 2B y 2C). Utilice al menos 20 ng del vector pMalc2x y un vector: relación de inserción de 1: 3 (peso molecular). La mezcla de ligación es normalmente ~ 20 l. </li><li> Transformar 2 l de la mezcla de ligación en E. 50 l químicamente competente coli DH5a células bacterianas utilizando un protocolo de transformación estándar (10 min en hielo, de choque térmico 45 seg a 42 ° C) y crecer en 600medio SOC l durante 1 hora a 37 ° C. Centrifugar las células transformadas durante 3 minutos a 1.000 xg, desechar el sobrenadante, y resuspender el precipitado en 30 l de medio SOC. <ol><li> Placa de la mezcla de transformación en placas de LB-agar, que contiene 100 mg de ampicilina / ml para la selección, y crecer durante la noche a 37 ° C. Seleccionar al menos cinco colonias. </li></ol></li><li> Para cada una de las cinco colonias, inocular 2-3 ml de cultivo de medio LB suplementado con 50 g / ml de ampicilina (LB-amp) y crecer mediante agitación durante la noche a 160 rpm a 37 ° C. </li><li> Extraer los plásmidos de cultivo de una noche usando un kit comercial. Verificar la presencia del dominio P inserto por secuenciación con un cebador directo pMalc2x (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) y cebador inverso (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> Expresión 2. P dominio <ol><li> Transformar 1 l (150 ng / l - 400 ng / l) de la codificación de vector pMalc2x para la Su MBP--P dominioproteína de fusión en 50 l de E. competente células de E. coli BL21 utilizando un protocolo de transformación estándar (10 min en hielo, choque térmico de 45 segundos a 42 ° C) y crecen en 600 l medio SOC durante 1 hora a 37 ° C. Subcultivo en 120 ml de LB-amp durante la noche a 160 rpm y 37 ° C. </li><li> Inocular nueve litros (por ejemplo, 6 x 5 L frascos con 1,5 l de medio de cada uno) de LB-amp con el subcultivo (1: 100). Cultivar las células con agitación a 160 rpm y 37 ° C hasta que la DO 600 alcanza 0,4-0,6. Posteriormente, bajar la temperatura a 22 ° C durante ~ 1 hora y luego inducir la expresión de la proteína con 0,66 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 8. Cultivar las células durante la noche a 22 ° C (~ 18 h). Nota: La temperatura puede ser variada, pero se recomienda utilizar 22 ° C o inferior. </li><li> Recoger las células por centrifugación (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Descartar el sobrenadante y congelar el sedimento celular a -20 ° C. </li></ol>1ª Etapa de purificación y de escisión de proteasa <ol><li> Preparar los tampones que se utilizan durante las etapas de purificación de proteínas a partir de soluciones de reserva para garantizar la reproducibilidad y la estabilidad de los experimentos. Preparar cuatro tampones diferentes para la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), cada uno que contiene una concentración diferente de imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM y 250 mM). Para la SEC, preparar un tampón de filtración en gel (GFB) con una concentración de sal más alta, pero sin imidazol. Use agua desionizada y filtrar todos los tampones antes de usarlo con un tamaño de poro de 0,45 micras. Nota: Para un esquema detallado de preparación búfer, consulte la Tabla 1. </li><li> Descongelar el pellet de células a partir del cultivo 9 litros y se disuelven en 150 ml de PBS a 4 ° C. Sonicar la suspensión celular tres veces para 2 min (potencia de 130 W, la amplitud 20%, frecuencia de pulsación 50%) para romper las células. Mantener la suspensión de células en hielo durante la sonicación. </li><li> Centrifuge la suspensión celular se sonicó (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) para separar los residuos celulares del sobrenadante que contiene proteína expresada. Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento. </li><li> Lavar y equilibrar 10 ml (= 1 volumen de columna [CV]) suspensión de Níquel (Ni) perlas de agarosa -NTA con tampón de imidazol 10 mM en una columna de cromatografía. Añadir las perlas de Ni equilibradas al sobrenadante de la etapa 3.3 con adición expresa la proteína de fusión de dominio MBP-His-P y se incuba durante 30 min a 4 ° C con rotación lenta. </li><li> Después de la incubación, se aplican a toda la mezcla de grano-proteína Ni a una columna de cromatografía. Lavar la columna lentamente con cada 5 CV de 10 mM, 20 mM, y 50 tampones de imidazol mM, empezando con 10 mM, a continuación, 20 mM y último 50 mM (Figura 3A). </li><li> Eluir la proteína de fusión de dominio MBP-His-P usando tampón de imidazol 250 mM (Figura 3A). Durante la elución, compruebe el 280 nm OD para verificar la elución de la proteína de fusión (el aumento de OD 280nm). Continuar la elución hasta que la OD 280 nm se reduce a ~ 0,1. Lavar las perlas con cantidades excesivas de tampón de imidazol 250 mM (por lo menos 10 CV), seguidos por al menos 10 CV de 10 mM de tampón de imidazol. Guardar los granos para la segunda etapa de purificación (sección 4). </li><li> Verificar la presencia de la proteína de fusión de dominio