Name: Grabación de ratón de ultrasonidos Las vocalizaciones de Evaluación de la Comunicación Social (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a grabar vocalizaciones ultrasónicas en ratones para evaluar la comunicación social en modelos de trastornos neuropsiquiátricos. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad y permite compartir datos en la base mouseTube.

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Este trabajo fue apoyado por la Fondation de France; por la ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; por la ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; por Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); por la Fondation Orange; por la Fondation FondaMentale; por la Fondation de France; por la Fondation Bettencourt-Schueller. La investigación que ha dado lugar a este artículo también ha recibido el apoyo de la Empresa Común Innovative Medicine Initiative en virtud del acuerdo de subvención n.º 115300, cuyos recursos están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y la contribución en especie de las empresas de la EFPIA. Agradecemos a Julie Lévi-Strauss por sus útiles comentarios sobre el manuscrito y a seis revisores anónimos cuyos comentarios mejoraron notablemente el manuscrito.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí proporciona formas estandarizadas y fiables para recoger las vocalizaciones ultrasónicas de ratones en el laboratorio. Estas situaciones muy restringidas presentan la ventaja de la normalización. Se utilizan con éxito para comparar cepas o genotipos dentro de cepas 18,19,26,27. Como se presenta en los resultados representativos, estos métodos permiten la identificación de la comunicación social atípica en ratones mutados para SHANK2, un gen asociado con trastornos del espectro autista. Las comparaciones entre las cepas de ratón, entre los diferentes contextos o incluso entre laboratorios se desencadenan por la disponibilidad de grandes conjuntos de datos en la base de datos mouseTube. Esta herramienta debería impulsar estudios sobre las vocalizaciones ultrasónicas ratón, permitiendo el análisis multivariado. Los protocolos descritos aquí están optimizados para poner a prueba los ratones de diferentes genotipos dentro de una cepa, como se hace en la mayoría de los estudios de modelado de la c genéticaONTRIBUCIÓN a los trastornos neuropsiquiátricos. Se recomienda diseñar cada estudio experimental para tener los mejores controles posibles. De hecho, los efectos de camada pueden enmascarar o artificialmente inflar efectos genéticos 28,29. Por tanto, es aconsejable incluir controles de la misma camada para cada genotipo. Por lo tanto, la cría de los padres heterocigotos se debe favorecer, ya que permitirá la correcta adecuación de los ratones mutantes y de control dentro de una camada. Esto justifica el marcado de todos los cachorros del tatuaje de la pata (sin conocer el genotipo) para realizar un seguimiento de las personas a través de las grabaciones cada dos días. El genotipado se realiza en el destete, tomando muestras de la cola. Al grabar las llamadas de aislamiento de las crías en P2, que no recomendaría la toma de muestras de la cola ya en las crías, ya que esta operación incluye la manipulación adicional y el estrés muy cerca en el tiempo para una sesión de grabación. Los protocolos sugeridos aquí para provocar vocalizaciones ultrasónicas en los adultos no permite una identificación clara de la EMItter de las vocalizaciones. Esto explica por qué manipulamos la motivación del animal de ensayo. De hecho, los ratones de prueba están aislados y no el recién llegado y los animales de ensayo se habitúan durante mucho tiempo a la jaula de prueba durante las interacciones del mismo sexo. En las interacciones hombre-mujer, la hembra introducido no es aislado y el macho se habitúa prueba por el tiempo más corto ya que la motivación podría ser mayor en este contexto sexual. Estas manipulaciones de la motivación deben maximizar la probabilidad de que el ratón de prueba de emisión de las vocalizaciones y no la introducida. Para grabar vocalizaciones ultrasónicas macho en un contexto sexual, un hisopo de algodón sencilla con la orina (es decir, no congelado) fresco de una hembra estro también se puede introducir en la jaula 30. Este método permite la asignación de vocalizaciones ultrasónicas a la masculina prueba con 100% de certeza pero impide recoger cualquier información específica sobre el contexto social actual de emisión de estas vocalizaciones. Por lo tanto, estamos a favor de la protocol describe aquí (con una hembra estro libremente en movimiento). También recomendamos utilizar siempre los ratones introducido de la misma cepa al probar los ratones de una cepa mutante y analizar los datos como un par de ratones que vocalizan. Un estudio reciente promueve el uso de la triangulación para localizar el emisor 31. En este estudio, se encontró que las hembras también para emitir vocalizaciones ultrasónicas durante los encuentros con un macho. Esto podría explicarse por el hecho de que se aislaron durante al menos dos semanas antes de la sesión de grabación. Sin embargo, la generalización del uso de la triangulación propuesto en este estudio debe permitir la identificación del emisor de las vocalizaciones en la mayoría de los casos, si las grabaciones de vídeo se sincronizan correctamente. Las llamadas de aislamiento de cachorros registrados durante el desarrollo no se vean perturbadas por el ruido de fondo de la ropa de cama. Por lo general, un análisis automático funciona muy bien para extraer las variables principales. Por el contrario, las vocalizaciones grabadas de los adultos son disturbed por el ruido de fondo de los animales que se mueven en la ropa de cama. Análisis automático puede fallar, y por lo tanto el análisis manual debe ser utilizado. Sin embargo, la adición de ropa de cama en la jaula de ensayo deberá proporcionar condiciones que son menos estresante para los animales que el suelo desnudo (que los ratones no les gusta). Más esfuerzos en la comunidad se concentran en mejorar la detección automática de vocalizaciones ultrasónicas en diversas condiciones, incluso aquellas que implican ruidos de fondo. Por ejemplo, el software de voz permite analizar las vocalizaciones que habían sido seleccionados de forma manual por la ausencia de ruido de fondo 32. En este software, la extracción de las variables acústicas es automática sino que necesita la selección manual inicial. Cabe señalar que la variabilidad inter-individual es muy importante en el comportamiento vocal de los ratones. Por ejemplo, el tipo de interés de los hombres adultos en presencia de una hembra estro está muy distribuido (Figura 1). nos Doggest estos protocolos estandarizados para provocar vocalizaciones ultrasónicas ya de limitar la variabilidad relacionada con el contexto experimental. Sin embargo, nos gustaría señalar la importancia de presentar no sólo la media y SEM para los datos, pero lo más importante los puntos individuales en muestras de pequeño tamaño 33. También es muy relevante - si no es necesario - para registrar al menos 12 individuos de cada grupo / genotipo para reunir datos representativos. En muchos casos, la variabilidad interindividual no debe ser ocultada (por lo general no puede ser), y que podría ser de gran importancia para identificar a las personas que llevan la mutación genética estudiada pero no exhiben ningún fenotipo atípico. Tales individuos podrían proporcionar pistas sobre las compensaciones, lo que podría abrir nuevas vías para tratamientos de trastornos genéticos. En la mayoría de las caracterizaciones del comportamiento de los modelos de ratón para los trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento vocal y contactos sociales son considerared aparte (por ejemplo, 19,27,34,35). Métodos de análisis recientes proporcionan ahora una caracterización detallada semi-automático de los eventos sociales y secuencias de eventos durante una interacción (usando MiceProfiler por ejemplo) 36, así como la posibilidad de combinar este análisis con datos de grabaciones de audio. La principal ventaja de este método es proporcionar una visión global de la comunicación social en modelos de ratón de TEA, para identificar con mayor precisión lo que se ven afectados los aspectos de la comunicación social. En el presente protocolo de la sincronización es todavía manual, pero esto puede ser mejorado mediante la activación de la grabación de vídeo a través del software de grabación de audio. Este tipo de análisis debe convertirse en el estándar para proporcionar una visión más completa de los déficits de comunicación social en modelos de ratón de los trastornos neuropsiquiátricos. Además, hasta ahora, las señales vocales se analizan sobre todo desde el lado emisor (es decir, las pruebas se construyen para favorecer la emisión de voseñales de cal por el ratón probado, como en los protocolos actuales). La atención debe centrarse ahora también se puede ajustar en el receptor de estas señales, para identificar mejor las funciones de estas señales acústicas. Esto debe hacerse mediante la evaluación también el comportamiento de los ratones nuevos productores en los protocolos actuales en adultos (usando MiceProfiler por ejemplo) 36, mediante el uso de experimentos de reproducción 16, o mediante la creación de nuevos protocolos. De hecho, los protocolos actuales proporcionan situaciones muy restringidas que podrían no reflejar las condiciones etológicas exactas de las emisiones de vocalización en ratones. La emisión espontánea de vocalizaciones ultrasónicas tendrá que ser mejor caracterizados usando grabaciones de audio y de video continuo para arrojar más luz sobre el comportamiento vocal espontánea de ratones.

