Name: La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a realizar perfusión forzada de pulmones en ratas y ratones para recolectar selectivamente leucocitos marginando-pulmonares. Este método permite estudiar sus funciones inmunológicas únicas en la biología pulmonar.

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Los autores y este trabajo fueron apoyados por NIH / NCI subvención # R01CA172138 (a SBE).

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv. 1. Protocolo de rata <ol><li> Preparativos <ol><li> Organizar 2 mariposa 21 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 21 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja. </li><li> Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco). </li><li> Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Utilizar a temperatura ambiente. 35 ml es el volumen mínimo necesario por animal. </li><li> Transmitir heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire. </li></ol></li><li> La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos <ol><li> La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración. </li><li> Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides. </li><li> Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar. </li><li> Insertar una aguja de mariposa en el ventrículo derecho del corazón, y dentro de aproximadamente un minuto recoger el máximo volumen de sangre en una jeringa (~ 6 ml de un animal de 250 g). </li><li> Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión). </li><li> Mantenga la aguja mariposa dentro del ventrículo derecho, mientras que la sustitución de la jeringa que contiene la sangre con el tubo de salida de la peristaltic bomba. </li><li> Inserte una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 5 ml en el ventrículo izquierdo, evitando la penetración del septo interventricular. </li><li> Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min y recoger suavemente en la jeringa los primeros mililitros de líquido de perfusión que están contaminadas con sangre. Continuar hasta que el color se vuelve líquido de perfusión de oscuro a rojo pálido. (Descartar el perfuste contaminada con sangre). </li><li> Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml cosecha y recoger 20 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 7 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío. </li><li> Cese el flujo de la bomba peristáltica. </li></ol></li><li> Extracción leucocitos <ol><li> Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Aspirar el líquido. </li><li>Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso dos veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra. </li><li> Añadir 20 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido. </li><li> Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Protocolo de ratón <ol><li> Preparativos <ol><li> Organizar 2 mariposa 25 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 25 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja. </li><li> Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco). </li><li> Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución de 1x PBS. Utilizar a temperatura ambiente. 25 ml es el volumen mínimo necesario por animal. </li><li> Stream heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire. </li></ol></li><li> La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos <ol><li> La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración. </li><li> Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides. </li><li> Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar. </li><li> Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión). </li><li> Insertar una aguja de mariposa conectada a la tubería de salida de la bomba peristáltica a la derecha ventricle del corazón, y una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 2 ml en el ventrículo izquierdo del corazón, avoidingpenetration del tabique interventricular. </li><li> Encienda la bomba a una velocidad de aproximadamente 2 ml / min y recoger los primeros ml de líquido de perfusión contaminada con sangre en la jeringa de recolección hasta que el líquido de perfusión se convierte de oscuro a rojo pálido (Descartar el perfuste contaminada con sangre). </li><li> Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 2 ml con una jeringa de 10 ml de cosecha y recoger 10 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío. </li><li> Cese el flujo de la bomba peristáltica. </li></ol></li><li> Extracción leucocitos <ol><li> Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Aspirar el líquido. </li><li> Añadir 10 ml de PBS o medio de centrifugación a 400,xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso tres veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra. </li><li> Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido. </li><li> Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado en este documento permite la recogida selectiva y el estudio de la población única de MP-leucocitos. En comparación con los leucocitos esplénicos o circulante, la población MP se caracteriza por una composición distinta de subpoblaciones de leucocitos, los niveles de activación más altos, mayor liberación de varias citoquinas, y más altos niveles de ARNm de pro- y citocinas antiinflamatorias 2,3. Específicamente, hemos demostrado que las células MP-NK son más citotóxicos que las células N...

