Name: Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a aislar células individuales de embriones de Danio rerio para análisis de expresión génica mediante sistemas microfluídicos. Este método revela la heterogeneidad celular oculta en técnicas convencionales.

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Agradecemos al Dr. C. Geoffrey Burns por el caldo de peces. Los autores agradecen a la UNC Flow Cytometry Core Facility, a la UNC-CGIBD AAC core por los recursos que permiten este proyecto y a la instalación ZAC para el cuidado de animales. L.S. cuenta con el apoyo de la subvención T32 de los NIH HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. cuenta con el apoyo de la beca de investigación de posgrado de NSF NSF-DGE-1144081. Este estudio contó con el apoyo de la subvención P30DK034987 de los NIH (al UNC Advanced Analytics Core), la subvención de desarrollo científico de la American Heart Association 13SDG17060010 y la subvención New Scholar de la Fundación Médica Ellison AG-NS-1064-13 (al Dr. Qian), y la subvención R00 HL109079 de los NIH (al Dr. Liu).

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito en este documento utiliza la expresión de una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico de tipo celular para enriquecer una población de células progenitoras cardíacas a partir de embriones de pez cebra para su uso en sistema de captura única célula asistida de microfluidos para evaluar la expresión de un subconjunto de genes cardiacos en solo Células. A condición de que las capacidades de FACS de excitación láser y emisión son compatibles con el fluoróforo (s) de elección, este ...

La mayoría de los estudios actuales de la biología celular y molecular se basan en promedios de la población. Sin embargo, importantes eventos biológicos pueden estar enmascarados por estos análisis tradicionales basados ​​en la población ya que las poblaciones de menor importancia pueden desempeñar un papel importante en los procesos biológicos y evolución de la enfermedad. La comprensión de la expresión de genes en poblaciones heterogéneas a nivel de una sola célula puede (y tiene) conducir a conocimientos biológicos y clínicos 1,2. De interés para los estudios de desarrollo embrionario, en una población mayor de células, las células progenitoras son a menudo poco representados, por lo que es difícil de detectar cambios sutiles en la expresión de genes que inician en última instancia, las decisiones del destino celular 3. Del mismo modo, un solo tipo de células puede tener diferentes perfiles de expresión en respuesta a la microambiente 4. Por ejemplo, las células endoteliales residentes en el mismo órgano o en diferentes órganos (por ejemplo., Aorta o riñón) presentan una heterogeneidad significativa a pesar de compartir morp comúncaracterísticas hological y funcionales 5. Además, las células cancerosas que pueblan el mismo tumor también pueden tener diversos perfiles moleculares o mutaciones en el nivel de células individuales 6. En los sistemas modelo, transcriptómica en células individuales ha identificado con éxito nuevas poblaciones de células, que se caracteriza estados intermedios que se producen durante la diferenciación celular, y puso de manifiesto las respuestas celulares a los estímulos diferenciales 7.8.9. Estas ideas se han enmascarado en los estudios convencionales basados ​​en la población. embriones de pez cebra son una fuente tremendamente infrautilizados del tallo, células progenitoras, y diferenciación de las células para explorar cuestiones de la heterogeneidad de células individuales y la regulación molecular de identidades celulares durante el desarrollo. Su altamente estereotipada, ex vivo el desarrollo y la facilidad de manipulación genética ellas un excelente sistema modelo para este enfoque 10,11 hacen. En concreto, una limitación importante a la interpretación de un solo gen celulardatos de correo expresión es que la identificación fiable de los nuevos estados intermedios de células durante el desarrollo requiere mucho cuidado el momento de la recogida de tejidos 9. Esto es necesario para asegurar que la heterogeneidad entre las células capturadas representa heterogeneidad dentro de un tejido en un solo punto de tiempo en lugar de la heterogeneidad en la expresión génica presentado por la diferenciación de células dependiente de la edad. En comparación con los ratones, el desarrollo del embrión de pez cebra se puede sincronizar con precisión a través de un gran número de embriones 12. Además, con tamaños grandes de embrague, embriones de pez cebra se pueden utilizar como una fuente abundante de células madre y progenitoras. Este protocolo describe un método para aislar células de embriones de pez cebra y la captura de células individuales utilizando un chip y Autoprep sistema disponible comercialmente circuito microfluídica integrado (IFC) para el análisis de la expresión génica QRT-PCR. Este protocolo puede ser rápidamente transferible a ningún ensayos de alto rendimiento, incluyendo toda la multiplexaciónsecuenciación del transcriptoma que permite un análisis más exhaustivo de la heterogeneidad celular 13. También ofrece varias ventajas a los ensayos de expresión génica tradicionales. El protocolo de aislamiento de células individuales se obtiene una alta viabilidad después de FACS, lo que disminuye la proporción de células comprometidas que se incluyen en las aplicaciones posteriores. Mediante el uso de un CFI, células capturadas pueden ser observados directamente para evaluar las tasas de captura y evaluar la salud de células morfológicamente. Además, este protocolo es ampliamente aplicable a la comunidad de investigación pez cebra, que sólo requiere una línea de peces transgénicos etiquetados y el acceso a las tecnologías de captura de células de microfluidos. Como prueba de principio, se aislaron células individuales derivadas de progenitores cardíacos y capturados en un chip IFC, y luego la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaco se midió mediante qRT-PCR. análisis de la expresión génica a nivel de células individuales demuestra que los progenitores cardíacos coexisten con su differeprogenie ntiating. El conocimiento que se obtiene a partir de perfiles de una sola célula de células progenitoras cardíacas puede arrojar luz sobre la heterogeneidad en los patrones de expresión génica entre células progenitoras cardiacas durante el desarrollo de vertebrados, que puede haber sido enmascarado en los análisis tradicionales basados ​​en la población.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Para extraer el corion de los embriones</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 mmm colador de células</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS rematados con un filtro de celdas de 35 mmm</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 y puntas</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 y puntas</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo del fabricante de chips IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>La versión 100-6117 E1 se utilizó en un experimento representativo</td></tr><tr><td>Pastuer de diámetro ancho pipeta de vidrio</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>para transferencia de embriones</td></tr><tr><td>Pez cebra adulto de tipo salvaje</td><td>N/A</td><td></td><td>Utilizamos la línea AB</td></tr><tr><td>Pez cebra transgénico adulto</td><td>N/A</td><td></td><td>Usamos Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reactivos para la disociación celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua doblemente destilada</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>hacer stock en agua y uso para tampón de desyema</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>hacer stock en agua y usar para tampón de desyema</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>hacer caldo en agua y uso para tampón de desyema</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Inactivado por calor; cualquier marca de FBS debe estar bien</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; descongelar en hielo; llevar a temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Pronase (opcional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Cualquier tinción viva/muerta adecuada para la citometría de flujo funcionará</td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte> </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reactivos para uso en placas IFC y qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Specific Sondas</td><td></td><td></td> Las <td>sondas variarán según el experimento</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de expresión génica TaqMan</td> Life <td>Technologies 4369016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivos incluidos en el protocolo</td><td></td><td></td><td></td>del fabricante</tr><tr><td>IFC Kit de reactivos C1</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reactivos para la carga de células en la placa IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reactivos para las etapas de transcripción inversa y preamplificación</td></tr><tr><td>Biología molecular Agua de calidad</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC para PreAmp (5-10 mmm)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>Placa IFC para celdas pequeñas</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina C1 AutoPrep</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Para uso de placa IFC</td></tr><tr><td>Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Para el recuento de células y la evaluación del tamaño de las células</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de disección <td>Para extraer embriones de corion</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de cultivo de tejidos <td>Para evaluar la digestión de una sola célula</td></tr><tr><td>Máquina</td><td></td><td></td> FACS <td>Para aislar células de interés</td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

