Name: La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de En Ovo Micro-electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende la micro-electroporación in ovo para manipulación genética en el órgano auditivo del pollo desde el día embrionario cuatro. Esta técnica facilita el estudio de la proliferación y diferenciación celular.

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Agradecemos al Dr. Doris K. Wu de plásmidos de expresión y sondas in situ, el Centro de la Universidad Johns Hopkins para la instalación de imágenes Biología Sensorial y el Centro para la audición y el equilibrio. Este trabajo fue apoyado por NIDCD subvención T32 DC000023 de LE

Los huevos no eclosionados y embriones son atendidos y tratados con ética y humanamente. Todos los protocolos para el uso de embriones sin eclosionar fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, Baltimore, Maryland. 1. Los huevos y la preparación de construcciones de expresión <ol><li> Huevos: <ol><li> Incubar 3 - 4 docenas de huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus) acostado sobre sus lados a 37 ° C. <ol><li> Después de 24 horas de incubación, tirar de 3 cc de albúmina con una jeringa desde el extremo posterior redonda del huevo y sellar el agujero con cinta adhesiva transparente. Esto crea una cámara de aire entre el embrión y la cáscara del huevo, lo que permite la facilidad de acceso al embrión sin el embrión se adhiera a la shell cuando el corte de la ventana para el acceso en la parte superior del huevo 19. </li><li> En 117 horas de tiempo de incubación, los embriones etapa de acuerdo con 20 etapas de desarrollo Hamburger y Hamiltonen E4 (HH24-25) (Ver Figura 1D). </li></ol></li></ol></li><li> Construcciones de expresión: <ol><li> Preparar el DNA plásmido usando reactivos y el protocolo proporcionado por el fabricante de un kit de preparación disponible comercialmente. En la etapa final de preparación, eluir el ADN en 500 l de TE (Tris-EDTA) tampón proporcionado en el kit en un tubo de 1,5 ml. </li><li> El etanol precipitar el ADN para concentrarla mediante la adición de 50 l de 3 M de acetato de sodio y 1 ml de etanol 100% al tubo. Se coloca el tubo a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugar el tubo durante 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y aire secar el sedimento durante 10 min a RT. Disolver el precipitado en 15 l de tampón TE, lo que debería dar una concentración de ~ 4 mg / l. NOTA: El control de construcciones de expresión utilizados aquí son PME-IRES-GFP 10, que es impulsado por un promotor de pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP <shasta&gt; 10, que es impulsado por el promotor CMV. </li></ol></li></ol> 2. pollo in ovo Micro-electroporación in ovo y ensayo de proliferación celular <ol><li> En Ovo Microinyección de construcción de expresión y Micro-electroporación: <ol><li> Tire de los tubos capilares de vidrio en agujas finas usando un extractor de micropipeta con los siguientes parámetros optimizados para una 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Calefacción Filament: Presión = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, velocidad = 105, y la hora = 150 ms (ver Tabla 1). </li><li> Establecieron la izquierda y etapas micromanipulador diestros que flanquean el microscopio (véase la Figura 1A). El micromanipulador Dretà sostiene la aguja capilar de vidrio y el micro-manipulador zurdos sostiene los electrodos (Figura 1A). </li><li> Preparar la aguja capilar de vidrio finamente tirado por microinyección cortandola punta de la aguja con un fórceps durante el trabajo bajo el microscopio. </li><li> Llene la aguja de forma manual a mano utilizando el micromanipulador con 2,5 l de ADN plásmido teñidas con 0,1% Fast Green mientras se trabaja bajo el microscopio. </li><li> Colocar el huevo acostado de lado dentro de un dispositivo de retención de moldes / huevo (ver Figura 1A). Cortar una ventana redonda en la parte superior del huevo con unas tijeras 19 (Figura 1A). </li><li> Mientras que trabajar bajo el microscopio, abra con cuidado las dos membranas superpuestas el embrión utilizando pinzas. </li><li> Mientras que trabajar bajo el microscopio, entregar aproximadamente ~ 0,5 l de ADN plásmido a la derecha del lumen de la vesícula ótica por microinyección de forma manual utilizando la mano derecha utilizando el