La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

El objetivo general de aplicar estos enfoques de inmunoprecipitación de cromatina a células madre embrionarias en diferenciación o a tejidos embrionarios cardíacos es descubrir la regulación epigenética del desarrollo cardíaco. Dado que el ajuste fino de la transcripción génica durante el desarrollo del cordón embrionario está regulado por componentes epigenéticos, la inmunoprecipitación de cromatina es un enfoque adecuado para comprender este proceso.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos dirigirnos específicamente a un locus y observar las marcas epigenéticas que se encuentran en ese fragmento específico de ADN. Este método puede proporcionar información sobre la regulación epigenética del desarrollo cardíaco. También puede aplicarse a otros órganos o a cualquier tipo de célula.

Esta es Imen. Ella es estudiante de doctorado en el laboratorio y realizaría el experimento hoy. Este procedimiento utiliza células madre embrionarias o células ES.

Cuerpos embrioides generados a partir de células ES y tejidos cardíacos embrionarios disecados de embriones de ratón E9.5. Fije las células y los tejidos. Utilice formaldehído al 1 % en PBS para las células y tampón de permeabilización PB2 para los tejidos embrionarios.

Coloque los tubos en un agitador orbital a una velocidad de 60 RPM a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos. Detenga la reacción de reticulación añadiendo glicina hasta una concentración final de 125 milimolar e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente en el agitador orbital a una velocidad de 60 RPM. Para comenzar este procedimiento, re suspenda el precipitado en 10 mililitros de PBS.

Y los tejidos embrionarios en un mililitro de PB2. Centrifugar a 1000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante y añadir el tampón respectivo para un segundo lavado.

Añada inhibidores de proteasas a los tampones PB1 y PB2 sobre hielo. Añada un mililitro de tampón PB1 suplementado con inhibidores de proteasas al pellet celular y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células. De la misma manera, resuspenda los tejidos embrionarios en un mililitro de tampón PB2 suplementado con inhibidores de proteasas.

A continuación, utilice una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 21 para homogeneizar las células o los tejidos. Transfiera la suspensión celular a un tubo limpio de 1,5 mililitros. Incube las células y tejidos homogeneizados a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

Centrifugar a 3000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 300 microlitros del tampón de sonicación respectivo, suplementado con inhibidores de proteasas. Transferir la suspensión celular a un tubo certificado como libre de RNasa, DNasa y pirogénos para prevenir cualquier degradación del ADN e incubar de 15 a 30 minutos en hielo.

Para romper la cromatina, sonicar las muestras a cuatro grados Celsius utilizando el programa de sonicación adecuado para cada material. Ajustar la duración de la sonicación según si el ADN se utilizará para PCR o secuenciación. A continuación, centrifugar los lisados celulares sonicados durante 10 minutos.

Transfiera el sobrenadante, que es la cromatina en solución, de cada muestra a un tubo limpio de 1,5 mililitros y deseche el precipitado. Tome una alícuota de 1,5 microlitros de cada muestra y dilúyala 1:10 con agua. Evalúe la densidad óptica de todas las muestras en un nanoespectrofotómetro para determinar la concentración de proteína.

Antes de la inmunoprecipitación de cromatina, prepare perlas conjugadas con proteína A lavándolas según se describe en el texto del protocolo. En un tubo limpio de 1,5 mililitros, combine el anticuerpo generado contra histonas modificadas o factores de transcripción, 20 microlitros de perlas conjugadas con proteína A lavadas y un mililitro de tampón C suplementado con inhibidores de proteasas. Incube las muestras en un rotador a 40 RPM durante al menos dos horas a cuatro grados Celsius.

Lave los complejos de anticuerpo y perlas tres veces con un mililitro de tampón C según se describe en el texto del protocolo. Prepare dos tubos, uno que contenga 150 microgramos de cromatina y complejos de anticuerpo y perlas, y el otro que contenga 150 microgramos de cromatina y 20 microlitros de perlas lavadas. Añada un mililitro de tampón C suplementado con inhibidores de proteasas a cada tubo e incube las muestras en una rueda rotatoria a 40 RPM durante la noche a cuatro grados Celsius.

Una vez finalizada la inmunoprecipitación nocturna, coloque las muestras en el soporte magnético y recupere el sobrenadante que contiene el cromatina con anticuerpo no unido. Eluya la proteína unida al anticuerpo añadiendo 150 microlitros del tampón D1 a los materiales lavados. Incube las muestras durante 20 minutos a 50 grados Celsius en un bloque calefactor.