MBP-His-P con SDS-PAGE usando un gel 12% SDS-poliacrilamida (10 x 8 cm) 9 (Figura 3A). Realizar electroforesis en gel a 45 A y 200 V durante 45 min. </li><li> Concentrado (por ejemplo, utilizando un concentrador comercial) la proteína de fusión de dominio MBP-His-P se eluyó a una concentración final de ~ 3 mg / ml. Escindir el dominio de fusión MBP-His-P con proteasa HRV-3C durante la diálisis contra 2 L de 10 mM de tampón de imidazol (~ 1: 100) durante la noche a 4 ° C (Figura 3A). Dependiendo del volumen final de proteína concentrada, lleve a cabo la diálisis en un casete de diálisis o un tubo de diálisis. Nota: La cantidad de HRV-proteasa 3C de proteínasescisión se calcula de acuerdo con la actividad de la proteasa específica (2 U / l, 1 U es suficiente para escindir 100 g de proteína) y la cantidad de proteína de fusión eluida que varía en el nivel de expresión y puede ser estimada a partir del resultado de SDS-PAGE (3,7 ). </li></ol> 4. 2ª Etapa de purificación <ol><li> Equilibrar las cuentas de Ni desde el paso 3.6 en tampón imidazol 10 mM. </li><li> Incubar la proteína dializada a partir del paso 3.7 (que contiene el dominio escindido P, proteína MBP, y HRV-proteasa) con los de Ni-cuentas equilibradas (4.1) durante 30 minutos a 4 ° C con rotación lenta. </li><li> Aplicar la mezcla de Ni-talón a una columna y se recoge el flujo a través (dominio P escindido) (Figura 3B). Medir la concentración de proteína, ya que viene de la columna hasta que la OD 280 nm alcanza ~ 0,1. Nota: La MBP-His deberían mantenerse unida a las perlas de Ni (Figura 3B). </li><li> Verificar la presencia del dominio P escindido utilizando SDS-PAGE con un 1Gel 2% como se describió anteriormente (Figura 3B). Se concentra el dominio P eluyó a ~ 3 mg / ml y se dializa durante la noche a 4 ° C contra GFB para la posterior purificación SEC. </li></ol> 5. 3ª Etapa de purificación <ol><li> Las bombas de lavado y tuberías del sistema de purificación por HPLC y pre-equilibrar la SEC-columna (ver Lista de Materiales) con GFB. </li><li> Inyectar el dominio P a la columna a una velocidad de flujo de 1 ml / min utilizando un Superloop (hasta 12 ml) o bucle (hasta 3 ml), dependiendo del volumen de la muestra concentrada. Una vez finalizada la inyección, aumentar la velocidad de flujo a 2,5 ml / min. </li><li> A medida que aumenta de DO y el dominio P sale de la columna, recoger fracciones de 1,5 ml. Compruebe fracciones utilizando SDS-PAGE con un gel de 12% (Figura 4A y 4B). Piscina sólo las fracciones más puras y se concentra para ~ 3 mg / ml y ~ 8 mg / ml. Nota: Después de ~ 110 ml (volumen vacío) la mayoría de las impurezas se eluyeron de una columna SEC con un volumen de 320 ml cama. losdominio P generalmente se eluye como un dímero. La elución de tiempo / volumen del dominio P dímero depende de la calidad preparativa (pg) de la columna de SEC. </li></ol> 6. La cristalización del P dominio <ol><li> Utilice el dominio P a ~ 3 mg / ml y 8 mg / ml para el cribado inicial de cristalización. Preparar al menos 100 l de dominio P por concentración, a las pantallas iniciales con 384 condiciones de detección disponibles comercialmente. Efectuar pruebas de detección a 18 ° C en un formato de placa de 96 pocillos, en el que el depósito contiene 100 l de solución madre y una gota se compone de 0,2 l solución madre y 0,2 l de proteína. </li><li> Repetir y optimizar las condiciones de cristalización de éxito. Por lo tanto, utilizar placas de 15 pocillos que contienen 3 filas. Establecer la primera fila con una solución madre 100%, la segunda fila con solución al 90% la madre y el 10% de agua, y la tercera fila con una solución madre de 80% y 20% de agua. Utilice un tamaño de gota de 2 l (solución madre de proteína + 1 l 1 l) y 50081; l de solución madre como un volumen del depósito. </li><li> Utilice condiciones de cristal optimizados para co-cristalizar el dominio P con ligandos. Preparar placas como se describe en el apartado 6.2. En lugar de 2 l tamaño de gota, configurar gotas que contienen 1 l solución madre, 1 l de proteína, y 1 l de ligando a una concentración de 1 mg / ml. </li><li> Reunir conjuntos de datos de monocristales utilizando radiación sincrotrón. Realizar la sustitución molecular utilizando estructuras de dominio P publicados con una alta similitud de secuencia inicial como modelo de búsqueda 6,10-13. Nota: La presencia de un ligando se muestra como blob no-modelado de la densidad electrónica. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, se describe un protocolo para la expresión y purificación de dominios P ​​norovirus en alta calidad y en cantidad. Los norovirus no están bien estudiadas y son continuamente necesitan datos estructurales. A nuestro entender, la producción de dominio P utilizando otros protocolos (por ejemplo, dominios GST-etiquetados P) ha sido problemático, hasta el momento, y suficientes datos estructurales sobre la interacción huésped norovirus se han perdido. Con el método descrito aquí, hemos contribuido re...