micro-manipulador y por micro-electroporación. <ol><li> Para ello, micro-inyectar el derecho lumen vesícula ótica con el ADN con la mano derecha micromanipulador (Figura 1B-D), mientras que al mismo tiempo usando la mano izquierda aguantandoga pinza de sostener la cabeza del embrión, porque la cabeza del embrión se sumerge en la etapa E4. No te micro-inyectar más allá del lumen de la vesícula ótica, ya que esto dañará la vesícula ótica. </li><li> Inmediatamente después de la microinyección, mientras se trabaja bajo el microscopio, usar de la izquierda micro-manipulador para colocar el positivo (ánodo) 2 mm electrodo de platino anterior-ventral a la vesícula ótica derecho y el electrodo 2 mm negativo (cátodo) en paralelo 1 mm entre sí (véase la Figura 1 C). Entregar 4 pulsos a 12 V con 100 ms de duración y 200 mseg separación. La vesícula ótica izquierda sirve como un control no tratado interna. NOTA: Limpie los electrodos en el medio electroporaciones con un bastoncillo de algodón empapado en 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li> En Ovo ensayo de proliferación celular: <ol><li> Inmediatamente después de la electroporación se añaden 50 l de 0,25 mg / ml en 1 x PBS EdU dejando caer manualmente la solución EdU 50 l en el conjuntoembrión in ovo utilizando una pipeta. Sellar los huevos con la cinta y volver a la incubadora durante 18 a 96 hr. </li><li> Retirar con cuidado la cinta y comprobar los embriones para GFP señal fluorescente o RFP dentro de la vesícula ótica después de 18 - 24 horas usando un microscopio fluorescente estándar (ver Figura 1 EE &#39;). Si la señal fluorescente está presente, en este punto cosechar los embriones de los análisis o vuelva a sellar con cinta y devolverlo a la incubadora para la recolección y análisis en etapas posteriores (ver Figura 1 FP &#39;&#39;). NOTA: La expresión de GFP señal con la construcción PME-IRES-GFP es evidente 6 - 7 horas después de la electroporación 10. </li></ol></li></ol> 3. La recolección de embriones y Procesamiento de tejidos para la ARN hibridación in situ e inmunohistoquímica <ol><li> Recoger los embriones utilizando fórceps. Enjuague el embrión en 1x PBS frío. Retire las cabezas de los embriones, cortando la cabeza por el cuelloel uso de fórceps, y colocar las cabezas en paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C. Perforar el cerebro utilizando una pinza para permitir la penetración de la paraformaldehído 4% dentro de la cabeza. </li><li> Deshidratar las cabezas en sacarosa al 30% (en PBS 1x) O / N a 4 ° C. </li><li> Montar las cabezas en medio crioprotector mediante congelación rápida en una suspensión de hielo seco y metilbutano (2-metilbutano). Por otra parte, la rápida congelación de las cabezas en medio crioprotector con nitrógeno líquido. Almacenar las cabezas montadas a -80 ° C. </li><li> Cryosection las cabezas en 12 micras de espesor secciones de tejidos y recoger todas las secciones de tejido que contiene el oído interno-en portaobjetos de vidrio de microscopio superfrosted. </li><li> Realizar RNA estándar de hibridación in situ e inmunohistoquímica, como se describe previamente 4,21, y analizar para la proliferación celular EdU siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante del kit. NOTA: Las células ciliadas se pueden identificar usando policlonales de conejo α-myosinVIIA (MYO7A) unatibody (1: 1000, Proteus Biosciences) y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1: 250, de cabra anti-conejo AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> 4. Captura y Procesamiento <ol><li> Tomar imágenes con equipos de imagen digital. Resultados de inmunohistoquímica imagen con un microscopio de fluorescencia estándar y los resultados de la in situ usando un microscopio de campo amplio estándar (que van de 5x a 40x en aumento). </li><li> Procesar las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método aquí descrito de in ovo micro-electroporación se ha optimizado para la transferencia de genes en el órgano auditivo en desarrollo. Es compatible con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido normalmente se utilizan para manipular la función del gen / expresión. El momento de la electroporación a E4 es óptimo para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Los pasos más críticos son micro-inyección de la DNA en el lumen vesícula ótica sin ir demasiado p...