Los pacientes con trastornos neuropsiquiátricos suelen mostrar déficits en la comunicación social (por ejemplo, los pacientes con trastornos del espectro del autismo, la esquizofrenia o la enfermedad de Alzheimer) 1. Modificaron genéticamente ratones son cada vez más frecuentemente utilizados para modelar las causas genéticas de estos trastornos 2. El estudio de la comunicación social en estos modelos de ratón es de gran interés para la comprensión de los mecanismos de mutaciones genéticas que conducen a disfunciones sociales atípicas y para probar nuevas terapias. Dado que los ratones son animales sociales y se comunican entre otros usando olfativo, táctil, señales visuales y acústicas, que son modelos adecuados para evaluar la comunicación social. Vocalizaciones ultrasónicas ratón ahora se utilizan actualmente como un proxy para el modelado de las bases genéticas de déficit de comunicación vocal 3,4 (pero la existencia de aprendizaje vocal en esta especie aún se debate 5,6, aunque la mayoría de los estudios recientes ARGUe por la ausencia de aprendizaje vocal 7). Los ratones de laboratorio se han encontrado para emitir vocalizaciones ultrasónicas en las relaciones madre-hijo, en las interacciones socio-sexuales entre hombres y mujeres, en las interacciones sociales del mismo sexo (revisado en referencia 8) y en las interacciones sociales juveniles-juvenil 9. Las crías de ratón emiten llamadas de aislamiento durante sus dos primeras semanas de vida cuando se aíslan de la presa y sus compañeros de camada 10. Los machos emiten vocalizaciones ultrasónicas cuando está en presencia de una hembra estro (o señales urinarios de ella) 11,12. Los machos y las hembras emiten vocalización ultrasónica al interactuar con una misma especie desconocida del mismo sexo 13,14. La organización y funciones de estas vocalizaciones no son del todo claras y necesitan más investigaciones. El conocimiento actual sobre el aspecto funcional se limita a la obtención de un comportamiento de recuperación en las madres escuchar las llamadas de aislamiento de las crías, la facilitación de la proximidad de las hembras adultas hacia vocalizat varón adultoiones 15 y el aumento de la conducta exploratoria de los varones adultos auditivos para adultos vocalizaciones femeninas 16. La caracterización de las alteraciones en la comunicación vocal en modelos de ratón de los trastornos neuropsiquiátricos debe llevarse a cabo en condiciones estandarizadas para descartar la importante contribución de las condiciones experimentales. Tales caracterizaciones, en combinación con la evaluación de las interacciones sociales simultáneas y estudios neurobiológicos, en diferentes modelos genéticos deberían mejorar nuestro conocimiento sobre la contribución genética a los diferentes aspectos de la comunicación ultrasónica del ratón. Durante un largo plazo, debe dar más luz sobre algunas bases neurobiológicas de la comunicación social en los seres humanos. actualmente Nuestro objetivo es proporcionar protocolos sencillos para obtener de forma fiable las vocalizaciones ultrasónicas durante el desarrollo y en la edad adulta, tanto para ratones macho y hembra en el laboratorio. Dichos protocolos deberían facilitar la normalización de las grabaciones para comparar de manera más fiable ultrlas emisiones de vocalización Asonic entre las cepas y laboratorios. También debería facilitar la creación de tales grabaciones en laboratorios que no tienen experiencia previa con vocalizaciones ultrasónicas grabaciones de ratón. También destacamos la posibilidad actual para combinar los datos de vocalizaciones ultrasónicas con los datos detallados de comportamiento recogidos de forma simultánea durante las interacciones sociales en ratones adultos, para obtener información crucial sobre deficiencias sociales, así como en el contexto de la emisión de vocalizaciones ultrasónicas. Tales análisis arrojen nueva luz sobre la organización y funciones de las vocalizaciones ultrasónicas de ratón. Por último, también publicidad de la posibilidad de compartir las grabaciones de vocalización ultrasónica con toda la comunidad científica sobre la base de datos mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). El acceso abierto a los datos de grabación de audio debe aumentar el conocimiento sobre la comunicación ultrasónica del ratón, permitiendo a los científicos comparar sus propios datos con vocalizaciones ultrasónicas registradas en otras laboratorios (con cepas / protocolos similares o diferentes), y / o para desafiar a sus métodos de análisis con archivos grabados en diferentes condiciones.