Los leucocitos se adhieren a los capilares de los pulmones (es decir, marginando-pulmonar (MP) leucocitos) 1 se mostraron para exhibir composición de leucocitos distinto y actividad única en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunes (por ejemplo, la circulación, el bazo, la médula ósea) 2- 4. Por ejemplo, exhiben MP-leucocitos superior natural killer (NK) citotoxicidad frente a varias células tumorales, en comparación con circulantes y esplénicas células NK, así como los niveles diferenciados de ARN mensajero (ARNm) y aumento de la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias. La composición de células también se diferencia de leucocitos circulantes como MP-leucocitos tienen una relación más alta de la inmunidad innata / adaptativa en comparación con los leucocitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de MP-leucocitos, con el fin de estudiar este compartimiento inmune importante y única (población de células), y para elucidate el impacto de las diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas. Para comprender el significado de esta población única, es importante tener en cuenta que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual circula a través de las funciones in vivo de la inmunidad mediada por células (CMI). Esta capacidad es evidente a pesar del fracaso precedente del sistema inmunológico para controlar el tumor primario, y apoyado por amplia en pruebas in vivo en pacientes con cáncer y en modelos animales 5. Es importante destacar que estos resultados son a menudo incompatibles con los estudios in vitro y ex vivo, que informan que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación de leucocitos en muestras de sangre de seres humanos y animales (medido por ensayos de citotoxicidad) 6,7. Esta discrepancia puede ser atribuida a la existencia in vivo de poblaciones de leucocitos distintos, tales como los antesmencionada población de leucocitos MP, y concretamente su subpoblación de células NK activadas 3. De hecho, las células tumorales (singénicos MADB106), que se encontraron ser resistente a la circulación y leucocitos esplénicos, se demostró que la lisis por las células NK MP-3,8. Por lo tanto, las células supuestamente &#39;NK-resistentes&#39; MADB106 que hacen metástasis a los pulmones de fischer344 ratas (F344) están controlados por las células MP-NK, pero no por las células NK esplénicas, que comúnmente se estudian dada su facilidad de acceso o circulante. Purificado y activos MP-leucocitos son inaccesibles a través de los métodos de cosecha estándar de leucocitos de los pulmones, que se basan en la molienda tejido pulmonar o la degradación biológica 9. Nuestro enfoque tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques de procesamiento de tejidos. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente MP-leucocitos, separándolas de otras células que se originan en el parénquima pulmonar, intersticial, y compar bronco-alveolartments. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor conserva la integridad y el medio fisiológico de MP-leucocitos, a diferencia de la molienda y el procesamiento biológico se acerca que dañan las células, alterar su morfología, e inducen la producción y liberación de diversos factores que modulan la actividad inmune y específicamente suprimen NK 10 citotoxicidad. Los pulmones son un órgano principal objetivo para la metástasis del cáncer y para diversas enfermedades infecciosas. Todas las células malignas circulantes y células infectadas pasan a través de los capilares pulmonares, donde tienen que deformarse e interactuar con las células endoteliales de los capilares y leucocitos residentes. En estas condiciones, las células circulantes pueden ser fácilmente dirigidos por residentes MP-leucocitos. Por tanto, parece biológicamente ventajoso tener leucocitos activados en este compartimiento inmune, y es importante para estudiar este MP-población única en diferentes entornos biológicos, experimentales y clínicos. Es digno de notar que syactivación stemic inmune por varias-respuesta modificadores biológicos (por ejemplo, ácido poliinosínico-policitidílico (poli I: C) o oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) han demostrado para activar MP-leucocitos más de leucocitos circulantes 3, 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Bomba</td><td></td><td></td><td></td>peristáltica</tr><tr><td>Aguja de mariposa</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Aguja de mariposa</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4"</td></tr> <tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de borde romo<td>Tijeras</td></tr><tr><td>hemostático</td> Pinza de tejido Heparina sódica mucosa porcina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(sin conservantes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Los leucocitos pulmonares marginadores (MP) son leucocitos que se adhieren al endotelio interno de los capilares pulmonares. Se demostró que los leucocitos MP exhiben una composición y características únicas en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunitarios. La evidencia sugiere una mayor citotoxicidad de las células asesinas naturales y un perfil proinflamatorio y antiinflamatorio distinto de la población de leucocitos MP en comparación con los inmunocitos circulantes o esplénicos. El método presentado en este trabajo permite la recolección selectiva de leucocitos MP por perfusión forzada de los pulmones en ratones o ratas. A diferencia de otros métodos utilizados para extraer leucocitos pulmonares, como la molienda de tejidos y la degradación biológica, este método produce exclusivamente leucocitos de los capilares pulmonares, no contaminados con células parenquimatosas, intersticiales y broncoalveolares. Además, la técnica de perfusión preserva mejor la integridad y el entorno fisiológico de los leucocitos MP, sin inducir respuestas fisiológicas debidas al procesamiento de los tejidos. Esta población única de leucocitos MP está estratégicamente ubicada para identificar y reaccionar ante las células circulantes anormales, ya que todas las células malignas circulantes y las células infectadas se detienen mientras pasan a través de los capilares pulmonares, interactuando físicamente con las células endoteliales y los leucocitos residentes. Por lo tanto, la recolección selectiva de leucocitos MP y su estudio en diversas condiciones pueden avanzar en nuestra comprensión de su importancia biológica y clínica, específicamente con respecto al control de las células aberrantes circulantes y las enfermedades relacionadas con los pulmones.