El pez cebra (Danio rerio) es un poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo de los vertebrados. Aunque muchos aspectos del desarrollo embrionario del pez cebra se han descrito a nivel morfológico, se sabe poco sobre las bases moleculares de los cambios celulares que ocurren a medida que el organismo se desarrolla. Con los recientes avances en microfluídica y tecnologías de multiplexación, ahora es posible caracterizar la expresión génica en células individuales. Esto permite investigar la heterogeneidad entre células individuales de poblaciones celulares específicas para identificar y clasificar subtipos de células, caracterizar estados intermedios que ocurren durante la diferenciación celular y explorar respuestas celulares diferenciales a estímulos. Este estudio describe un protocolo para aislar células individuales viables de embriones de pez cebra para ensayos de multiplexación de alto rendimiento. Este método se puede aplicar rápidamente a cualquier tipo de célula embrionaria de pez cebra con marcadores fluorescentes. Una extensión de este método también se puede utilizar en combinación con tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para caracterizar completamente el transcriptoma de células individuales. Como prueba de principio, se evaluó la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaca en células individuales aisladas derivadas de progenitores cardíacos nkx2.5 positivos. Mediante la evaluación de la expresión génica a nivel de una sola célula y en un solo punto de tiempo, los datos respaldan un modelo en el que los progenitores cardíacos coexisten con la progenie en diferenciación. El método y el flujo de trabajo descritos aquí son ampliamente aplicables a la comunidad de investigación del pez cebra, ya que solo requieren una línea de peces transgénicos etiquetados y acceso a tecnologías de microfluídica.

Como prueba de principio, la expresión génica se evaluó para explorar la dinámica de diferenciación durante el desarrollo cardíaco. En el pez cebra, surgen progenitores cardíacos de una población mesodérmico de células que migran a la anterior mesodermo de la placa lateral donde se fusionan para formar el tubo lineal corazón. Antes de la fusión, progenitores cardíacos comienzan a expresar el factor de transcripción nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se cree que es el primer marcador e...