<table><tbody><tr><td>agujas de 0,3 mm x 13 mm [30&nbsp; G 1/2"]</td><td>BD Microlance</td><td>304000-pasta</td> <td>de</td></tr> <tr><td>tatuaje verde</td><td>Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canadá</td><td>329AA-termómetro</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisherbrand, Waltham, USA</td><td>4126 (W255NA)</td><td>-</td></tr><tr><td>cámara insonorizada de fabricación propia (pups)</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>París-espuma</td> <td>acústica + plexiglás; dimensiones interiores (ancho x alto x fondo): 32 cm x 33 cm x 32 cm</td></tr><tr><td>termimador de superficie pequeña + termopar de una sola sonda</td><td>Harvard Apparatus 599814</td><td>+ bolígrafo</td><td></td></tr> <tr><td>601956 inodoro</td>, <td>por ejemplo: Giotto-tinta</td><td></td> <td>hecha con agua, lavable: estos bolígrafos están diseñados para bebés</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (100%)</td><td>Sigma Aldrich,&nbsp; Saint-Quentin Fallavier, Francia</td><td>24103</td><td>diluido 1/10</td></tr><tr><td>Micrófono de ultrasonido de condensador Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#40011</td><td>equipado con cables de extensión de la empresa</td></tr><tr><td>Avisoft Ultrasound Gate 416H</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#34163</td><td>tarjeta de sonido</td></tr><tr><td>Avisoft Recorder USGH</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#10301; #10302</td><td>software de grabación para Windows Vista, 7 y 8</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab Pro</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#10101, 10111; #10102, 10112; &nbsp;</td><td>Windows 10, 8.1, 8, 7 o Vista, incluido Apple Macintosh basado en Intel con Boot Camp, Parallels o software de virtualización similar.</td></tr><tr><td>Computadora portátil o Apple Macintosh con Boot Camp</td><td>:</td><td></td> <td>con Windows 10, 8.1, 8, 7 o Vista; para Apple Macintosh, se prefiere Boot Camp a los softwares de virtualizaciones como Parallels debido a las limitaciones de memoria receptor de</td></tr><tr><td>plástico (grabaciones pup)</td><td>Lock & Lock, Chatswood, Estados Unidos</td><td>HPL932D</td><td>Lock & Contenedor hermético apilable con cerradura redondo 700&nbsp; Ml; úselo sin la cubierta; Dimensiones: 9&nbsp; cm de diámetro, 10 cm de altura</td></tr><tr><td>PBS 1x (pH = 7,4)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10010-023-diapositivas</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Menzel-Gl&auml; ser, Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald solución 500 ml</td><td>RAL R&eacute; actifs, Martillac, Francia</td><td>320070-0500-Giemsa</td><td></td></tr> <tr><td>R 500 ml</td><td>RAL R&eacute; actifs, Martillac, Francia</td><td>720-1107</td><td>diluido 1/20 en solución tampón</td>de</tr><tr><td>fosfato solución tampón de fosfato (de fabricación propia)</td><td>-</td><td>-</td><td>pH = 7, 0,1 M: 39 ml NaH2PO<>4 0,2 M + 61 ml Na2HPO4 0,2 M + 100&nbsp; ml H2O (volumen final: 200&nbsp; ml)</td></tr><tr><td>jaula de prueba</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>París-50</td><td>&nbsp; x&nbsp; 25&nbsp; cm, 30&nbsp; cm de altura; </td></tr><tr><td>Cámara insonorizada de plexiglás de fabricación propia (grabaciones para adultos)</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>París-espuma</td> <td>acústica + PVC; dimensiones interiores (ancho x alto x fondo): 66 cm x 90 cm x 46 cm</td></tr><tr><td>cámara de vídeo</td><td>de Noldus Information Technologies, Wageningen, Países Bajos-cámara de</td><td></td> <td>vídeo CamTech Super-Hi-Res de alta resolución; 25 fps&nbsp;</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus Information Technology, Wageningen, Países Bajos</td><td>http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td><td>software de adquisición de vídeo</td></tr><tr><td>Mice Profiler Tracker plugin de la plataforma ICY</td> Bio <td>Image Analysis, Institut Pasteur, París</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker</td><td>software de seguimiento para analizar eventos de comportamiento durante las interacciones sociales</td></tr></tbody></table>