La exposición MP-compartimiento de una composición de leucocitos subconjunto diferente en comparación con los leucocitos circulantes. Utilizando el análisis de citometría de flujo, se identificaron y se cuantificaron las subpoblaciones de leucocitos para caracterizar la composición de ambos leucocitos circulantes y MP. Granulocitos y linfocitos fueron identificados en base a primero y la cara dispersa. Dentro de los linfocitos, se identificaron NKRP-1 células brillantes como l...

Los leucocitos pulmonares marginadores exhiben características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. En este trabajo describimos la recolección selectiva de esta subpoblación de leucocitos pulmonares, mediante perfusión forzada de los pulmones en ratas y ratones. Los leucocitos pulmonares marginadores parecen ser fundamentales para determinar la susceptibilidad a las enfermedades transmitidas por la sangre y relacionadas con los pulmones.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

El objetivo general de este procedimiento es forzar la perfusión de pulmones de ratón o rata para la recolección selectiva de leucocitos pulmonares marginales, que se adhieren al endotelio interno de los capilares pulmonares. Este método permite el estudio de esta población específica de leucocitos, que presenta características únicas y funciones hematológicas distintas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona leucocitos exclusivamente de los capilares pulmonares, excluyendo células de los compartimentos parenquimatoso, intersticial y broncoalveolar.Realizando este procedimiento estarán Liat Sorski y Lee Shaashua, dos estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, haga pasar PBS heparinizado a través de las líneas de la bomba peristáltica y las agujas tipo mariposa para eliminar cualquier burbuja de aire. Luego, inmediatamente después de la cesación de la respiración, utilice tijeras estériles y pinzas de tejido dental para abrir las cavidades peritoneal y torácica de la rata eutanasiada, realizando una incisión abdominal media hasta el proceso xifoides.A continuación, utilice la pinza para levantar el esternón y corte con cuidado la caja torácica por ambos lados. Coloque una pinza hemostática en el esternón y doble la caja torácica en dirección rostral para exponer el complejo cardiopulmonar. Luego, inserte una aguja tipo mariposa en el ventrículo derecho del corazón y recoja la mayor cantidad posible de sangre.Una vez que se haya recolectado toda la sangre, sujete la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión inversa del hígado. Luego, sosteniendo la aguja tipo mariposa dentro del ventrículo derecho, sustituya la jeringa de sangre por el tubo de salida de la bomba peristáltica e inserte una segunda aguja tipo mariposa, conectada a una jeringa de recolección de cinco mililitros, en el ventrículo izquierdo. A continuación, encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente cinco mililitros por minuto y recoja suavemente los primeros mililitros del perfusado contaminado en la jeringa de recolección hasta que el perfusado cambie de color oscuro a rojo pálido.Luego, sin detener la bomba, reemplace rápidamente la jeringa de recolección de cinco mililitros con una jeringa de recolección de 20 mililitros y recoja 20 mililitros de perfusado pulmonar para obtener los leucocitos pulmonares marginales de rata a una velocidad de siete mililitros por minuto. Observe la decoloración progresiva de los pulmones, que pasan de un rojo pálido a un blanco transparente, lo cual indica una perfusión exitosa. Una vez recolectado todo el volumen del perfusado, detenga el flujo de la bomba peristáltica y transfiera el perfusado recolectado a un tubo.Luego, centrifugue el perfusado y aspire el sobrenadante. Pase PBS heparinizado a través de las líneas de la bomba peristáltica y de las agujas tipo mariposa para eliminar cualquier burbuja de aire. Para recolectar leucocitos pulmonares marginales de ratón, inmediatamente después de la cesación de la respiración, use tijeras estériles y pinzas de tejido dentadas para abrir las cavidades peritoneal y torácica realizando una incisión abdominal media hasta el proceso xifoides.A continuación, utilice fórceps para levantar el esternón y corte la caja torácica en ambos lados. Sujete el esternón con una pinza hemostática y doble la caja torácica en dirección rostral para exponer el complejo cardiopulmonar. Sujete la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión retrógrada del hígado e inserte la aguja de mariposa en el ventrículo derecho del corazón.Luego, sosteniendo la aguja de mariposa dentro del ventrículo derecho, conecte la aguja de mariposa al tubo de salida de la bomba peristáltica e inserte