Name: Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana mediante centrifugación en gradiente de densidad para estudiar su papel en la sensibilidad de células linfomatosas a agentes terapéuticos. Este método permite obtener poblaciones celulares puras sin alterar su función.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (INCa-DGOS-4664).

1. Aislamiento de neutrófilos y co-cultivo con células leucémicas primarias NOTA: Los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Lyon con todos los pacientes que firman el consentimiento informado. <ol><li> El aislamiento de las células leucémicas primarias y neutrófilos <ol><li> Recoger tubos de sangre periférica en EDTA (1,8 mg EDTA por mililitro de sangre) de los pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica (CLL). </li><li> Añadir cada 15 ml de sangre a un tubo estéril de 50 ml y se diluye con 15 ml de RPMI (dilución 1: 1), luego, con cuidado y se añade lentamente 15 ml de una solución de gradiente de densidad para la parte inferior del tubo sin mezclar las fases. Asegúrese de que la solución de gradiente de densidad es a TA durante la preparación. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 35 min a TA y sin freno. La sangre se debe separar en cuatro fases distintas, como se muestra en la Figura 1A, de arriba abajo: las plaquetas y el plasma, las células mononucleares (wanillo hite), solución de gradiente de densidad, los granulocitos y eritrocitos. </li><li> Recuperar el anillo blanco que representa las células leucémicas primarias con una pipeta de plástico Pasteur y traslado a un nuevo tubo de 50 ml. <ol><li> Llenar el tubo con PBS (contiene calcio y magnesio) hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA. </li><li> Resuspender el precipitado con 5 ml de PBS y luego añadir PBS hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA. </li><li> Resuspender el precipitado con medio completo RPMI (RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) para contar usando un contador de la viabilidad celular. </li></ol></li><li> Aspirar las fases superiores que salen de la fase de granulocitos y eritrocitos y añadir PBS hasta 25 ml, añadir 3% de dextrano en el 0,9% NaClup a 50 ml en total. Mezclar los tubos 10 veces y conservar durante 30 min a TA sin mezclar. </li><li> Recoger el RBC-pobres una capa superior de neutrófilosd colocarlos en un tubo estéril de 50 ml limpio y centrifugar los tubos a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender cada sedimento con 5 ml de PBS a continuación, añadir tampón de lisis de glóbulos rojos de hasta 50 ml en total. </li><li> Mantener los tubos en la oscuridad durante 15 min a RT y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA. Lavar los pellets con PBS (PBS añadir hasta 50 ml en total) y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA. </li><li> Resuspender los pellets con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular. Mantenga 3 x 10 5 de cada tipo de células en 50 l de PBS-FBS (4%) en 5 ml de tubos de plástico para determinar la pureza de su aislamiento mediante citometría de flujo. </li></ol></li><li> Analizar las apariencias morfológicas de las poblaciones de células aisladas <ol><li> Para ello, resuspender cada 3 x 10 4 neutrófilos y 3 x 10 4 células mononucleares en 150 l de medio completo RPMI. Montar las placas de vidrio, tarjetas de filtros y cámaras de muestra en la centrífuga cytospin, asegurando que tque centrifugar está bien equilibrado. </li><li> Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 750 xg durante 10 min a TA Eliminar las diapositivas, tarjetas de filtro, y cámaras de muestra de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra. </li><li> Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X. </li></ol></li><li> Prueba de la pureza de las células aisladas por FACS <ol><li> Identificar a las células leucémicas primarias aisladas con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Etiquetar los neutrófilos purificados con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que se enumeran en la Tabla 1 (5 l / 10 6 células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C </li><li> Se lavan las células con 500 l de PBS-FBS (4%) de la centrífuga los tubos a 300 g durante 5 min a TA. </li><li>Resuspender cada sedimento en 200 l de PBS-FBS (4%). </li><li> El análisis en un citómetro de flujo utilizando la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm láser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Garantizar la compensación de color. </li></ol></li><li> Co-cultivo de las células leucémicas primarias con autólogo de neutrófilos <ol><li> Seed 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primarias solo o con neutrófilos autólogas en relación 1:10 en medio completo RPMI. Para ello, puede ajustar el número de células por dilución de las suspensiones de células y añadir 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primarias de 2 x 10 6 células / ml neutrófilos. Mezclar con cuidado. </li><li> Añadir 25 M de inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (Btk) (ibrutinib) a las células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li></ol></li><li> Cell Cosecha y Análisis FACS <ol><li> Collect las células en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Lavar los pellets con 1 ml de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. </li><li> pellets de resuspender en Anexina V y PI utilizando kit comercial e incubar las células en oscuridad durante 10 min a TA. El análisis en un citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 2A y la siguiente configuración óptica: láser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantizar la compensación de color. </li></ol></li></ol> 2. La diferenciación de células HL60 a lo largo del Camino granulocítica y su Coculture con RL linfoma de células B en modelo 3D <ol><li> La diferenciación de promielocítica humana (HL60) células en células similares a los neutrófilos <ol><li> Ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml a continuación, añadir 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO para inducir su diferenciación. Semillas cada 3 x 10 5 </sarriba&gt; células HL60 por pocillo en placas de 48 pocillos a continuación se incuban durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Más tarde, recoger las células y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular. </li><li> A continuación diluir la suspensión de células en medio RPMI completo para ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml y de nuevo inducir su diferenciación mediante la adición de 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO. Semillas cada 3 x 10 5 HL60 células por pocillo en placa de 48 pocillos y se incuba durante otras 48 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Análisis de la diferenciación de HL60 (HL60 diff) <ol><li> Recoger las células y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado con medio completo RPMI para el recuento usando un contador de la viabilidad celular. </li><li> Para analizar los cambios en la expresión de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo. Coloque cada 3 x 10 5 </sup&gt; células indiferenciadas HL60 (de cultivo celular) y 3 x 10 5 células HL60 diff en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender los sedimentos en 50 l de PBS-FBS (4%). Marcar las células con CD11b anti-humano conjugado con AF700 o CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C </li><li> Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender los sedimentos en 200 l de PBS-FBS (4%). </li><li> Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 3A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm láser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Para probar los cambios morfológicos en diff HL60, inmovilizar las células en portaobjetos de vidrio para el examen microscópico. <ol><li> Para ello, resuspender cada 3 x 10 <sup&gt; 4 células indiferenciadas HL60 (de cultivo celular) y 3 x 10 4 HL60 diff en 150 l de medio completo RPMI. Montar las placas de vidrio, tarjetas de filtro, y cámaras de muestra en la centrífuga cytospin, asegurándose de que la centrífuga está equilibrado. </li><li> Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 1500 rpm durante 10 min a TA. Retire las transparencias, tarjetas de filtros y cámaras de muestras de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra. </li><li> Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X. </li></ol></li></ol></li><li> 3 dimensiones (3D) Cultura NOTA: Asegúrese de que los materiales utilizados en este experimento son fríos y el experimento se está llevando a cabo en el hielo. <ol><li> Resuspender cada 5 x 10 4 células RL, ya sea solo o mezclado con diff HL60 </em&gt; En relación RL: HL60 diff 01:10, con 300 l de la matriz de la membrana basal usando punta de la pipeta 1 ml cortar con una tijera estéril con el fin de ensanchar la abertura a aproximadamente 2 a 3 mm. Evitar las burbujas durante este paso. </li><li> Sembrar cada 300 l de suspensión de células / pocillo en placas de 24 pocillos. Evitar las burbujas durante este paso. Incubar la placa durante 30 min a 37 ° C con 5% de CO 2 a continuación, añadir 1 ml de medio completo RPMI para cada pocillo e incubar durante 7 días a 37 ° C con 5% de CO 2. Cambiar el medio cada dos días. Añadir 10 nM vincristina en el día 5. </li></ol></li><li> Análisis FACS <ol><li> Después de 7 días de cultivo, se aspira el medio y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS enfriado con hielo dos veces. Añadir 3 ml / pocillo de PBS enfriado en hielo-EDTA (5 mM). Separar el gel de la parte inferior del pozo por raspado utilizando la parte inferior de la punta de pipeta 200 l. Agitar suavemente la placa sobre hielo durante 30 min. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo estéril de 15 ml y agitar los tubos suavemente sobre ice durante otros 30 min. Comprobar la aparición de suspensión celular homogénea. (Si no es el caso, entonces agitar las células durante más tiempo o añadir más PBS-EDTA). </li><li> Centrifugar los tubos a 300 xg durante 10 min a TA. Se lavan los gránulos con PBS y centrifugar a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender con PBS-FBS (4%) y la etiqueta con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con PE-Cy7 y el anticuerpo CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Incubar en oscuridad durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%), entonces los tubos de centrífuga a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con anexina V y PI utilizando el kit comercial. </li><li> Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 4A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm láser: APC (660/20 BP). Garantizar la compensación de color. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem.+Z.+F%C3%BCrKlin.+Chem.+Klin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li>
<li>Aynaud, M. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li>
<li>Ziòłkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li>
<li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li>
<li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc%CE%B3RIIIB+and+Mac-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Baltim.Md+1950%22%5BJournal%5D)">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li>
<li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606(2012).</li>
<li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advance%3A+autofluorescence-based+sorting%3A+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586(2013).</li>
<li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li>
<li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22ActaHaematol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li>
<li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li>
<li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%3A+Their+contributions+to+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li>
<li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+Neutrophils%2C+and+Cancer%3A+A+Double+Edged+Sword%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940(2014).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li>
<li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment%3A+role+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res+Off+J+Am+Assoc+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li>
<li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer+Oxf.Engl+1990%22%5BJournal%5D)">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí, un protocolo eficaz, sencillo, rápido y de bajo costo para el aislamiento de los neutrófilos de la sangre humana con alta pureza utilizando el enfoque de la centrifugación en gradiente de densidad y dentro de las mismas células mononucleares de paso también se separan y se recupera. Las poblaciones de células aisladas son ≥90% de pureza. Hay varios métodos disponibles para el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana. Estos incluyen métodos similares utilizando gradien...