grabación de ratón de ultrasonidos las vocalizaciones de evaluación de la comunicación social

Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication

Los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas en diferentes contextos a lo largo del desarrollo y en la edad adulta. Estas señales vocales se utilizan actualmente como sustitutos para modelar las bases genéticas de los déficits de comunicación vocal. Caracterizar el comportamiento vocal de modelos de ratón portadores de mutaciones en genes asociados con trastornos neuropsiquiátricos, como los trastornos del espectro autista, ayudará a comprender los mecanismos que conducen a los déficits de comunicación social. Proporcionamos aquí protocolos para provocar vocalizaciones ultrasónicas de forma fiable en cachorros y en ratones adultos. Esta estandarización ayudará a reducir la variabilidad entre estudios debido a los entornos experimentales. Las llamadas de aislamiento de las crías se registran durante todo el desarrollo de las crías individuales aisladas de la madre y los compañeros de camada. En la edad adulta, las vocalizaciones se registran durante las interacciones entre personas del mismo sexo (sin un componente sexual) al exponer a hombres o mujeres socialmente motivados a un congénere desconocido del mismo sexo. También proporcionamos un protocolo para registrar las vocalizaciones de los machos adultos expuestos a una hembra en celo. En este contexto, hay un componente sexual en la interacción. Estos protocolos se establecen para provocar una gran cantidad de vocalizaciones ultrasónicas en ratones de laboratorio. Sin embargo, señalamos la importante variabilidad interindividual en el comportamiento vocal de los ratones, que debe tenerse en cuenta registrando un número mínimo de individuos (al menos 12 en cada condición). Estas grabaciones de vocalizaciones ultrasónicas se utilizan para evaluar la velocidad de llamada, el repertorio vocal y la estructura acústica de las llamadas. Los datos se combinan con el análisis de grabaciones de vídeo sincrónicas para proporcionar una visión más completa de la comunicación social en ratones. Estos protocolos se utilizan para caracterizar los déficits de comunicación vocal en ratones que carecen de ProSAP1/Shank2, un gen asociado con trastornos del espectro autista. También se pueden encontrar más grabaciones de vocalizaciones ultrasónicas en la base de datos mouseTube, desarrollada para favorecer el intercambio de dichos datos.