A pesar de las diferencias en la morfología celular y patrones entre los mamíferos y órgano sensorial auditivo aviar, se cree que están conservadas evolutivamente 1-3 los factores moleculares y las vías responsables del desarrollo de HC sensorial. La papila basilar, que aloja la HC auditivas y sus alrededores SC, se desarrolla como la protrusión de la otocyst oído interno. Al principio de un grupo de progenitores de HC y SC se especifica dentro de la placoda ótica / Dominio competente taza neuronal sensorial-ótica (NSD). Los datos de mapeado de destino proporcionan evidencia de que los linajes neuronales y sensoriales están vinculados y se derivan de la NSD situado en la región antero-ventral de la copa ótica o otocyst en ratones y pollos 4,5. En primer lugar, los neuroblastos delaminate de la NSD para dar lugar a las neuronas del ganglio auditivo-vestibular, que finalmente dividido en ganglios auditivo y vestibular. Estas neuronas inervan los HC sensoriales del oído interno y núcleos en el tronco cerebral. Las células Tha permanecer en el NSD se cree que dar lugar a varios parches sensoriales, incluido el órgano sensorial auditivo, que consta de los HC sensoriales mecano-transducción y sus asociados SCs. En tanto el pollo y murino, órgano de la audición sensorial progenitora salida del ciclo celular y la diferenciación HC se producen en gradientes opuestos. En polluelo, la salida del ciclo celular progenitora auditiva comienza alrededor de ~ E5 y progresa desde la base hasta el vértice, y desde el centro hacia la periferia 6. Un día después, HC diferenciación comienza en el vértice y que avanza a la base 7. Estudiar el desarrollo del oído interno en el pollo proporciona muchas ventajas técnicas como mecanismos funcionales pueden ser investigados con relativa facilidad in ovo en comparación con la manipulación de los embriones en el útero en otros sistemas modelo, que requiere cirugías complejas. El método descrito aquí utiliza in ovo micro-electroporación para apuntar genes de interés en el Basila presuntivar área de la papila antero-ventral en la vesícula ótica específicamente a E4. La electroporación in ovo es una técnica que está bien establecido y comúnmente utilizado 8-14. El principio de la técnica de electroporación se basa en el hecho de que los nucleótidos (por ejemplo, ADN plásmido, ADN sintético, o ARN oligonucleótidos) están cargadas negativamente. El ADN se inyecta en el tejido de interés. Cuando una corriente eléctrica se coloca a través del tejido, la corriente abre los poros transitorios en las paredes celulares y permite la captación del ADN, como fluye el ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo (ánodo). Para los experimentos de ganancia de función, los genes de interés se subclonan comúnmente en plásmidos de expresión que contienen casetes de expresión adecuados para la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP). Para los experimentos de construcciones de pérdida de función basados ​​en plásmidos dominantes negativos represores, o RNAi, o construcciones de morfolino son commonly utiliza 15,16. Para inhibir microARN (miARN) de función miRNAs construcciones de esponja, que son típicamente plásmido basado, se puede utilizar 17. El método aquí descrito permite la investigación de los mecanismos moleculares que controlan la proliferación y diferenciación en el órgano auditivo, como el método en micro-electroporación in ovo se puede combinar fácilmente con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU a todo el embrión. La electroporación y la adición de EdU se realiza a E4 en la vesícula ótica, que es un día antes del inicio de la salida del ciclo celular en el órgano auditivo. Análisis del órgano de la audición se realiza típicamente 18 de - 96 horas después de la electroporación en E5 (inicio de la salida del ciclo celular progenitora sensorial), E6 (inicio de la diferenciación HC), y E7 (durante la diferenciación HC); y más tarde hasta ~ E9 (final de la diferenciación HC). Este método de electroporación de la transferencia genética es transitoria que dura aproximadamente ~ 4 días, because los genes de interés no se integran en el genoma, pero el método es aplicable para su uso con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido apropiado, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma, tales como la transferencia de genes mediada por Tol2 11. Con este método robusto GFP o RFP expresión dura ~ 4 días en la cóclea, después de lo cual las señales se desvanecen, sin embargo, proporcionan una ventana de tiempo suficiente para estudiar la intrincada desarrollo del órgano auditivo. Esto, a su método de transferencia génica in ovo es novedosa y permite apuntar específicamente el órgano auditivo presuntiva en E4, que es óptima para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Es una buena adición a procedimientos alternativos, que electroporate en etapas de desarrollo mucho más jóvenes o 11,12 en comparación con el uso de cultivos de explantes in vitro papilas basilar 18.