Células inmunes innatas constituyen una proporción esencial de las células dentro del microambiente del tumor y se han asociado con la malignidad del tumor en pacientes y modelos animales de cáncer 1. Recientemente, se ha vuelto más ampliamente apreciado que las respuestas inmunes crónicas desempeñan papeles críticos en la promoción de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a quimioterapias 2. Los macrófagos son importantes células inmunitarias innatas que se han demostrado para regular directamente la respuesta de las células tumorales a la quimioterapia 3,4. Sin embargo, el papel de los neutrófilos, los actores clave en el sistema inmunitario innato, en la regulación de la respuesta del tumor al tratamiento contra el cáncer no se conoce. Los objetivos de estos protocolos son el uso de un método rápido y fiable para separar los neutrófilos de muestras de sangre CLL del paciente y para diferenciar las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica con el fin de estudiar su papel en la regulación de la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes anti-linfoma. 5 y actuar como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores 6. Los neutrófilos tienen un papel esencial en el aumento de la respuesta inmune innata eficaces, además de las funciones efectoras variables en varias condiciones patológicas 7. Por lo tanto, un método rápido y fiable para aislar los neutrófilos de otras células sanguíneas, tales como método de separación en gradiente de densidad, se requiere para los estudios in vitro. El uso de este método para el aislamiento de neutrófilos facilitará aún más la investigación sobre las funciones inmunológicas mediada por neutrófilos in vivo y ex vivo. La capacidad de obtener poblaciones puras de los neutrófilos es un primer paso importante para la investigación de los pacientes con enfermedades inmunológicas 8. método de separación en gradiente de densidad es una técnica ideal en el que se obtiene un alto rendimiento de las células. el method implica la adición de la solución de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo que contiene la sangre humana diluido seguido de centrifugación a 300 g durante 35 min sin descanso. El anillo de las células mononucleares aparece en la interfase y los neutrófilos residen por debajo de la primera. Este método tiene ventajas significativas con respecto a otros métodos disponibles, tales como kits de aislamiento de neutrófilos, que son mucho más caros 9. Además, el aislamiento de los neutrófilos de sangre humana por kits comerciales que utilizan anticuerpos dirigidos a un marcador de superficie específico para los neutrófilos humanos, aumentar el riesgo de activación o diferenciación celular. método de separación en gradiente de densidad permite el aislamiento de neutrófilos dentro de un corto período de tiempo. Dentro del mismo paso, también se separan y se recuperan las células mononucleares. Es una técnica fundamental en la que se obtiene un alto rendimiento de células puras a fin de lograr la integridad funcional. Con el fin de imitar la microenv tumorironment, se realizaron experimentos en 3D. Dada la corta vida media de los neutrófilos in vitro, los experimentos en 3D con los neutrófilos humanos frescos no son concluyentes. Por esta razón, se inducen las células HL60 promielocítica () para diferenciarse en células de neutrófilos como el uso de los inductores de la diferenciación dimetilsulfóxido (DMSO) y el ácido retinoico (RA). El uso de células HL60 diferenciadas (HL60) diff evitará tener diferentes respuestas de los neutrófilos debido al aislamiento de diferentes donantes. En 3D vitro modelos de cultivo representan una etapa intermedia entre modelos 2D in vitro y en modelos in vivo. En la cultura 2D, las células se extienden sobre una superficie de plástico que forma los archivos adjuntos de células no naturales a las proteínas depositadas que se desnaturalizan en esta superficie sintética. Por el contrario, las células en forma de cultivo 3D adjuntos célula-célula natural, ya que las células y la matriz extracelular que sintetizan son el material natural a los que están unidos.Por esta razón, los modelos 3D de co-cultivo, especialmente entre las células cancerosas y otros tipos de células, han sido muy útiles para indicar su contribución al crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis. Como resultado, los cultivos 3D hacen que el cultivo de células de imitar las condiciones fisiológicas que existen in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS contiene calcio y magnesio)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-alanil-L-glutamina (L-Glutamina)</td><td>Life technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina (Pen Strep)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la tirosina quinasa (Btk) de Bruton (Ibrutinib)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristina&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matriz de membrana basal&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Poner a 4 oC durante la noche (O/N) antes del día del experimento</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción V-FLOUS anexado&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988 y nbsp; 549 y semejanzas; 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit RAL 555 Modificado kit de tinción Giemsa</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII citometría de flujo BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Auto T4 Contador de viabilidad celular</td><td>Nexcelom&nbsp; Biociencia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Los neutrófilos son el tipo de glóbulos blancos más abundante (40% a 75%) y se encuentran entre las primeras células inflamatorias en migrar hacia el sitio de la inflamación. Son actores clave en el sistema inmunitario innato y desempeñan un papel importante en la biología del cáncer. Los neutrófilos han sido propuestos como mediadores clave de la transformación maligna, la progresión tumoral, la angiogénesis y en la modulación de la inmunidad antitumoral; a través de su liberación de factores solubles o su interacción con las células tumorales. Para caracterizar las funciones específicas de los neutrófilos, se codicia un método rápido y fiable para el aislamiento in vitro de neutrófilos de la sangre humana. Aquí, se demuestra un método de separación en gradiente de densidad para aislar neutrófilos y células mononucleares de la sangre. El procedimiento consiste en colocar cuidadosamente la solución de gradiente de densidad como Ficoll sobre la sangre diluida obtenida de pacientes diagnosticados de leucemia linfocítica crónica (LLC), seguida de centrifugación, aislamiento de la capa mononuclear, separación de los neutrófilos de los glóbulos rojos por dextrano y luego lisis de los eritrocitos residuales. Se ha demostrado que este método aísla neutrófilos ≥ un 90 % de pureza. Para imitar el microambiente tumoral, se realizaron experimentos tridimensionales (3D) utilizando matriz de membrana basal como Matrigel. Dada la corta vida media de los neutrófilos in vitro, no se pueden realizar experimentos en 3D con neutrófilos humanos frescos. Por esta razón, las células promielocíticas HL60 se diferencian a lo largo de la vía granulocítica utilizando los inductores de diferenciación dimetilsulfóxido (DMSO) y ácido retinoico (AR). El objetivo de nuestros experimentos es estudiar el papel de los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfoma. Sin embargo, estos métodos se pueden generalizar para estudiar las interacciones de los neutrófilos o células similares a los neutrófilos con una amplia gama de tipos de células en diferentes situaciones.

