Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

El objetivo general de este bioensayo sencillo basado en células es detectar, cuantificar y monitorear la actividad de los miembros de la familia de ligandos del factor de crecimiento endotelial vascular. Este método puede responder preguntas clave en biología vascular, virología, cáncer y oftalmología, donde los ligandos de la familia VEG-FR regulan procesos fundamentales en estas enfermedades. La principal ventaja de este ensayo es que permite evaluar los ligandos de la familia VEG-FM en función de su capacidad para unirse y entrecruzar sus diferentes receptores sin necesidad de células epiteliales especializadas.

Cultive la línea celular secretora de IL3 WEHI-3D pipeteando cinco por diez a la sexta células en fase logarítmica de crecimiento en cuatro a diez matraces T175 que contienen 50 mililitros de medio de cultivo fresco. Incube durante siete días o hasta que las células hayan superado su fase logarítmica de crecimiento en aproximadamente 24 a 48 horas. Decante el líquido y las células de los matraces.

Y centrifugar a 1,000 G durante 15 minutos para eliminar células y restos celulares. Luego, retirar el 90% superior del sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de 0,22 micrones. Aliotar el medio condicionado en alícuotas de un mililitro para la preparación del ensayo.

Aliquotas de 50 mililitros para preparar medio de cultivo para el paso de líneas celulares dependientes de factores y volúmenes de 200 mililitros para almacenamiento a largo plazo a 20 grados Celsius. Almacene las volúmenes más pequeños a 20 Celsius. Cultive las células de control BAF3 en medio de cultivo que contenga medio acondicionado al 10 % de WEHI-3D.

y células VegFR2-EPoR-BAF3 en el mismo medio más un miligramo por mililitro de G418. Pase las células a diluciones de uno a 15 a partir de células en fase logarítmica de crecimiento. Recoga células BAF3 de control o células VegFR2-EPoR-BAF3 de cultivos en fase logarítmica media.

Pipetee suavemente para desprender las células del fondo del frasco, luego centrifugue a 750 Gs durante cinco minutos para recuperar el botón celular. Re-suspenda el botón en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de tonicidad para ratón y vuelva a centrifugar a 750 Gs durante cinco minutos. Repita el lavado otras dos veces para eliminar el medio que contiene IL3.

Lave las células una vez utilizando medio sin medio acondicionado DEHI-3D. Es importante eliminar el medio de cultivo que contiene IL3 para asegurar que no queden factores de crecimiento adicionales, lo que podría generar un resultado falso positivo o una actividad de fondo elevada. Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, re-suspenda las células en el mismo medio libre de IL3 a una concentración de 7,4 veces 10 a la cuarta células por mililitro.

Finalmente, mezcle volúmenes iguales de azul de tripano en PBS con una población celular y cargue en un hemocitómetro. Cuente al menos 100 células. Las células que incorporan el colorante se consideran muertas o en proceso de muerte.

Es fundamental que las células utilizadas para el ensayo tengan una viabilidad alta para asegurar que sean capaces de responder a sus condiciones de ensayo. Utilice una pipeta automática P20 bien calibrada y puntas autoclavadas para agregar 1,000 células en 13,5 microlitros de medio deficiente en IL a los pocillos de una placa de 72 pocillos. Tenga cuidado de mezclar la suspensión celular durante la alícuota para asegurar que la sedimentación celular por gravedad no sesgue la concentración de células.

Utilice un pipeta P2 bien calibrada para agregar 1,5 microlitros de medio libre de IL3 en réplica triple a los pozos de control. Agite suavemente para mezclar. De la misma manera, agregue el medio condicionado de WEHI-3D al 10 % y el control de VegFA a 100 nanogramos por mililitro sin IL3 a los pozos deseados.

Finalmente, agregue 1.5 microlitros de las muestras de prueba en réplicas por triplicado. Llene los pocillos no utilizados de la placa de micropocillos con agua estéril, PBS o medio. Coloque papel de tejido humedecido con agua en un recipiente permeable a los gases para crear una cámara humedecida que permita el intercambio gaseoso.

Incubar las placas de ensayo en las cámaras en una atmósfera humedecida de 10% de dióxido de carbono durante 16 horas. Después de 16 horas de incubación, analizar las placas utilizando un microscopio de fase invertido estándar con un aumento de 40 a 100x. En este momento, es posible discriminar entre muestras positivas y negativas.

Los pocillos sin soporte de factores de crecimiento o con medio únicamente presentarán un número reducido de células redondas, así como células muertas o en proceso de muerte y restos celulares. Por el contrario, las células incubadas con medio que contiene IL3 o ligando para VegFR2 son grandes y translúcidas, y no hay o hay evidencia mínima de granularidad en el citoplasma celular ni de restos celulares en el cultivo. Añada 10 000 células lavadas en 135 microlitros de medio deficiente en IL3 a los pocillos de una placa estándar de 96 pocillos.

Utilice una pipeta P20 calibrada para agregar 15 microlitros de las muestras de prueba y controles a los pocillos. Incube la mezcla de células, factores de crecimiento y/o agentes inhibidores como antes durante 48 horas. Al finalizar el período de incubación, evalúe el número de células viables en los pocillos utilizando los métodos descritos en la parte escrita del protocolo.

Aquí se representan los resultados de un ensayo en el que se utiliza el bioensayo VEGF-R2 EPoR BAF3 para cuantificar la actividad de las tres ligandinas humanas recombinantes con especificidad para VEGF-R2: VEGF-A165, VEGF-C y VEGF-D. La actividad se cuantificó en presencia de bevacizumab, un anticuerpo monoclonal inhibidor de VEGF-A165, o en presencia de trastuzumab, un anticuerpo no neutralizante.

Los datos se han normalizado con respecto a la respuesta frente a VEGF-A165 solo. Como era de esperar, bevacizumab bloqueó el efecto de VEGF-A165 en el ensayo, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad de VEGF-C y VEGF-D. Las células expuestas a IL3 presentaron una viabilidad muy alta.

Mientras que aquellos expuestos a ningún factor de crecimiento adicional muestran una viabilidad deficiente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que existe una variedad de agentes reguladores en los medios condicionados que deben generarse previamente al ensayo. Esta técnica allanó el camino para un resurgimiento en biología vascular, virología, cáncer y oftalmología para explorar el papel del VEG-FM en las liguinas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las células para el bioensayo, cómo realizar el bioensayo y cómo llevar a cabo los análisis cuantitativos o semicuantitativos de la actividad del ligando VEG-FM.