<table><tbody><tr><td>Estéril 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana a Micrograbber Kit de cable</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Diestro & Micromanipuladores para zurdos</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Dos etapas de dispositivo de sujeción magnética de 12 mm con postes verticales de 7 pulgadas</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td>Placa base de acero metálico <td>M10</td><td></td></tr> de <tr><td>12x24 pulgadas</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras para huevos curvadas de 12 cm de largo, hojas extrafinas de 12 mm; Tijeras de resorte</td><td>World Precision Instruments Inc. &nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas para tirar de agujas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Caja 2.5x2.5 mm Filamento Calefactor de Platino</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio/Agujas/Sin fibra/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio Hamilton 100 &mu; l</td><td>Aceite mineral Hamilton</td><td>80601 modelo 710LT</td><td></td></tr><tr><td>(pesado) para la jeringa de vidrio Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno para conectar la jeringa de vidrio y las agujas cappilar de vidrio / no tóxico</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td> <td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Jeringas desechables Becton</td><td>Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Agujas desechables de calibre 21</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Un par de electrodos de platino de 2 mm</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Un par de pinzas finas Dumont número 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta invisible de acabado mate para sellar huevos</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr>Puntas <td></td><td></td><td></td>de<td>filtro estériles</td></tr></tbody></table>

la transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; en ovo</em&gt; micro-electroporación

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Embriones de pollo son sistemas modelo ideal para estudiar el desarrollo embrionario como manipulaciones de la función de genes pueden llevarse a cabo con relativa facilidad in ovo. El órgano sensorial auditivo del oído interno es fundamental para nuestra capacidad de oír. Alberga un epitelio sensorial altamente especializado que consiste en células ciliadas mecano-transducción (HC) y que rodea la glía como células de soporte (SCS). A pesar de las diferencias estructurales en los órganos auditivos, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo del órgano auditivo se conservan evolutivamente entre los mamíferos y aves En electroporación in ovo está muy limitado a las primeras etapas de E1 -. E3. Debido al desarrollo relativamente tarde del órgano auditivo en E5, manipulaciones del órgano de la audición por electroporación in ovo en el pasado E3 son difíciles debido al avanzado desarrollo del embrión de pollo en etapas posteriores. El método que aquí se presenta es un método de transferencia génica transitoria para dirigir genes de interés enetapa E4 - E4.5 en el auditorio de pollo en desarrollo a través de los órganos sensoriales in ovo micro-electroporación. Este método es aplicable para ganancia y la pérdida de funciones con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido convencional y se puede combinar con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU (5-etinil-2 &#39;desoxiuridina) a todo el embrión en el tiempo de electroporación. El uso de la proteína fluorescente verde o roja (GFP o RFP) plásmidos de expresión permite al experimentador para determinar rápidamente si la electroporación dirigido con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. En este trabajo el método, se ilustran ejemplos representativos de las muestras GFP a electroporación; embriones se recogieron 18 a 96 h después de la electroporación y la selección de GFP a la zona de pro-sensorial del órgano auditivo se confirmó mediante hibridación in situ de ARN. El papel método también proporciona un protocolo optimizado para el uso de la timidina analógico EdU para analizar prolife célularación; Se proporciona un ejemplo de un ensayo de proliferación celular basado EdU que combina inmuno-etiquetado y haga clic en la química edu.

En este ADN método de papel plásmido que consiste en proteína fluorescente verde (GFP) casetes de expresión fue el blanco en el pollo en desarrollo papila basilar (BP) con parámetros optimizados de 12 V y 4 pulsos con 100 duración de pulso mseg y los intervalos de 200 mseg, produciendo un ~ 50% de tasa de supervivencia de los embriones y la eficiencia de plásmidos de ADN de direccionamiento en el BP. De imagen fluorescente de la expresión de GFP nativa en el desarrollo de embriones mostr...

El órgano auditivo media la audición. En este trabajo presentamos un método modificado de microelectroporación in ovo optimizado para el estudio de la proliferación y diferenciación de células progenitoras auditivas en el órgano auditivo de pollo en desarrollo.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