Método de separación en gradiente de densidad descrito aquí proporciona células leucémicas primarias y neutrófilos no estimulados aisladas de la sangre de pacientes con LLC Figura 1A representa las diferentes capas de la sangre obtenidos después de centrifugación en gradiente de densidad (de arriba a abajo:. Plaquetas y plasma, anillo blanco representa las células mononucleares, gradiente de densidad de la solución, granulocitos y eritrocitos). Figura 1B y 1C</st...

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

El objetivo general de estos procedimientos es aislar rápidamente neutrófilos altamente purificados a partir de muestras de sangre humana mediante centrifugación en gradiente de densidad, para investigar su papel en la sensibilidad de las células linfomatosas a la terapia contra el cáncer, utilizando modelos de cultivo celular en dos y tres dimensiones. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones entre el sistema inmunitario innato y el cáncer, como por ejemplo qué papel desempeñan las respuestas de las células tumorales mediadas por neutrófilos en la terapia contra el cáncer. La principal ventaja de la separación en gradiente de densidad es la capacidad de aislar poblaciones puras de células inmunitarias en un corto período de tiempo, sin exponer las células a estímulos que alteren su función.Para aislar las células leucémicas primarias y los neutrófilos, comience agregando 15 mililitros de sangre tratada con EDTA proveniente de muestras de pacientes con leucemia linfocítica crónica en tubos estériles individuales de 50 mililitros. Diluya la sangre con 15 mililitros de RPMI. Luego, agregue cuidadosa y lentamente 15 mililitros de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente debajo de la sangre, teniendo cuidado de no mezclar las capas.Después de separar las células mediante centrifugación, serán visibles cuatro fases distintas. Las plaquetas y el plasma en la parte superior, un anillo blanco de células mononucleares, la solución de gradiente de densidad y los granulocitos y eritrocitos en la parte inferior. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico, primero transfiera el anillo blanco de células leucémicas primarias a un nuevo tubo de 50 mililitros.Lave las células con hasta 50 mililitros de PBS con calcio y magnesio. Y re-suspenda el paladar en cinco mililitros de PBS fresco. A continuación, agregue 45 mililitros adicionales de PBS a las células y centrifugue nuevamente las células.Después del segundo lavado, re-suspenda el paquete celular en medio RPMI completo y cuente el número de células leucémicas primarias viables. A continuación, retire las capas de plasma plaquetario y del gradiente de densidad, y agregue 25 mililitros de PBS y 25 mililitros de Dextrina en cloruro de sodio a la fase de granulocitos-eritrocitos.Mezcle los tubos diez veces mediante inversión. Luego, deje que las células sedimenten durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al finalizar la equilibración, transfiera la capa superior pobre en glóbulos rojos y rica en neutrófilos a un tubo estéril de 50 mililitros y centrifugue las células.Re_suspenda el paladar en cinco mililitros de PBS y lisee los glóbulos rojos con 45 mililitros de tampón de lisis de células rojas. Después de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, centrifugue nuevamente las células y lave el paladar con 50 mililitros de PBS. Al final del lavado, re_suspenda las células en medio RPMI completo y cuente el número de neutrófilos viables.Diluya ambos grupos de células hasta una concentración de 300.000 células por 50 microlitros de RPMI y divida las muestras entre el número adecuado de tubos FACS de cinco mililitros. Tras la centrifugación, re suspenda los pellets en 50 microlitros de PBS suplementado con suero bovino fetal. Para determinar la pureza de los subconjuntos celulares aislados, marque el alícuota de células leucémicas primarias con el anticuerpo anti-CD19 humano conjugado con APC y el alícuota de neutrófilos purificados con una mezcla de anticuerpos anti-humanos según se indica en la tabla, durante 30 minutos a oscuras y a cuatro grados centígrados.Al finalizar la incubación, lave las células con 500 microlitros de PBS suplementado con FBS y resuspenda los paladares en 200 microlitros de PBS fresco con FBS. Luego, analice la pureza de las poblaciones celulares mediante citometría de flujo, teniendo cuidado de realizar la compensación de color en las muestras. Para co-cultivar las células leucémicas primarias con los neutrófilos autólogos, siembre 200.000 células por mililitro de células