Con los protocolos actuales, que caracteriza el comportamiento vocal de los ratones que carecen ProSAP1 / SHANK2, un gen asociado con trastornos del espectro autista (TEA) 23-25. TEA se caracteriza por déficits en la comunicación social y los comportamientos estereotipados 1. Nuestros SHANK2 - / - ratones muestran hiperactividad, aumento de la ansiedad y la comunicación vocal atípica 18,26. De hecho, hemos observado que SHANK2 - / - ratones muestran un perfil de desarrollo atípico en su tasa de emisión de llamadas de aislamiento de las crías en comparación con la típica curva en forma de U invertida en sus compañeros de camada de tipo salvaje SHANK2 -. / - Ratones muestran una tasa de llamadas aumento en P4 y disminución de la tasa de llamadas en P6 en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 2). También se observó una tasa de llamadas disminución en las interacciones femeninas que implica un SHANK2 - / - femenino en COMPARACIÓNn con las interacciones que implican una camada de tipo salvaje (Figura 2). Se examinó el repertorio de los 5 diferentes categorías de llamadas. Parecía ser diferente entre las crías (por ejemplo aquí P2, P6 y P10) y adultos (Figura 3). diferencias relacionadas con el genotipo fueron significativos sobre todo en la edad adulta. Durante las interacciones sociales que involucran adultos SHANK2 - / - machos o hembras con una hembra C57BL / 6N, se registraron llamadas más cortas y llamadas no estructurados en comparación con las interacciones que implican sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 3D y E). Las llamadas de menor complejidad y frecuencia de saltos también se registraron llamadas durante las interacciones con una hembra C57BL / 6N que implica SHANK2 adultos - / - hembras en comparación con las interacciones que implican SHANK2 + / + hembras (Figura 3E). Por último, también medimos las variables acústicas manualmente. No hubo significativo relacionado con el genotipo-du diferenciadesarrollo anillo. Por el contrario, la duración de las llamadas registradas durante las interacciones que implican SHANK2 adultos - / - hembras eran más cortos que los registrados durante las interacciones que implican sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 4A). También destacamos que el pico de frecuencia de vocalizaciones ultrasónicas se incrementó durante el desarrollo de las crías, sin diferencia significativa relacionada con el genotipo-26. Durante las interacciones que implican SHANK2 - / - machos o hembras con una hembra C57BL / 6N, vocalizaciones ultrasónicas tenían una frecuencia pico más bajo en comparación con las llamadas grabadas durante las interacciones que implican sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 4B). Además, el presente protocolo también permitió estudiar el contexto de la emisión de vocalizaciones ultrasónicas mediante la combinación de los datos de las grabaciones de audio a los datos de comportamiento extraídos de MiceProfiler (software helado, Institut Pasteur, París). Por ejemplo, en las interacciones entre las hembras, la mayoría de las vocalizaciones ultrasónicas se emiten cuando los animales estaban en contacto y más específicamente el ocupante olfateando región ano-genital del recién llegado, o al menos el ocupante estar detrás del recién llegado. Los ratones también emite muchas vocalizaciones ultrasónicas cuando el ocupante se acercó al recién llegado (Figura 5, panel superior). Menos vocalizaciones se registraron cuando el ocupante SHANK2 - / - ratones estaban en contacto físico con el recién llegado (por ejemplo, olfateando la región ano-genital del recién llegado) que cuando el ocupante era un ratón de tipo salvaje. Menos vocalizaciones se desencadenaron cuando el ocupante detrás del recién llegado era un SHANK2 - / - ratón que cuando era un ratón de tipo salvaje. Más vocalizaciones se registraron también cuando el recién llegado estaba en el campo visual del ratón de los ocupantes, y más aún en los tipos silvestres que en los mutantes (Figura 5, panel inferior). s = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig2.jpg" /> Figura 2:. Índice de emisión de vocalizaciones ultrasónicas durante el desarrollo y en el adulto de sexo masculino y femenino SHANK2 - / - de tipo salvaje ratones hermanos de camada y llamada tasa de crías (cada dos días a partir de P2 a P12, n = 18-19 SHANK2 + / +, n = 15-16 SHANK2 - / -) y adultos durante el macho-hembra en estro interacciones (n = 15 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / -) y las interacciones hembra-hembra (n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 - / -) en ratones de tipo salvaje (panel izquierdo) y SHANK2 - / - ratones (panel derecho). Los datos se presentan como media +/- SEM y puntos individuales (no apareados prueba de Wilcoxon: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001).ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig3.jpg" /> Figura 3:. Repertorio vocal de SHANK2 - / - ratones y de tipo salvaje de camada proporciones de los cinco tipos de llamada diferentes emitidas por cachorros P2 (A; n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), crías P6 (B, n = 19 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), los cachorros P10 (C; n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), machos adultos con una hembra estro (D ; n = 16 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / -) y adultos hembras con otra hembra (e; n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 </em&gt; - / -) en ratones de tipo salvaje (paneles de la izquierda) y SHANK2 - / - ratones (paneles de la derecha). Los datos se presentan como media +/- SEM y puntos individuales (pruebas de chi-cuadrado: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig4.jpg" /> Figura 4:. Las variables acústicos extraídos de vocalizaciones ultrasónicas en SHANK2 - / - ratones y de tipo salvaje hermanos de camada (A) Duración de todos los tipos de llamadas confundido emitida por cachorros P2 (n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / - ), crías de P6 (n = 19 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), los cachorros P10 (n = 20 SHANK2 + / + </sarriba&gt;, n = 18 SHANK2 - / -), los machos adultos con una hembra estro (n = 16 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / - hembras) y adultos con otra hembra (n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 - / -) en ratones de tipo salvaje (panel izquierdo) y SHANK2 - / - ratones (panel derecho). (B) Frecuencia máxima de pico medida en todos los tipos de llamadas confundió en crías de cachorros P2, P6, P10, las crías machos adultos con una hembra estro y la hembra adulta con otra hembra (Ns mismo que el anterior). Los datos se presentan como media +/- SEM y puntos individuales (no apareados de Wilcoxon prueba: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig5.jpg" /> Figura 5: Contexto. s de emisión de vocalizaciones ultrasónicas de ratón en las interacciones adultos hembra-hembra sociales Proporción de vocalizaciones ultrasónicas emitidas por pares que implican un SHANK2 + / + con un ratón C57BL / 6N (n = 16, A) y pares que implican un SHANK2 - / - con a / ratón C57BL 6N (n = 13, B) durante los siguientes tipos de eventos conductuales (rojo: los ocupantes, verde: recién llegado): contactos sociales, oro-oral de contacto, inhalación de ano-genital desde el ratón ocupante, ano- genital de oler en el ratón recién llegado, los ocupantes detrás recién llegado, recién llegado detrás de los ocupantes, la inmovilidad de los ocupantes, la inmovilidad del recién llegado, el enfoque de los ocupantes y escapar del recién llegado, el enfoque del recién llegado y escapar del ocupante, el enfoque y escapar del ocupante, el enfoque y escapar del recién llegado, los ocupantes tras el recién llegado, recién llegado en el campo de visión del ocupante, de los ocupantes en el campo de visión del recién llegado. Los datos son presentido como media +/- SEM y puntos individuales (pruebas no apareados de Wilcoxon: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01). Los datos no publicados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tipos de llamadas </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> corto </td><td> ≤5 ms de duración y frecuencia gama ≤6.25 kHz </td></tr><tr><td> sencillo </td><td> duración&gt; 5 ms y la frecuencia de gama ≤6.25 kHz (plana), o la modulación de frecuencia en una sola dirección (hacia arriba o hacia abajo) con la frecuencia de gama&gt; 6,25 kHz </td></tr><tr><td> complejo </td><td> modulaciones de frecuencia en más de una dirección y la frecuencia gama&gt; 6,25 kHz (modulada), o la inclusión de uno o más adicional de frecuencia component (fenómenos armónicos o no lineal, pero no de saturación) pero no limitación en rango de frecuencia (complejo) </td></tr><tr><td> saltos de frecuencia </td><td> inclusión de un salto (un salto de frecuencia) o más saltos (saltos de frecuencia, otros) en la frecuencia y sin intervalo de tiempo entre los componentes de frecuencia consecutivos, con (mixta) o sin ninguna parte ruidosa dentro de la convocatoria de tonos puros </td></tr><tr><td> no estructurada </td><td> no identificable componente de tono puro; llamadas &quot;ruidosos&quot; </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Características de los cinco tipos de vocalizaciones ultrasónicas ratón Ejemplos de criterios de duración, rango de frecuencia, modulación de frecuencia y de saltos de frecuencia utilizadas para determinar 5 tipos de llamada diferentes dentro de vocalizaciones ultrasónicas de ratón.