El objetivo general de este método es realizar manipulaciones genéticas en el órgano auditivo en desarrollo del pollo a partir del día embrionario cuatro en adelante. Esto es significativo debido a la dificultad de trabajar con la etapa de desarrollo avanzada del embrión de pollo. La principal ventaja de esta técnica es que dirige específicamente al órgano auditivo en desarrollo dentro del huevo con una relativa facilidad en comparación con otras técnicas que requieren cirugías complejas in utero.Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo sensorial auditivo, incluyendo cómo se coordina el patrón espacial y temporal de la proliferación de células progenitoras sensoriales y su diferenciación hereditaria. Para comenzar este procedimiento, sujete la aguja de capilar de vidrio utilizando el tubo conectado a la jeringa de vidrio, que se coloca en el micromanipulador derecho, y coloque los electrodos en el micromanipulador izquierdo.Bajo el microscopio, corte la punta de la aguja utilizando un par de pinzas. A continuación, coloque 2.5 microlitros de ADN plasmático teñido con verde rápido al 0,1 % en un recipiente. Llene la aguja con ADN plasmático utilizando el émbolo de la jeringa conectada al micromanipulador derecho.Coloque un huevo de lado en un dispositivo de sujeción. Luego, corte una ventana redonda en la parte superior del huevo utilizando tijeras. Después de eso, coloque el huevo en el dispositivo de sujeción debajo del microscopio.Abra cuidadosamente las dos membranas que recubren el embrión utilizando un par de pinzas para exponer la vesícula ótica derecha. Mientras estabiliza la cabeza del embrión con las pinzas usando la mano izquierda, administre aproximadamente 0,5 microlitros de ADN plasmídico con el micromanipulador de la mano derecha. Tenga cuidado de no inyectar más allá de la luz de la vesícula ótica, ya que esto dañaría la vesícula ótica.Microinyectar ADN en la luz de la vesícula ótica sin dañar la vesícula ótica es fundamental y requiere el uso de ambas manos. Inmediatamente después de la microinyección, utilice el micromanipulador de la mano izquierda para colocar el conjunto de electrodos de platino positivo y negativo de dos milímetros anterior y ventral a la vesícula ótica derecha, y aplique cuatro pulsos a 12 voltios operando el electroporador. La colocación precisa de los electrodos en la región anterior ventral del órgano auditivo presumible es importante y asegura que se dirija al órgano auditivo en desarrollo.Inmediatamente después de la electroforesis, agregue 50 microlitros de EdU sobre todo el embrión in ovo. A continuación, selle el huevo con cinta adhesiva. Devuelva todos los huevos manipulados y sellados al incubador durante 18 a 96 horas.Después de 18 a 24 horas, retire cuidadosamente la cinta. Revise los embriones en busca de señal fluorescente de GFP o RFP dentro de la vesícula ótica utilizando un microscopio fluorescente estándar. Si hay señal fluorescente, recolecte los embriones para análisis o vuélvalos a sellar con cinta y devuélvalos al incubador para su recolección y análisis en etapas posteriores.Se utilizó hibridación in situ de ARN para determinar si la electroporación dirigió con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. Dentro del BP en desarrollo, los progenitores sensoriales se identificaron por su expresión de Sox2 y Lunatic Fringe. Estas imágenes demuestran que los progenitores sensoriales en todo el BP en desarrollo, tanto en la base como en el ápice, fueron dirigidos con éxito y expresaron GFP tras 68 horas de electroporación.Además, la GFP se expresó fuera del dominio sensorial en células epiteliales no sensoriales y en el ganglio auditivo marcado por la expresión de Neurod1. Para determinar el comportamiento proliferativo de los progenitores sensoriales, se añadió EdU, un análogo de timidina, en el momento de la electrotransferencia a las 4 E, y cuatro días después se analizó la incorporación de EdU en la BP en desarrollo mediante secciones de tejido. Se utilizó inmunomarcado para la proteína específica de las células pilosas, Myosin7a, para identificar las células pilosas en diferenciación en la BP en desarrollo. En la porción apical de la BP, las células pilosas positivas para Myo7a frecuentemente fueron positivas para EdU.Mientras que en la base, solo unas pocas células ciliadas positivas para Myo7a habían incorporado EdU, lo que sugiere que en el momento de la adición de EdU en el día E cuatro, los progenitores sensoriales en la base ya son en gran parte posmitóticos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cinco a ocho minutos por huevo. Durante la realización de este procedimiento, es importante utilizar reactivos recién preparados y estériles para asegurar la supervivencia de los embriones.Tras seguir este procedimiento, los parámetros del método pueden modificarse para estudiar otros fenómenos en el oído interno en desarrollo, como la formación de los órganos vestibulares y la neurogénesis del oído interno. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del oído interno estudien específicamente el órgano auditivo de pollo, que se desarrolla relativamente tarde, a partir del día embrionario cuatro en adelante. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular adecuadamente el embrión de pollo, realizar microinyecciones y electro poraciones, y llevar a cabo el ensayo de proliferación celular in ovo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.

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Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

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Un método de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas posteriores de incubación (de más de Hamburger y Hamilton etapa (HH) 22) se describe. Este método supera las desventajas...

Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores<em&gt; Ex ovo</em&gt; La electroporación

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Aprende la micro-electroporación in ovo para manipulación genética en el órgano auditivo del pollo desde el día embrionario cuatro. Esta técnica facilita el estudio de la proliferación y diferenciación celular.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de

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