leucémicas solas o con neutrófilos autólogos en una placa de 24 pocillos con medio RPMI completo.Mezcle cuidadosamente las células. Luego trate las células con el inhibidor de tirosina cinasa Brutton durante 24 horas a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO₂. Al día siguiente, recoja una alícuota de las células en un tubo de plástico de cinco mililitros.Luego, centrifugar las células y lavar los pellets con un mililitro de PBS con FBS. Después de la segunda centrifugación, etiquetar las células con anexina V y yoduro de propidio según las instrucciones del fabricante durante diez minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, analizar los neutrófilos y las células leucémicas primarias mediante citometría de flujo utilizando la estrategia de selección ilustrada.Para establecer un cultivo co-cultivo tridimensional, agregue 50.000 células B linfoma RL solas o mezcladas con células HL60 diferenciadas en tubos estériles de 15 mililitros. Centrifugue las muestras y re suspenda los pellets en 300 microlitros de matriz de membrana basal, utilizando una punta de pipeta de un milímetro con la abertura cortada de dos a tres milímetros. A continuación, incube 300 microlitros de las células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos durante 30 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO₂.Al finalizar la incubación, agregue un mililitro de medio RPMI completo a cada pocillo y regrese los cultivos tridimensionales al incubador durante otros siete días, con cambios de medio cada dos días. El día cinco, agregue diez nanomoles de incristina a los cultivos. Después de una semana de cultivo, aspire el medio y lave cada pocillo dos veces con un mililitro de PBS frío.Luego, agregue tres mililitros de PBS frío con EDTA a cada pocillo y raspe el fondo de los pocillos con la punta de una pipeta de 200 microlitros para desprender los geles. Agite suavemente la placa sobre hielo durante 30 minutos. Luego, transfiera las suspensiones celulares a tubos estériles individuales de 15 mililitros para agitar suavemente sobre hielo durante otros 30 minutos.Confirme la aparición de una suspensión celular homogénea. Luego, centrifugue las células, realice un lavado con PBS y resuspenda los pellet en PBS fresco con FBS. Finalmente, marque las células con los anticuerpos y colorantes de viabilidad apropiados tal como se acaba de demostrar, y analice las células diferenciadas RL y HL60 mediante citometría de flujo utilizando la estrategia de selección de eventos ilustrada.El análisis de todos los eventos de las poblaciones celulares aisladas mediante citometría de flujo demuestra que este método de separación da como resultado una población altamente pura de células leucémicas primarias con un solo pico que expresa CD19. Y una población de neutrófilos con pureza superior al 90 %, positiva para los antígenos comunes de leucocitos CD45, y los antígenos CD15 y CD16 expresados por neutrófilos maduros. Al delimitar las células leucémicas primarias procedentes de cultivos co-cultivos con neutrófilos, se observa que los neutrófilos ejercen un efecto protector sobre la supervivencia celular frente al inhibidor de tirosina quinasa ibrutinib, con un número significativamente mayor de células leucémicas primarias viables en comparación con el cultivo de células leucémicas primarias por separado.Las células HL60 diferenciadas son más estables en cultivos tridimensionales que los neutrófilos. Tras la inducción de su desarrollo granulocítico, estas células son más pequeñas que las células HL60 no diferenciadas y expresan niveles más altos de CD11B y CD38. Las células HL60 diferenciadas también presentan núcleos multilobulados.Estas células exhiben un efecto protector sobre las células RL, con un número significativamente mayor de células RL viables en los cultivos tridimensionales tras el tratamiento con vincristina en comparación con las células linfomatosas tratadas con vincristina cultivadas de forma aislada. Una vez dominado, el método de centrifugación en gradiente de densidad puede completarse en 90 minutos. Tras su desarrollo, estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran el impacto de diversos tipos de glóbulos blancos sobre la malignidad tumoral en modelos preclínicos y muestras de pacientes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar rápidamente y de forma confiable las células mononucleares y los neutrófilos, analizar el efecto de los neutrófilos en la mediación de las respuestas de las células tumorales frente a agentes anticancerígenos, y establecer un cultivo co-tridimensional.