Las vocalizaciones ultrasónicas de ratón se utilizan como sustitutos para modelar las bases genéticas de los déficits de comunicación vocal en modelos de ratón para trastornos neuropsiquiátricos. El presente protocolo describe tres contextos experimentales que provocan vocalizaciones ultrasónicas de forma fiable de cachorros (a lo largo del desarrollo) y ratones adultos (interacciones entre personas del mismo sexo, interacciones macho-estro para hembras).

Grabación de ratón de ultrasonidos Las vocalizaciones de Evaluación de la Comunicación Social

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies ...

El objetivo general de este protocolo es registrar y analizar las vocalizaciones ultrasónicas de cachorros de ratón o adultos, y luego poner los datos a disposición del público en la base de datos de mouseTube. Anteriormente identificamos mutaciones en el autismo, así que ahora queremos entender el papel de estos genes. Estamos utilizando modelos de ratón y, especialmente, estamos estudiando la vocalización ultrasónica de ratones.Este modelo puede ayudar a comprender preguntas clave en el campo de la neurociencia. Por ejemplo, cómo las mutaciones genéticas afectan la comunicación social en un modelo de ratón para trastornos neuropsicóticos como el autismo. La principal ventaja de este protocolo es que la vocalización de direccionamiento del ratón se obtiene de forma fiable.Debe favorecer una estandarización de la información de contexto para mejorar la comparación entre los estudios. Este método también aumentará el conocimiento sobre la comunicación intrasónica del ratón utilizando la base de datos mouseTube. Después de preparar a los ratones y obtener cachorros recién nacidos, instale una jaula para grabar sus llamadas.Use una caja insonorizada o una caja de espuma de poliestireno. Primero, configure un termómetro para controlar la temperatura interna. A continuación, a través de un orificio en la parte superior de la caja, baje un micrófono de ultrasonido de condensador de modo que la membrana del micrófono quede entre 12 y 15 centímetros por encima del suelo.Ahora, conecte el micrófono a la tarjeta de sonido de una computadora. Coloque el cachorro no experimental en un soporte de plástico limpio para cachorros dentro de la caja de grabación y ciérrelo. Haga que el sonido máximo de grabación utilice toda la amplitud disponible sin distorsión.No cambie esta configuración durante el experimento. Ahora, para mediciones experimentales, coloque al cachorro lo más suave y rápido posible en un vaso de plástico limpio. Luego, coloque al cachorro debajo del micrófono y cierre la caja lo más suave y silenciosamente posible.A continuación, realice una grabación de 16 bits y 300 kilohercios para obtener un conjunto de datos de alta calidad. Después de hasta cinco minutos de grabación, retire el cachorro. Toma nota de su tatuaje de pata y luego mide la temperatura de su piel con un termómetro digital.Ahora, haz una pequeña marca en el cachorro con tinta a base de agua y devuélvelo a su nido. Entre prueba y prueba, lave la copa con etanol al 10% y deje que se seque por completo. Para una jaula de prueba para adultos, use una jaula de plexiglás que quepa en una caja insonorizada iluminada con luz blanca de baja intensidad.Limpia la jaula con agua jabonosa, sécala y llénala con dos centímetros de ropa de cama fresca. Fije el micrófono en una esquina de la jaula y ajuste el ángulo del micrófono para capturar los sonidos de toda la jaula. A continuación, coloque una cámara de vídeo sobre la cámara insonorizada para que vea la superficie de la jaula de pruebas sin que el micrófono oscurezca una esquina.Usando un par de animales no experimentales, establezca la ganancia de la grabación como antes. Para el experimento, introduzca primero un animal en la jaula para que desempeñe el papel de ocupante. Deja que se habitúe durante 20 minutos.Se puede realizar un registro de referencia durante este tiempo. Luego, comience las grabaciones de video y audio, y presente al segundo animal del mismo sexo para que ocupe el papel de recién llegado. Sincroniza las grabaciones activando un pitido a medida que el segundo toca el armazón.Registre las interacciones de los animales durante el tiempo que sea necesario, por ejemplo, cuatro minutos. Para prepararse para esta prueba, temprano en la mañana del día de la prueba, tome frotis vaginales de cada mujer para determinar su estado en el ciclo de celo. Sostén a la hembra por la cola y deja que agarre la rejilla de la jaula.Con una pipeta, enjuague su vagina varias veces inyectando y recoja 20 microlitros de PBS. Preste atención al PBS cuando se expulse de la vagina. Cuando está ligeramente turbio, contiene suficiente celda.Hazlo con cuidado para evitar la formación de mucosidad. Extienda la muestra en un portaobjetos. Se pueden examinar hasta cuatro a la vez.Deje que las muestras se sequen antes de continuar. Bajo