Después de 20 minutos, retire las muestras del bloque calefactor y colóquelas en el soporte magnético. Recupere el sobrenadante en un tubo limpio de 1,5 mililitros y deseche las perlas. Para revertir el entrecruzamiento, agregue cloruro de sodio 5 M al sobrenadante para obtener una concentración final de 200 milimolar.

Prepare una muestra de entrada de cromatina en un tubo limpio de 1,5 mililitros. Utilice la misma cantidad de cromatina que la muestra de inmunoprecipitación en un volumen final de 150 microlitros de agua libre de RNasa y DNasa y cloruro de sodio 5 M hasta una concentración final de 200 milimolar. Incube las muestras durante la noche a 65 grados Celsius.

Al día siguiente, retire las muestras del bloque calefactor. Añada EDTA hasta una concentración final de 12,5 milimolar y proteinasa K hasta una concentración final de 250 microgramos por mililitro, y realice la digestión a 55 grados Celsius durante dos horas. Comience este procedimiento preparando las perlas.

Primero, deje que las perlas alcancen la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Luego, vortexe las perlas muy cuidadosamente y pipetee rápidamente un mililitro de perlas hacia un tubo limpio de 1,5 mililitros. Coloque el tubo con las perlas sobre el imán durante dos a tres minutos para que la solución se aclare y deseche el sobrenadante.

Retire el tubo del imán. Añada un mililitro de EDTA 0,5 M y mezcle mediante vortex breve. Lave las perlas dos veces de esta manera y deseche el sobrenadante después del lavado final.

Retire el tubo del imán. Añada un mililitro de tampón E y resuspenda lentamente las perlas. Transfiera toda la mezcla a 50 mililitros de tampón E. Coloque en un agitador y deje mezclar lentamente a temperatura ambiente durante una hora.

Posteriormente, pruebe las perlas de unión al ADN utilizando un marcador de ADN de un KB y tres proporciones diferentes de volumen de perlas respecto al volumen de ADN. Se determinó que la proporción 2,5/1 funciona mejor para la unión al ADN. Para utilizar las perlas en la purificación de ADN, agregue 425 microlitros o 2,5 volúmenes de las perlas a cada muestra de ADN y resuspenda lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.

Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Colocar sobre el imán durante cinco minutos. Luego aspirar y desechar el sobrenadante.

Lave dos veces con etanol al 80% recién preparado, añadiendo 600 microlitros a cada tubo. Espere un minuto, luego aspire y deseche el sobrenadante. Gire los tubos brevemente.

Coloque los tubos en el imán. Retire las últimas gotas de etanol y deje secar durante un minuto a temperatura ambiente. Retire la muestra del imán y eluya el ADN añadiendo 20 microlitros de agua libre de DNasa y RNasa. Vortex.

La electroforesis en gel de agarosa reveló los tamaños de los fragmentos de ADN obtenidos tras la descrosslink inversa del ADN sonicado completo extraído de células ES de ratón, cuerpos embrionoides y tejido cardíaco embrionario. Se diseñó un experimento de inmunoprecipitación de cromatina para analizar la regulación epigenética de los genes de transición epitelial-mesénquima en células de tipo salvaje o con mutaciones genéticas, cuando las células ES se diferencian hacia un destino celular mesodérmico. La unión de histonas modificadas se monitoreó mediante PCR de los promotores o potenciadores de los genes E-Cadherina y Twist.

Se realizó una inmunoprecipitación secuencial de cromatina sobre cromatina extraída de cuatro líneas de células madre embrionarias humanas utilizando anticuerpos contra una marca de activación cromatínica, seguidos por anticuerpos contra una marca de represión. Estas marcas se modifican cuando las células son expuestas a morfógenos, pero varían según las líneas de células madre embrionarias humanas, probablemente debido a los blastocistos originales de los cuales se derivan.

La inmunoprecipitación de cromatina también puede aplicarse a cromatina extraída de regiones cardíacas embrionarias específicas. Esta figura muestra regiones genómicas de los genes cardíacos Nkx2.5 y TBx5 enriquecidas en la histona modificada y una región genómica del gen específico del marcapasos Shox2 que no está enriquecida ni expresada en el ventrículo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una evaluación de la eficiencia de sonicación antes de comenzar el protocolo de inmunoprecipitación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Eth-ek-se-ek para responder preguntas adicionales, como indagar sobre el estado antiguo de la cromatina, si está abierta o cerrada, o monitorear el espaciado de los nucleosomas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran cualquier regulación epigenética en las decisiones del destino celular en cualquier tipo celular u órgano embrionario.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se pueden realizar los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina.