Fluorescencia-lapse de imágenes de la completa S. venezuelae Ciclo de Vida El uso de un dispositivo de microfluidos

El objetivo general de este protocolo de microscopía fluorescente de lapso de tiempo es proporcionar un método para estudiar los procesos celulares biológicos que sustentan el desarrollo y la diferenciación celular en la bacteria filamentosa esporulante, Streptomyces venezuelae. El método describe proporciona una excelente plataforma para estudiar los procesos biológicos celulares que son fundamentales para el ciclo de vida de Streptomyces, incluida la localización dinámica de proteínas, el crecimiento polarizado y la septación por esporulación. La principal ventaja de esta técnica es que Streptomyces venezuelae esporula en líquido, lo que nos permite cultivar las células en un dispositivo microfluídico y monitorizar microscópicamente el ciclo de vida completo.

Este método demuestra el inmenso potencial de Streptomyces venezuelae como un nuevo sistema de desarrollo para el género, ya que permite obtener imágenes en células vivas de la diferenciación de un micelio multicéntrico en cadenas de esporas. Para comenzar, inocule 30 mililitros de medio de crecimiento suplementado con 10 microlitros de esporas de la cepa S.venezuela a obtener imágenes. Para un crecimiento y esporulación consistentes de las células, use un matraz deflector o un matraz que contenga un resorte para permitir una aireación suficiente.

Cultive las células durante 35 a 40 horas a 30 grados Celsius y 250 RPM. Cuando esté listo, debería poder ver los fragmentos miceliales y las esporas a través de la microscopía de contraste de fase montada en líquido. Centrifugar un mililitro del cultivo en una centrífuga de mesa a 400 veces G durante un minuto para granular el micelio y los fragmentos de células más grandes.

A continuación, transfiera aproximadamente 300 microlitros del sobrenadante que contiene una suspensión de esporas, a un nuevo tubo de 1,5 milímetros y coloque el tubo en hielo. Conserve el medio de cultivo restante para utilizarlo en un paso posterior. A continuación, diluya las esporas de una a 20 en un medio de crecimiento suplementado y mantenga las esporas diluidas en hielo hasta que las necesite.

Vierta el medio de cultivo restante en un vaso de precipitados de 50 mililitros y, a continuación, extraiga 10 mililitros con una jeringa y utilice un filtro de jeringa estéril de 22 micrómetros para filtrar y esterilizar el medio de cultivo restante. Obtener un medio de crecimiento suplementado gastado que esté libre de esporas y fragmentos miceliales. Mantenga el medio de crecimiento suplementado gastado filtrado durante unos días a cuatro grados centígrados si se van a realizar experimentos adicionales, utilizando condiciones de crecimiento similares.

Cada placa microfluídica se puede utilizar para hasta cuatro experimentos independientes. Para evitar contaminar las cámaras de flujo no utilizadas, asegúrese de utilizar soluciones y condiciones de trabajo estériles al configurar el experimento. Comience retirando la solución de envío de la placa microfluídica.

A continuación, enjuague los pocillos con un medio de crecimiento estéril suplementado. Una vez enjuagado, agregue 300 microlitros del medio de crecimiento suplementado a la entrada del pocillo uno, y 300 microlitros del medio de crecimiento suplementado gastado a los pocillos dos a seis. A continuación, cargue 40 microlitros de las esporas diluidas en el pozo ocho del carril A y selle el colector a la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Inicie el software de control del microfluídico y seleccione el tipo de placa adecuado. Configure un programa de flujo para hacer fluir el medio desde los pozos de entrada uno a cinco a seis psi durante dos minutos por pozo para cebar el canal de flujo y la cámara de cultivo. Luego, haga que fluya el medio de crecimiento suplementado a seis psi en el pozo de entrada uno durante seis horas.

Esto permitirá que se produzca la germinación y el crecimiento vegetativo. Haga que el programa cambie después de seis horas al medio de crecimiento suplementado gastado y lo haga fluir hacia los pocillos dos a cinco a seis psi durante el resto del experimento. Precaliente la cámara ambiental a 30 grados centígrados con anticipación.

A continuación, encienda el microscopio y el software de control del microscopio. Coloque un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica en su lugar y confirme que los filtros apropiados y los espejos diagramáticos configurados para adquirir imágenes de contraste de interferencia diferencial, junto con las imágenes de las fusiones de proteínas fluorescentes amarillas y fluorescentes rojas estén en su lugar. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo y también en la parte inferior de la ventana de imagen de la placa microfluídica.

Monte con cuidado el dispositivo microfluídico sellado en la platina del microscopio invertido y asegúrelo en su lugar. Utilice los marcadores de posición integrados para enfocar la ventana de imágenes de la cámara de cultivo microfluídico. Concéntrese en la parte más a la izquierda de la primera cámara de flujo etiquetada como A y luego mueva la etapa al tamaño de trampa cinco, correspondiente a la altura de la trampa de 7 micrómetros.

En el software microfluídico, configure el sistema para cargar las celdas del pozo de entrada ocho a cuatro psi durante 15 segundos. Una vez ejecutado el proceso, compruebe la densidad celular en la cámara de cultivo moviendo la platina a través de la ventana de imágenes. Si no se atraparon esporas, repita el paso de carga celular o, alternativamente, aumente la presión y/o el tiempo de carga hasta lograr la densidad celular deseada de una a 10 esporas por ventana de imagen.

Tenga cuidado de evitar sobrecargar la cámara de cultivo. A continuación, inicie el programa de flujo previamente preparado en el software de control y deje que la placa microfluídica se equilibre durante una hora en la etapa del microscopio antes de comenzar la adquisición de imágenes. En el software de control del microscopio, configure una adquisición multidimensional para tomar varias imágenes en múltiples posiciones de etapa a lo largo del tiempo especificando primero un directorio para el almacenamiento automático de los archivos de imagen.

A continuación, vaya a la configuración de iluminación e ingrese la configuración de iluminación óptima predeterminada para cada construcción específica. A continuación, configure una serie temporal para adquirir imágenes cada 40 minutos durante 24 horas. Para determinar las posiciones de las platinas y establecer el enfoque automático, escanee la cámara de cultivo y almacene las posiciones de las platinas para cada posición de imagen de interés.

Asegúrese de que las posiciones de una sola etapa estén ubicadas lo suficientemente separadas para minimizar el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una vez verificadas las coordenadas Z de las posiciones de escenario seleccionadas, active el enfoque automático de hardware. A continuación, inicie el experimento de lapso de tiempo en el software de control del microscopio.

Detenga la adquisición de la imagen después de 24 a 30 horas, o cuando las hifas de la región de interés se hayan diferenciado en esporas. A continuación, detenga el programa de flujo en el software y desmonte el dispositivo microfluídico. Prepare la placa microfluídica usada para el almacenamiento a corto plazo eliminando cualquier medio restante de los pozos de entrada, el pozo de desechos y el pozo de carga de celdas.

A continuación, llene los pozos usados del carril A y los pozos de los carriles no utilizados con PBS estéril. Finalmente, selle el plato con film de pera para evitar que se seque. Y guarde el plato a cuatro grados centígrados.

El éxito de la obtención de imágenes de células vivas de todo el ciclo de vida de S. venezuela proporciona una serie temporal continua, que incluye las etapas clave de desarrollo de la germinación, el crecimiento vegetativo y la esporulación. Durante la germinación o el crecimiento vegetativo, DivIVA-mCherry se acumula exclusivamente en las puntas de los hipnes en crecimiento o marca los puntos de ramificación de las hifas recién formados. Por el contrario, FtsZ-YPet forma estructuras individuales en forma de anillo a intervalos irregulares en el micelio en crecimiento.

Estas estructuras proporcionan el andamio para la síntesis de paredes transversales vegetales no constructivas que conducen a la formación de compartimentos de hifas interconectados. En las hifas esporuladas, el patrón de localización de FtsZ-YPet cambia drásticamente. Primero, los filamentos helicoidales de FtsZ-YPet caen a lo largo de la hifa, y luego, en un evento repentino, casi sincrónico, estas hélices se unen en una escalera de anillos FtsZ-YPet espaciados regularmente.

Finalmente, los tabiques de esporulación se hacen discernibles en las imágenes de contraste de interferencia diferencial y, finalmente, se liberan las nuevas esporas. Esta técnica proporciona un protocolo robusto para realizar imágenes de células vivas del ciclo de vida completo de Streptomyces. El sistema microfluídico es fácil de usar.

Ofrece flexibilidad experimental y permite el seguimiento a largo plazo de la Esta configuración experimental también ofrece un excelente punto de partida para investigar eventos específicos del desarrollo en respuesta a condiciones culturales cambiantes o el uso de tintes fluorescentes para monitorear la síntesis de peptidoglicano o para visualizar la organización cromosómica.