una campana extractora, incubar los portaobjetos en un baño de solución de May-Grunwald 0,1 molar en PBS durante tres minutos. Luego, transfiera los portaobjetos a un baño PBS durante un minuto.A continuación, transfiera los portaobjetos a un baño de 5%peso por volumen Giemsa R en PBS. Después de 10 minutos, enjuague los portaobjetos en PBS fresco durante un minuto más. Luego, examina los portaobjetos manchados.Si la muestra muestra solo células epiteliales grandes y cornificadas que no tienen núcleo y se tiñen de azul, la hembra está en celo completo. Solo estas hembras pueden ser utilizadas para la prueba. Ahora, configure la jaula de prueba con el macho como ocupante.Permítale habituarse durante 10 minutos y tome una grabación de audio de referencia si es necesario. Luego, inicie las grabaciones de video y audio e introduzca a la hembra en celo completo. Sincronice los registros como antes usando un pitido.Luego, deje que los animales interactúen durante el tiempo que sea necesario, como un período de cuatro minutos. Cuando se complete la grabación, regrese a los ratones a sus jaulas respectivas. Para cargar datos en el sitio web de mouseTube en el Institut Pasteur, primero inicie sesión.Compruebe si la cepa del ratón registrada existe en la base de datos de mouseTube haciendo clic en el botón Straas. Si no es así, pida a los administradores que lo creen. A continuación, crea sujetos animales.Introduzca los códigos de identificación de los animales registrados. Reúnalos en grupos para facilitar la recuperación posterior de datos. A continuación, proporcione una descripción del protocolo utilizado.Ahora, crea un experimento para cada sesión de grabación. Especifique el protocolo, el grupo de individuos que se ha registrado, el hardware y el software utilizados y sus especificidades. El experimento reúne todos los metadatos correspondientes a los archivos de vocalización.A continuación, crea el enlace a los archivos de vocalización. En primer lugar, seleccione el experimento dentro de la lista. A continuación, copie y pegue la URL del archivo de vocalización en el campo correspondiente de la columna Archivos para vincular.Es posible que el enlace que está colocando a esta base de datos no esté realmente bien. Asegúrese de que el servidor que aloja sus archivos de vocalización sea accesible desde fuera de su institución para los miembros de la comunidad. En Detalles, en la sección Notas, para proporcionar según sea necesario.Por ejemplo, especifique que se ha introducido un enlace a un archivo de vídeo que acompaña a un archivo de audio. Por último, después de realizar las entradas, validarlas. No es necesario rellenar cada casilla para cada archivo.Según sea necesario, modifique los enlaces introducidos. Se caracterizaron ratones que carecían de expresión de Shank2, un gen asociado con trastornos del espectro autista. Estos ratones mostraron una comunicación vocal atípica, observable por primera vez como una disminución de la tasa de llamada en las interacciones femeninas.A continuación, se evaluó el repertorio estándar de cinco llamadas que cambian desde la edad de cachorro hasta la edad adulta. Las mediciones se realizaron por primera vez con cachorros P2. El repertorio vocal no cambió en los cachorros de P6.En P10, el repertorio vocal seguía siendo el mismo. Hasta este punto, no había mucho déficit mostrado por los ratones nulos Shank2. Sin embargo, en la edad adulta, las diferencias relacionadas con el genotipo se hicieron evidentes.Cuando los machos interactuaron con las hembras en celo, hubo un aumento notable de la proporción de llamadas cortas y no estructuradas realizadas por los machos mutantes. En los patrones de llamada escuchados entre hembras, las hembras nulas Shank2 emitieron llamadas más cortas y no estructuradas, así como llamadas menos complejas y menos llamadas con salto de frecuencia cuando se emparejaron con hembras normales. Los ratones Shank2 nulos emparejados, machos o hembras, vocalizaron con una frecuencia máxima más baja en comparación con las parejas de compañeros de camada de tipo salvaje.La sincronización del análisis de los eventos conductuales y la emisión de vocalizaciones permitió identificar deficiencias en el contexto de la emisión de vocalizaciones ultrasónicas en ratones mutantes. Los ratones Shank2 null vocalizaban con menos frecuencia cuando estaban en contacto físico con los recién llegados, y más específicamente cuando olfateaban la región anogenital. Se escucharon más vocalizaciones cuando los recién llegados estaban en el campo visual de los ratones nulos Shank2.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo grabar las vocalizaciones ultrasónicas del mouse y cargar datos en la base de datos de mouseTube. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe registrar suficiente precondición individual dada la altura y la viabilidad interna de la barrera vocal del ratón.