Norovirus humanos son la principal causa de gastroenteritis aguda en todo el mundo 1. Estos virus pertenecen a la familia Caliciviridae, de los cuales hay al menos cinco géneros, incluyendo norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, y Nebovirus. A pesar de su alto impacto en el sistema de salud y la distribución amplia, el estudio de los norovirus humanos se ve obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular robusto. Hasta la fecha, no existen vacunas aprobadas o estrategias antivirales disponibles. La principal proteína de la cápside norovirus, denominado VP1, se puede dividir en un (S) dominio shell y un (P) que sobresale de dominio 2. El dominio P está conectado al dominio S por una región bisagra flexible (H). El dominio S forma un andamio alrededor del RNA viral, mientras que el dominio P forma la parte más exterior de la cápside viral. El dominio P se ensambla en dímeros biológicamente relevantes cuando se expresa en bacterias. El Pdimer interactúa con estructuras de hidratos de carbono, denominados antígenos del grupo histo-sangre (HBGAs) que están presentes como antígenos solubles en la saliva y que se encuentra en ciertas células huésped 3. El dominio de interacción-HBGA P se piensa que es importante para la infección 4. De hecho, un informe reciente reveló la importancia de HBGAs sintéticas o HBGA-expresión de bacterias para la infección por norovirus humana in vitro 5. Los estudios actuales con respecto a la unión de las células huésped de norovirus se realizan principalmente con partículas similares a virus (VLP) que se pueden expresar en células de insectos o con dominios P recombinantes expresados ​​en Escherichia coli (E. coli). Para entender las interacciones de dominio-HBGA P a resolución atómica, estructuras complejas P dominio-HBGA se pueden resolver utilizando cristalografía de rayos X. Aquí, se describe un protocolo para la expresión de dominio P y purificación que permite la producción de dominio P en gran cantidad y de la calidad que se utilizará para crystall de rayos Xgrafía. Por otra parte, este método se puede aplicar para otros dominios calicivirus P y las proteínas no estructurales. El dominio P está optimizado codón para E. expresión coli y se clonó en un vector de transferencia estándar. El dominio P se vuelve a clonar en un vector de expresión que codifica una polihistidina etiqueta (His) y una proteína de unión a manosa (MBP) que son seguidos por un sitio de escisión de la proteasa. El Su--P MBP proteína de fusión de dominio se expresa en E. coli, seguido por tres etapas de purificación. La proteína de fusión de dominio MBP-His-P se purificó usando cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). A continuación, la proteína de fusión se escinde con rinovirus humano (HRV) proteasa -3C y el dominio P se separa de la MBP-His por una etapa adicional de purificación IMAC. Por último, el dominio P se purificó usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El dominio P purificada se puede usar entonces para la cristalografía de rayos X. La selección de las condiciones de cristalización de proteínas es performó con los kits de detección disponibles comercialmente utilizando diferentes concentraciones de proteína de dominio P. El crecimiento de cristales se observa y se optimizan las condiciones más prometedores. Con los métodos descritos aquí, es posible pasar de gen a la proteína a la estructura en menos de cuatro semanas. Por lo tanto, nuestro método de expresión P dominio, purificación y cristalización es adecuado para estudiar la interacción norovirus huésped a nivel molecular y proporcionar datos importantes para ayudar en la detección de diseño y de drogas hasta a la fecha de la vacuna.

