Protocolo La autorradiografía de receptores para la visualización localizada de Receptores de la Angiotensina II

El objetivo general de este procedimiento es localizar y cuantificar anatómicamente la expresión del receptor de angiotensina II en secciones del cerebro utilizando la autorradiografía del receptor y la identificación histológica de las estructuras cerebrales. Este método identifica las regiones cerebrales donde la angiotensina II afecta el comportamiento, la función cognitiva y el sistema cardiovascular, proporcionando información para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. Las principales ventajas de esta técnica son que es cuantitativa, cualitativa y permite la identificación de receptores funcionales para la Angiotensina II con mayor especificidad que otros métodos.

Este método también puede caracterizar la funcionalidad de otros sistemas de receptores hormonales en todo el cuerpo, como los receptores relacionados con las drogas de abuso. Inmediatamente después de la cosecha, coloque los tejidos cerebrales en moldes cerebrales que simulen el interior del cráneo y envuelva los moldes en papel de aluminio para almacenarlos a menos 20 grados centígrados. Después de 30 minutos, transfiera los pañuelos a una bolsa de almacenamiento hermética para congelador y almacene la bolsa a menos 80 grados centígrados.

Antes de seccionar, retire suavemente el cerebro del molde cerebral. Para seccionar el tejido cerebral, transfiera la muestra de interés a un criostato colocado entre menos 10 y menos 18 grados centígrados. Cuando el tejido se haya equilibrado a la nueva temperatura, utilice un medio a base de glicol y resina para incrustar verticalmente una pequeña porción de la muestra en un soporte de tejido para permitir la sección del plano coronal.

Cargue el tejido en el micrótomo y apriete firmemente el soporte en su lugar, luego comience a cortar el cerebro con el grosor deseado, luego monte las secciones en portaobjetos de microscopio en una orientación vertical para aplicar una mayor área de superficie del tejido al portaobjetos. Reúna las secciones en grupos secuenciales de cinco. Cuando se hayan recogido todas las secciones, deje que los portaobjetos se sequen al aire durante un máximo de una hora.

A continuación, coloque las muestras en una caja de plástico en una bolsa de congelación autosellable para almacenarlas a menos 20 grados centígrados. Para etiquetar con radio los especímenes, retire la primera y la segunda diapositivas de cada conjunto de cinco y móntelas en agarraderas de diapositivas disponibles comercialmente o impresas en 3D. Los portaobjetos del guión uno son para el grupo de tratamiento no específico y los portaobjetos del guión dos son para el grupo de tratamiento total.

Invierta los portaobjetos en 35 a 40 mililitros de AM5 a temperatura ambiente más sus respectivos inhibidores en los frascos Coplin de preincubación adecuados. Ejecutar varios conjuntos de diapositivas puede ser abrumador. Por lo tanto, es extremadamente crítico colocar los portaobjetos en los frascos de preincubación a intervalos de cuatro minutos para asegurarse de que no haya superposición durante el paso de secado.

Después de 30 minutos, transfiera los portaobjetos a los soportes de incubación que contengan 10 mililitros de AM5 suplementados con la concentración adecuada de I125 SI Angiotensina II y los inhibidores del grupo de tratamiento respectivo durante 60 a 90 minutos a temperatura ambiente. La determinación de la concentración exacta de 125I SI Ang II es fundamental para permitir la comparación de los receptores de angiotensina II de un día para otro. Al final de la incubación, regrese los portaobjetos a las mordazas de los portaobjetos, bloquee los portaobjetos y gírelos suavemente durante uno o dos segundos en dos recipientes separados de 400 mililitros de agua destilada.

Después del segundo lavado con agua, enjuague los portaobjetos con cuatro lavados secuenciales de un minuto en 30 a 40 mililitros de AM5. Después del cuarto lavado, agite suavemente las secciones durante uno o dos segundos en cuatro cambios de agua destilada helada. A continuación, utilice cuatro secadores de pelo colocados en diferentes ángulos para secar los portaobjetos con aire frío durante cuatro minutos.

Cuando todas las secciones estén secas, transfiera los portaobjetos a una toalla de papel. A continuación, utilice cinta adhesiva de doble cara para montar los portaobjetos, con el pañuelo hacia arriba, en un trozo de cartón para la película de rayos X en la posición y que incluya al menos un portaobjetos estándar de calibración de yodo 125 por grupo. Para filmar la exposición de las secciones, en una habitación oscura, coloque las diapositivas de cartón dentro de un casete de rayos X con correa y apague las luces.