recording-mouse-ultrasonic-vocalizations-to-evaluate-social

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Las vocalizaciones ultrasónicas (USV) en ratones difieren según la edad, el sexo, la condición y los antecedentes genéticos. Utilizando dos emisores de ultrasonido que emiten simultáneamente en diferentes ubicaciones, esta prueba de dos opciones puede evaluar el reconocimiento murino y las respuestas de preferencia a diferentes características de los USV.

La determinación de Preferencias ultrasónico Vocalización en ratones utilizando una prueba de reproducción de dos elección

Los ratones producen un complejo repertorio multisilábico de vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Estos USVs son ampliamente utilizados como lecturas de trastornos neuropsiquiátricos. Este protocolo describe algunas de las prácticas que aprendimos y desarrollamos para inducir, recopilar y analizar consistentemente las características acústicas y la sintaxis de las canciones del ratón.

Eliciando y analizando canciones masculinas de vocalización ultrasónica (USV)

Las vocalizaciones ultrasónicas de ratas y ratones de laboratorio (USVs) son útiles para estudiar la función vocal y neural. Este protocolo describe un paradigma de recompensa alimento que provoca de forma fiable los USVs apetitosos sin confusión relacionada con el apareamiento. Detalla el condicionamiento animal, la presentación de estímulos, el registro y el análisis acústico, proporcionando un método reproducible para estudiar la función afectivo-motivacional y sensoriomotora craneal.

Provocación anticipatoria de recompensa alimentaria de vocalizaciones ultrasónicas apetitivas en ratas y ratones de laboratorio

Las investigaciones anteriores sobre la dimensión social del estrés se han centrado en dos variables importantes: la identidad social y el apoyo social. Este protocolo introduce una manipulación experimental efectiva de estas dos variables sociales y describe su implementación en un paradigma estándar de inducción de estrés (Test de Estrés Social de Trier).

La dimensión social del estrés: Manipulaciones experimentales de Apoyo Social e Identidad Social en el Trier Social Estrés Prueba

La memoria de trabajo predice una cantidad significativa de varianza para una variedad de tareas cognitivas, incluyendo hablar, leer y escribir. Sin embargo, hay pocas herramientas disponibles para evaluar la memoria de trabajo en los niños. Presentamos una innovadora batería basada en computadoras que evalúa exhaustivamente los diferentes componentes de la memoria de trabajo en niños en edad escolar.

Evaluación de la Memoria de Trabajo en Niños: La Evaluación Integral de la Batería para Niños - Memoria de Trabajo (CABC-WM)

Se introduce un inalámbrico, sistema bidireccional de nervios grabaciones de canales múltiples y la estimulación en comportarse libremente las ratas. El sistema es ligero y compacto, teniendo así un impacto mínimo en el repertorio conductual de la animal´s. Por otra parte, este sistema bidireccional proporciona una sofisticada herramienta para evaluar las relaciones causales entre patrones de activación cerebral y el comportamiento.

Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

Aquí presentamos un protocolo para la administración de la calificación hace referencia a video de recíproco comportamiento social (vrRSB) utilizando un papel o una versión en línea. Este estudio cuantifica RSB, un prerrequisito para la competencia social, en los niños pequeños a través de artículos de "video-hace referencia a" por el que un sujeto se compara a un niño de referencia que se muestra en un video de tres minutos.

Uso de un Video que ancla para evaluación rápida Serial de Comunicación Social en niños pequeños

Este papel describe una tarea de priming semántico ERP utilizando pares dentro de la modalidad de imágenes y palabras para investigar el procesamiento semántico en individuos con trastorno del espectro autista (TEA).

Una Priming semántico relacionado con el evento potencial (ERP) tarea estudiar procesamiento Visuo-semántico y léxico-semántico en el trastorno del espectro autista

El paradigma de mundo visual controla movimientos oculares de los participantes en el espacio de trabajo visual que están escuchando o hablando una lengua hablada. Este paradigma puede utilizarse para investigar el procesamiento en línea de una amplia gama de preguntas psicolingüísticas, incluyendo instrucciones semánticamente complejas, como disyuntiva.

Utilizar movimientos oculares registrados en el paradigma de mundo Visual para explorar el procesamiento en línea del lenguaje hablado

Presentamos a una guía visual a las conductas de defensa de la enfermedad en hormigas cortadoras, con clips individuales y definiciones que lo acompaña, en un escenario de infección experimental. Nuestro principal objetivo es ayudar a otros investigadores a reconocer comportamientos defensivos claves y proporcionar un entendimiento común para la investigación futura en este campo.

Una guía Visual para el estudio de las defensas contra comportamiento patógeno ataca en hormigas cortadoras

Aprende a grabar vocalizaciones ultrasónicas en ratones para evaluar la comunicación social en modelos de trastornos neuropsiquiátricos. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad y permite compartir datos en la base mouseTube.

Grabación de ratón de ultrasonidos Las vocalizaciones de Evaluación de la Comunicación Social

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