<table><tbody><tr><td>Dominio P DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthesis</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; vector</td><td>A petición</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Columna de Cromatografía Bio-Rad</td><td></td><td>7372512</td><td>2,5 x 10 cm, posible de usar otros tamaños</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarosa</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>varios</td><td>corte de 10 kDa, 30 kDa y 50 kDa utilizado</td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Químicamente competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Proteasa</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>Columna SEC</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>varios</td><td>4 cribas con cada 96 pocillos Hidratos de</td></tr><tr><td>carbono Dextra</td><td>Laboratories, Reino Unido</td><td>varios</td><td>productos del grupo sanguíneo</td></tr></tbody></table>

la producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em&gt; e. coli</em&gt; para la cristalografía de rayos x

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

La cápside norovirus se compone de una sola proteína estructural importante, denominado VP1. VP1 se subdivide en un (S) dominio shell y un dominio sobresaliente (P). El dominio S forma un andamio contigua alrededor del ARN viral, mientras que las formas de dominio P picos virales en el dominio S y contiene determinantes para la antigenicidad y las interacciones de la célula huésped. El dominio P se une estructuras de hidratos de carbono, es decir., Antígenos del grupo histo-sanguíneo, los cuales se cree que son importantes para las infecciones por norovirus. En este protocolo, se describe un método para la producción de alta calidad dominios norovirus P con altos rendimientos. Estas proteínas se pueden utilizar para la cristalografía de rayos X y ELISA con el fin de estudiar la antigenicidad y la de la célula huésped interacciones. El dominio P se clona en primer lugar en un vector de expresión y luego se expresa en bacterias. La proteína se purificó utilizando tres pasos que implican inmovilizados cromatografía de afinidad de iones metálicos y cromatografía de exclusión por tamaño. Enprincipio, es posible clonar, expresar, purificar y cristalizar proteínas en menos de cuatro semanas, lo que hace este protocolo un sistema rápido para el análisis de las cepas de norovirus de reciente aparición.