una segunda aguja de mariposa, conectada a una jeringa de recolección de dos mililitros, en el ventrículo izquierdo. Encienda la bomba a una velocidad de aproximadamente dos mililitros por minuto. Recolecte suavemente el primer mililitro del perfusado contaminado en la jeringa de recolección hasta que el perfusado cambie de color oscuro a rojo pálido.A continuación, sin interrumpir la bomba peristáltica, reemplace rápidamente la jeringa de recolección de dos mililitros por una jeringa de recolección de 10 mililitros y recoja 10 mililitros de perfusado pulmonar a una velocidad de perfusión de cuatro mililitros por minuto. Observe la decoloración progresiva de los pulmones, que pasan de un rojo pálido a un blanco transparente, lo que indica una perfusión exitosa. Una vez recolectado todo el perfusado pulmonar, detenga el flujo de la bomba peristáltica y transfiera el perfusado recolectado a un tubo.Luego, centrifugue el perfusado y aspire el sobrenadante. El compartimento pulmonar margina exhibe una composición de subpoblaciones de leucocitos diferente a la observada para los leucocitos circulantes. De hecho, los inmunocitos innatos, incluidos granulocitos, monocitos y células asesinas naturales, constituyen más del 50% de la población de leucocitos pulmonares margina.En comparación con menos del 30 % del compartimento de células circulantes. En contraste, las poblaciones de células T y células dendríticas se encuentran en porcentajes más bajos en el compartimento pulmonar margenante en comparación con las células circulantes. Un porcentaje tres veces mayor de células asesinas naturales grandes está presente en el compartimento pulmonar margenante que en el compartimento de células circulantes, aunque el número total de células asesinas naturales en general sea similar.Además, la capacidad de las células asesinas naturales del compartimento pulmonar marginales para lisar células tumorales es mayor que la de las células asesinas naturales circulantes, tal como se mide mediante un ensayo estándar de liberación de cromo frente a al menos dos líneas celulares tumorales diferentes. Asimismo, la estimulación inmunitaria mediante la administración in vivo de Poly I:C produce un impacto más profundo en la citotoxicidad de las células asesinas naturales pulmonares marginales que en las células asesinas naturales circulantes cuando se utilizan como dianas las células MADB106. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en pocos minutos si se lleva a cabo correctamente.Estas técnicas permiten la recolección selectiva de leucocitos MP. El estudio de estos leucocitos mejorará nuestra comprensión sobre su significado biológico y clínico, específicamente en relación con el control de células aberrantes circulantes y enfermedades relacionadas con el pulmón. Tras este procedimiento, las células pueden caracterizarse y analizarse mediante citometría de flujo, PCR o cualquier otro ensayo de interés.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar leucocitos pulmonares marginales.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

En este video, demostramos el aislamiento de leucocitos hepáticos marginados del hígado de ratón por perfusión forzada.

Aislamiento de leucocitos hepáticos marginantes de un hígado de ratón

Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Los leucocitos hepáticos marginadores exhiben características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. En este trabajo describimos un método para la recolección selectiva de esta población específica de células hepáticas, mediante perfusión forzada del hígado de ratas o ratones. Los leucocitos hepáticos marginadores parecen ser fundamentales para determinar la susceptibilidad a las enfermedades y metástasis relacionadas con el hígado.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

Este protocolo describe la extracción y purificación de células endoteliales de arteria pulmonar (PAECs) que se adhieren a las puntas del globo de catéteres de Swan-Ganz, mientras se acuñan en la arteria pulmonar durante el cateterismo cardíaco derecho y permanecer adherente a la globo desinflado después del retiro del cuerpo del paciente.

Cosecha de las células endoteliales de las puntas del globo de catéteres de Swan-Ganz después de cateterismo cardíaco derecho

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.

Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

Aprende a realizar perfusión forzada de pulmones en ratas y ratones para recolectar selectivamente leucocitos marginando-pulmonares. Este método permite estudiar sus funciones inmunológicas únicas en la biología pulmonar.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

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