Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

El objetivo general de este sencillo bioensayo basado en células es detectar, cuantificar y monitorizar la actividad de los miembros de la familia de liginas del factor de crecimiento endotelial vascular. Este método puede responder a preguntas clave en biología vascular, virología, cáncer y oftalmología, donde las liginas de la familia VEG-FR irradian procesos clave en estas enfermedades. La principal ventaja de este ensayo es que permite evaluar las liginas de la familia VEG-FM en términos de su capacidad para unirse y entrecruzar sus diferentes receptores sin necesidad de células epiteliales especializadas.

Cultive la línea celular secretora de IL3 WEHI-3D pipeteando cinco veces diez a la sexta célula en la cara logarítmica de crecimiento en cuatro a diez matraces T175 que contengan 50 milímetros de medio de cultivo fresco. Incubar durante siete días o hasta que las células hayan pasado su fase logarítmica de crecimiento alrededor de 24 a 48 horas. Decantar el líquido y las células de los matraces.

Y girar a 1.000 Gs durante 15 minutos para eliminar las células y los restos celulares. A continuación, retire el 90% superior de la supernaytent y fíltrelo a través de una unidad de filtro de 0,22 micras. Alícuota del medio acondicionado en alícuotas de un mililitro para la preparación del ensayo.

50 milímetros de alícuotas para hacer que el medio de cultivo pase a líneas celulares dependientes de un factor y volúmenes de 200 mililitros para almacenamiento a largo plazo a 20 grados centígrados. Almacene los volúmenes más pequeños a 20 grados centígrados. Control de cultivo de células BAF3 en medios de cultivo que contienen un 10% de medio acondicionado WEHI-3D.

y células VegFR2-EPoR-BAF3 en el mismo medio más un miligramo por mililitro G418. Células de paso de una a 15 diluciones de células que crecen en fase logarítmica. Células de control de cosecha BAF3 o VegFR2VPoR-BAF3 para cultivos de fase logarítmica media.

Pipeteando suavemente para eliminar las células del fondo del matraz, centrífuga a 750 Gs durante cinco minutos para recuperar el pellet de la célula. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de tonicidad de ratón y vuelva a centrifugar a 750 Gs durante cinco minutos. Repita el lavado dos veces más para eliminar el medio que contiene IL3.

Lave las celdas una vez usando medios sin medio acondicionado DEHI-3D. Es importante lavar el medio de cultivo que contiene IL3 para asegurarse de que no queden factores de crecimiento adicionales, lo que podría generar un resultado falso positivo o una alta actividad de fondo. Después de centrifugar y desechar el supernayten, vuelva a suspender las células en el mismo medio libre de IL3 a una concentración de 7,4 veces 10 a la cuarta célula por mililitro.

Finalmente, mezcle volúmenes iguales de azul de tripano en PBS con una población celular y cárguelo en un hematitómetro. Cuente al menos 100 celdas. Las células que absorben el tinte se consideran muertas o moribundas.

Es fundamental que las células utilizadas para el ensayo tengan una alta viabilidad para garantizar que puedan responder a las condiciones del ensayo. Utilice una pipeta automatizada P20 bien calibrada y puntas esterilizadas en autoclave para añadir 1.000 células en 13,5 microlitros de medio deficiente en IL a los pocillos de una placa de 72 pocillos. Tenga cuidado de mezclar la suspensión celular durante la alícuota para asegurarse de que la sedimentación celular por gravedad no sesgue la concentración celular.

Utilice una pipeta P2 bien calibrada para añadir 1,5 microlitros de medios libres de IL3 por triplicado a los pocillos de control. Intrincado para mezclar. De la misma manera, agregue el medio acondicionado WEHI-3D al 10% y el control de 100 nanogramos por mililitro de VegFA sin IL3 a los pocillos deseados.

Por último, añadir 1,5 microlitros de las muestras de prueba por triplicado. Llene los pocillos no utilizados de la placa de micropocillos con agua estéril, PBS o medio. Coloque papel de seda empapado en agua en un recipiente permeable al gas para crear una cámara humidificada que permita el intercambio de gases.

Incubar las placas de ensayo en las cámaras en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 10% durante 16 horas. Después de 16 horas de incubación, analice las placas utilizando un microscopio de fase invertida estándar con un aumento de 40 a 100x. En este momento es posible discriminar entre muestras positivas y negativas.

Los pocillos sin apoyo de factores de crecimiento o con medio solo tendrán un número reducido de células redondas, así como células muertas o moribundas y desechos celulares. Mientras que las células incubadas con medio que contiene IL3 o ligina para VegFR2 son grandes y translúcidas, y no hay evidencia de granularidad en el citoplasma celular o restos celulares en el cultivo. Agregue 10, 000 celdas lavadas en 135 microlitros de medio deficiente en IL3 a los pocillos de una placa estándar de 96 pocillos.

Utilice una pipeta P20 calibrada para añadir 15 microlitros de las muestras de prueba y los controles a los pocillos. Incubar la mezcla de células, factores de crecimiento y/o agentes inhibidores como antes durante 48 horas. Al finalizar el período de incubación, evalúe el número de células viables en los pocillos utilizando los métodos descritos en la parte escrita del protocolo.

Aquí se representan los resultados de un ensayo en el que se utiliza el bioensayo VEGF-R2 EPoR BAF3 para cuantificar la actividad de las tres liginas humanas yacentes con especificidad para VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C y VEGF-D. La actividad se cuantificó en presencia de bevacizumab, un anticuerpo monoclonal inhibidor del VEGF-A165 o en presencia de trastuzumab, un anticuerpo no neutralizante.

Los datos se han normalizado en comparación con la respuesta al VEGF-A165 solo. Como se esperaba, bevacizumab bloqueó el efecto de VEGF-A165 en el ensayo, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad de VEGF-C y VEGF-D. Las células expuestas a IL3 fueron altamente viables.

Mientras que aquellos expuestos a ningún factor de crecimiento adicional muestran poca viabilidad. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que hay una variedad de agentes de control en medios condicionados que deben generarse antes del ensayo. Esta técnica allanó el camino para el resurgimiento en biología vascular, virología, cáncer y opthomología para explorar el papel de VEG-FM en las liginas.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las células del bioensayo, ejecutar el bioensayo y realizar los análisis cuantitativos o semicuantitativos de la actividad de la ligina VEG-FM.