El esquema del protocolo descrito se representa en la Figura 1. El protocolo cubre 6 partes principales que incluyen la clonación del gen diana, expresión, una purificación de tres etapas, y la cristalización. La Figura 2 ilustra el diseño de la construcción de expresión (CE) y características del vector de expresión pMalc2x. La secuencia del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pMalc2x muestra de restricción y de la proteasa sitios de escisión. ...

A continuación, se describe un método para expresar y purificar el norovirus alta calidad que sobresale dominios (P) en E. coli para su uso en estudios de cristalografía de rayos X. Este método se puede aplicar a otros dominios calicivirus P, así como las proteínas no estructurales, es decir., La proteína viral unida al genoma (VPg), proteasa, y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp).

La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em&gt; E. coli</em&gt; Para la cristalografía de rayos X

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

El objetivo general del protocolo es la producción y purificación del dominio sobresaliente del norovirus humano en E.coli para obtener una proteína extremadamente pura destinada a la cristalografía de rayos X. Nuestro protocolo para la expresión, purificación y cristalización de proteínas es rápido, robusto y puede utilizarse tanto para proteínas estructurales como no estructurales. La ventaja de este protocolo es que nuestras proteínas son muy puras y pueden formar cristales capaces de difractar hasta alta resolución. Seg&uacute;n nuestra experiencia, es posible que el protocolo necesite ajustes para prote&iacute;nas menos solubles. Por ejemplo, se puede modificar el medio de cultivo o la temperatura de crecimiento durante la expresi&oacute;n de la prote&iacute;na. Para comenzar, transforme un microlitro del vector pMalc2x, que codifica para la prote&iacute;na de fusi&oacute;n MBP-His-P, en 15 microlitros de c&eacute;lulas competentes de E.coli BL21 utilizando un protocolo de transformaci&oacute;n est&aacute;ndar.Añada 600 microlitros de medio SOC a las células y crezca durante una hora a 37 grados Celsius. Subcultive las células transformadas en 120 mililitros de LB-ampicilina durante la noche a 160 rpm y 37 grados Celsius.Inocule nueve litros de LB-ampicilina con el subcultivo. Incube las células a 37 grados Celsius con una velocidad de agitación de 160 rpm hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 0,4 y 0,6. Posteriormente, reduzca la temperatura a 22 grados Celsius durante aproximadamente una hora.Es importante esperar hasta que la temperatura alcance 22 grados Celsius antes de inducir con una baja cantidad de IPTG para permitir la expresión de proteínas solubles. Induzca la expresión proteica con 0.66 milimolar de IPTG. Después de la inducción, cultive las células durante la noche a 22 grados Celsius.Recoger las células por centrifugación. Desechar el sobrenadante y congelar el sedimento celular a 20 grados Celsius. Preparar los tampones que se utilizan para los pasos de purificación de proteínas a partir de soluciones stock según se detalla en el protocolo del texto.Descongele el pellet celular del cultivo de nueve litros y disuélvalo en 150 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a cuatro grados Celsius. Somete la suspensión celular a sonicación tres veces durante dos minutos para romper las células. Centrifugue la suspensión celular sonicada para separar los restos celulares del sobrenadante que contiene la proteína de fusión MBP-His-P expresada.Recoger el sobrenadante y desechar el precipitado. Lavar y equilibrar una suspensión de 10 mililitros de perlas de agarosa con níquel-NTA con tampón de 10 milimolar de imidazol en una columna de cromatografía. Añadir las perlas de níquel equilibradas al sobrenadante que contiene la proteína de fusión MBP-His-P expresada e incubar durante 30 minutos a cuatro grados Celsius con rotación lenta.Después de la incubación, aplique toda la mezcla de perlas de níquel y proteína a una columna de cromatografía. Lave lentamente la columna con cinco volúmenes de columna (CV) de cada uno de los tampones de imidazol a 10 milimolares, 20 milimolares y 50 milimolares a cuatro grados Celsius. Eluya la proteína de fusión MBP-His-P mediante un tampón de imidazol a 250 milimolares a cuatro grados Celsius.Durante la elución, verifique la densidad óptica a 280 nanómetros para confirmar la elución de la proteína de fusión. Continúe con la elución hasta que la densidad óptica a 280 nanómetros disminuya aproximadamente a 0,1. Trabajando a cuatro grados Celsius, lave los perlas con una cantidad excesiva de tampón de 250 milimolar de imidazol, seguido de tampón de 10 milimolar de imidazol.Guarde las perlas para el segundo paso de purificación. Verifique la presencia de la proteína de fusión MBP-His-P mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, o SDS-PAGE, utilizando un gel de poliacrilamida al 12 %SDS. Luego, concentre la proteína de fusión MBP-His-P eluida hasta una concentración final de aproximadamente tres miligramos por mililitro.La cantidad de proteasa necesaria para escindir eficazmente el dominio MBP-His-P debe calcularse cuidadosamente. Depende de la cantidad total de proteína de fusión eluida y del resultado de la electroforesis en