Encienda la luz de seguridad y abra con cuidado una caja de película de rayos X. Coloque una película, con el lado brillante hacia arriba con el borde dentado en la esquina inferior derecha encima de las diapositivas en el casete. A continuación, cierre con cuidado el casete con las barras de bloqueo retorcidas para sellar la luz y guarde el casete a menos 20 grados centígrados.

Después del período de exposición adecuado, transfiera la película a la solución reveladora durante dos minutos, seguidos de 30 segundos en un baño de parada, agua destilada dos veces con ácido acético y luego cinco minutos en una solución fijadora. Lave la película en una bandeja con agua corriente durante 20 minutos. Transfiéralo a un surfectante durante aproximadamente 10 segundos y cuelgue la película para que se seque.

Para el análisis histológico de las secciones de tejido cerebral, descongele el tablero tres secciones en una rejilla de portaobjetos. A continuación, lave las secciones en agua desionizada durante un minuto, seguido de una incubación de 10 minutos en una solución de tinción de tionina y tres inmersiones en un recipiente de agua desionizada. Sumerja los portaobjetos para un lavado adicional de 30 segundos con agua desionizada.

A continuación, lave los portaobjetos en lavados secuenciales con etanol como se indica. Después del último lavado al 100% de etanol, lave los portaobjetos en dos recipientes de xileno durante tres y cinco minutos consecutivos. Al final del segundo lavado con xileno, cubra el borde superior de un portaobjetos a la vez con una base de resina, medio de montaje con solvente inorgánico.

La cubierta de montaje de 24 por 60 milímetros se desliza en los portaobjetos y deja que los portaobjetos se sequen durante 48 horas. A continuación, escanee las diapositivas y la película en el ordenador a 2400 DPI en escala de grises. Para analizar la película por densitometría, después de la exploración, delinear empíricamente las áreas de interés en cada película.

Esta es la imagen en pseudocolor generada después de abrir la película escaneada en el programa de análisis de imágenes. Incluya la densidad, el área de escaneo y el área objetivo total en las mediciones. Ajuste las barras del área de escaneo para asegurarse de que cada región de interés se encuentre entre los parámetros del resaltado.

A continuación, exporte los datos a una hoja de cálculo para determinar el enlace específico presente para cada muestra. Las unidades estándar de calibración para la cuantificación se determinan en función de la fecha en que se realizó el ensayo. Después de escanear las películas, los valores de calibración se utilizan para generar una curva basada en las diferentes concentraciones de estándares de yodo 125 para esa película específica.

La calibración y los valores estándar se registran por triplicado para mayor precisión. Las distinciones entre la unión no específica y los grupos totales, así como las etiquetas de los tejidos, se establecen asignando cada conjunto de datos a los subgrupos apropiados. Se debe establecer un valor de umbral más alto ajustando los parámetros de rojo a negro, mientras que el valor de umbral inferior debe establecerse cerca de cero para permitir una medición más precisa de toda el área de interés escaneada.

Por ejemplo, aquí se comparan las áreas medidas finales del núcleo paraventricular del hipotálamo en los grupos de unión totales frente a los no específicos con una sección teñida con tionina para la confirmación anatómica. La unión inespecífica es la cantidad de radioligando unido a receptores no radiactivos de angiotensina en presencia de una concentración saturante de ligando del receptor de angiotensina I no radiactivo, mientras que la unión total es la cantidad de radioligando unido en ausencia de ligando del receptor de angiotensina I no radiactivo. A continuación, los valores de unión no específicos se pueden restar de los valores de unión totales para obtener los valores de unión específicos para los receptores de angiotensina I.

Una vez dominado, el paso de autorradiografía del receptor se puede completar en unas cuatro horas, mientras que el paso de revelado de la película tarda unos 30 minutos por película. Al realizar este procedimiento, es importante llevar un registro del tiempo para asegurarse de que todos los portaobjetos se incuben, enjuaguen y sequen exactamente durante el mismo tiempo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar estudios adicionales de la morfología cerebral para evaluar los cambios en el tamaño de las regiones que muestran la expresión del receptor de angiotensina II.

Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores que estudian la farmacología de los receptores determinen cómo las diferentes regiones del cerebro se ven afectadas por diversas neurohormonas, neurotransmisores y fármacos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar con éxito un ensayo de autorradiografía de receptores, portaobjetos teñidos histológicamente y evaluar autorradiogramas para localizar receptores en regiones específicas del cerebro. Recuerde que trabajar con radiactividad puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el blindaje, la contención, el monitoreo de la exposición y la eliminación adecuados para evitar la contaminación radiactiva.