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos el aislamiento de neutrófilos citotóxicos de alta densidad y neutrófilos de baja densidad de la sangre de un ratón portador de tumores mediante centrifugación discontinua en gradiente de sacarosa.

Aislamiento de neutrófilos citotóxicos a partir de sangre de ratón portadora de tumores

Este video muestra un ensayo que investiga el papel de las células similares a los neutrófilos en la protección de las células de linfoma contra la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos. Se establece un cocultivo en 3D, que consiste en linfoma y células similares a los neutrófilos, y se expone a la vincristina, un medicamento de quimioterapia. El contacto directo con las células similares a los neutrófilos induce una regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas en las células...

Determinación de la función de las células similares a los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a un fármaco de prueba

Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados ​​diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.

Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

El protocolo descrito aquí representa un método fácil y reproducible que emplea cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para medir el metabolismo de las purinas en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) cultivadas en diferentes condiciones.

Ensayo basado en HPLC para supervisar extracelular de nucleótidos / nucleósidos de metabolismo en las células de la leucemia crónica humana linfocítica

Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Aquí, proporcionamos un enfoque confiable para aislar neutrófilos de densidad baja y normal de la sangre total utilizando aislamiento magnético (selección negativa) y medio de gradiente de densidad discontinuo. Garantiza el aislamiento intacto de las células de alta pureza (≥93%), lo que facilita el análisis preciso de las subpoblaciones de neutrófilos, crucial para comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.

Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana mediante centrifugación en gradiente de densidad para estudiar su papel en la sensibilidad de células linfomatosas a agentes terapéuticos. Este método permite obtener poblaciones celulares puras sin alterar su función.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Explorar más videos