gel de SDS-PAGE. Escinda la proteína de fusión del dominio MBP-His-P con la proteasa HRV 3C durante la diálisis frente a dos litros de tampón con 10 milimolares de imidazol, durante la noche a cuatro grados Celsius.Dependiendo del volumen final de la proteína concentrada, realice la diálisis en una cinta dializadora o en un tubo de diálisis. Equilibre las perlas de níquel que se reservaron previamente en tampón de imidazol 10 milimolar. Incube la proteína dializada que contiene el dominio P escindido, la proteína MBP y la proteasa HRV con las perlas de níquel equilibradas durante 30 minutos a cuatro grados Celsius con rotación lenta.Aplique la mezcla de perlas de níquel a una columna y recoja el flujo inicial a cuatro grados Celsius. Este es el dominio P escindido. Mida la concentración de proteína a medida que sale de la columna hasta que la densidad óptica a 280 nanómetros alcance aproximadamente 0,1.El MBP-His debe permanecer unido a las perlas de níquel y el dominio P escindido se eluirá en el flujo directo. Verifique la presencia del dominio P escindido mediante SDS-PAGE con una gel al 12 % como antes. Después de concentrar el dominio P eluido a aproximadamente tres miligramos por mililitro, realice una diálisis durante la noche a cuatro grados Celsius frente al tampón de filtración en gel para la posterior purificación por cromatografía de exclusión por tamaño.Lave las bombas y tuberías del sistema de purificación por cromatografía líquida de alta eficacia y pre-equilibre la columna de cromatografía de exclusión por tamaño con tampón de filtración en gel. Inyecte el dominio P en la columna a un flujo de un mililitro por minuto, utilizando un superloop o bucle, según el volumen de la muestra concentrada. Una vez finalizada la inyección, aumente el flujo a 2,5 mililitros por minuto.A medida que aumenta la densidad óptica y el dominio P sale de la columna, recolecte fracciones de 1,5 mililitros. El dominio P generalmente se eluye como un dímero. Después de verificar las fracciones mediante SDS-PAGE con un gel al 12 %, reúna únicamente las fracciones más puras y concéntrelas hasta aproximadamente tres miligramos por mililitro y aproximadamente ocho miligramos por mililitro.Utilice el dominio P a aproximadamente tres miligramos por mililitro y ocho miligramos por mililitro para la cribado inicial de cristalización. Prepare al menos 100 microlitros del dominio P por concentración para los cribados iniciales con 384 condiciones de cribado disponibles comercialmente. Realice el cribado a 18 grados Celsius en formato de placa de 96 pocillos, donde el depósito contiene 100 microlitros de solución madre y una gota se compone de 0,2 microlitros de solución madre y 0,2 microlitros de proteína.Optimice las condiciones de cristalización exitosas utilizando placas de 15 pocillos que contienen tres filas. Utilice 500 microlitros de solución madre como volumen de depósito. Prepare la primera fila con solución madre al 100%.La segunda fila con 90% de solución madre y 10% de agua. Y la tercera fila con 80% de solución madre y 20% de agua. Preparar la gota colgante con un tamaño de gota de dos microlitros mezclando un volumen igual de proteína y solución madre.Utilice las condiciones de cristalización optimizadas para la co-cristalización del dominio P con ligandos. Prepare las placas como antes, pero en lugar de una gota de dos microlitros, configure gotas que contengan un microlitro de solución madre, un microlitro de proteína y un microlitro de ligando a una concentración de un miligramo por mililitro. Aquí se muestra un resultado representativo de SDS-PAGE, que indica la cantidad de proteína de fusión MBP-His-P eluida tras el primer paso de purificación, en el que la proteína de fusión MBP-His-P se purifica utilizando perlas de agarosa con níquel-NTA.Tras la separación del MBP-His del dominio P escindido, la cantidad de dominio P escindido eluido también se analiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Después del paso final de purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño, el cribado cristalográfico dio como resultado condiciones optimizadas para la cristalización. Aquí se muestra el patrón de difracción de un dominio sobresaliente.En principio, es posible clonar, expresar, purificar y cristalizar proteínas en menos de cuatro semanas, lo que convierte a este protocolo en un sistema rápido para analizar nuevas cepas emergentes de norovirus. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad es más importante que la cantidad. Debido a la alta calidad de los dominios P purificados, son adecuados estudios adicionales, incluyendo inmunización para la producción de anticuerpos, experimentos de RMN y estudios basados en ELISA.Además, el dominio P purificado puede utilizarse para la formación de complejos con fragmentos de anticuerpos y nanocuerpos. Después de ver este protocolo, debería tener una buena comprensión de cómo expresar y purificar dominios P de norovirus de alta calidad.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para localizar proteínas etiquetadas fluorescentemente en micrografías electrónicas. La fluorescencia se localiza primero mediante foto-activado microscopía de localización en secciones ultrafinas. Estas imágenes se alinean entonces a micrografías electrónicas de la misma sección.

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Fuente: Leuthold, M. M., et al. Producción de dominios sobresalientes de norovirus humanos en E. coli para cristalografía de rayos X. J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra la purificación del dominio P del norovirus humano recombinante mediante cromatografía de exclusión por tamaño, destacando la separación de la proteína diana de las impurezas de mayor y menor peso molecular en función de la accesibilidad diferencial de los poros. El proceso se monitorea mediante absorbancia UV y se...

Purificación de proteínas de dominio P recombinantes derivadas de bacterias de norovirus humanos

Este video muestra un ensayo para cuantificar las partículas similares al virus del norovirus humano (VLP) que se unen a las bacterias intestinales humanas. Las suspensiones bacterianas se mezclan con las VLP y se incuban para permitir la formación de complejos VLP-bacterias. A continuación, los complejos se marcan con anticuerpos específicos de VLP marcados con fluoróforos, seguidos de una visualización y cuantificación basadas en citometría de flujo para identificar el porcentaje de bacterias...

Un ensayo para cuantificar la unión de las VLP del norovirus humano a las bacterias intestinales

Este artículo describe la metodología de criomicroscopía electrónica, que se utiliza para obtener imágenes microscópicas de alta calidad de macromoléculas en su estado casi nativo. El método produce imágenes adecuadas para el procesamiento computarizado posterior utilizando el enfoque de partícula única, ideado para generar la reconstrucción 3D de una macromolécula.

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

β barril de 'jove_content', cumplen muchas funciones dentro de las membranas externas de las bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos. Aquí, esperamos aliviar un cuello de botella conocido en los estudios estructurales mediante la presentación de protocolos para la producción de OMP de β barril en cantidades suficientes para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Métodos de detección de rutina utilizando amplificación del genoma viral están limitados por su incapacidad para discriminar infecciosas de partículas no infecciosas. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para métodos alternativos facilitar la discriminación de las partículas infecciosas norovirus con aptámeros vinculante, dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.

Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.

Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo

Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.

Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Aprende a producir y purificar el dominio P del norovirus humano en E. coli para cristalografía de rayos X. Este protocolo rápido genera proteína altamente pura en menos de cuatro semanas.

La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos

Explorar más videos