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

El objetivo general de este experimento es aislar células individuales de embriones de pez cebra en etapas tempranas para su captura en un sistema microfluídico de multiplexación a nivel de célula individual, con el fin de evaluar la expresión génica de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como por ejemplo qué cambios transcripcionales experimentan las células durante la especificación y la diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un enfoque imparcial para revelar la heterogeneidad que queda enmascarada en las técnicas convencionales basadas en poblaciones.Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque generar preparaciones viables de células individuales es técnicamente complejo, pero esencial para el análisis posterior. Una vez dominado, el procesamiento de muestras de embriones completos en células individuales lisadas en un chip microfluídico integrado puede completarse en seis horas si los pasos se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que solo se capturen células individuales en el dispositivo microfluídico.Después de criar adultos de tipo silvestre y peces cebra transgénicos, recolecte embriones a intervalos de 15 minutos según los procedimientos operativos estándar aprobados por la instalación e institución. Al menos dos horas después, transfiera de 100 a 300 embriones fertilizados de un único punto temporal a una nueva placa de Petri que contenga agua para huevos fresca. Y use pinzas finas para eliminar manualmente la coriona de cada embrión.A continuación, utilice una pipeta de vidrio de gran orificio para transferir los embriones a un tubo microcentrífugo de 2 mililitros con un volumen mínimo de agua para huevos. Una vez que todos los embriones hayan sido transferidos, reemplace el agua por 1 mililitro de agua para huevos fría con hielo y sumerja el tubo en hielo durante 20 minutos. Después de la eutanasia, utilice una pipeta de vidrio de gran orificio para eliminar el sobrenadante.Y una pipeta P-1000 para agregar agua de huevo fresca a los embriones dos veces. Después del segundo lavado, reemplace el agua de huevo con 1 mililitro de tampón desyolkante y utilice una pipeta P-1000 para triturar los embriones de ocho a 12 veces hasta que la yema se disuelva y solo sean visibles los cuerpos de los embriones. Recolecte el tejido mediante centrifugación.Luego, use la pipeta para eliminar suavemente el sobrenadante sin perturbar el sedimento de tejido y re-suspender las células en 1 mililitro de agua para huevos fresca. Después de lavar los embriones otras dos veces, re-suspender el sedimento en 1 mililitro del reactivo de disociación celular-1 a temperatura ambiente. A continuación, coloque el tubo de lado para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.Con trituración suave cada dos o tres minutos para evitar la formación de grumos. Al final de la incubación, centrifugar nuevamente las células y resuspender el precipitado en 1 mililitro de reactivo de disociación celular-2. Incubar las células horizontalmente a temperatura ambiente durante otros cinco a 15 minutos con trituración suave cada dos o tres minutos.Cada cinco minutos, diluya 2 microlitros de sobrenadante en 18 microlitros de tampón FACS y distribuya las células en forma de gota sobre una placa de cultivo celular. Coloque una cubreobjetos sobre la muestra y utilice un microscopio de cultivo de tejidos para evaluar la progresión de la digestión a aumentos de 10 y 20x. Cuando la preparación parezca una mezcla de células individuales principalmente, junto con algunos cúmulos celulares pequeños y grandes y unas pocas estructuras de embriones mayormente intactas, centrifugue las células y re-suspenda el sedimento en 1 mililitro de tampón FACS frío.A continuación, humedezca un filtro celular de 40 micrones con tampón FACS. Filtre las células a través del filtro hacia una placa de cultivo celular de 35 milímetros. Después de centrifugar las células nuevamente, re-suspenda el precipitado en 100 microlitros de tampón FACS y cuente el número de células viables mediante exclusión con azul de tripano.A continuación, diluya la muestra hasta 5 veces 10 a la 6ª células por mililitro. Reserve del 10 al 20 % de las células para el control sin teñir. Tiña el resto de las células con un colorante fluorescente para la discriminación de células vivas/muertas.Luego humedezca un tubo FACS con filtro celular de 35 micrones con 20 microlitros de tampón FACS, y agregue las células al filtro, recolectándolas por gravedad. Utilizando la estrategia de selección ilustrada, separe las células individuales viables que expresan el marcador fluorescente. Verifique la selección con las células doblemente marcadas.Ordene de 2.000 a 4.000 células de la población de interés en 5 microlitros de tampón FACS frío en un tubo de microcentrifugado sobre hielo. Luego, transfiera 1 microlitro de las células ordenadas a un nuevo tubo FACS con 100 microlitros de tampón de clasificación FACS y una dilución de 1 a 1.000 del colorante de viabilidad (vivas/muertas). A continuación, ejecute la muestra celular utilizando las compuertas de clasificación para evaluar la viabilidad tras la clasificación.A continuación, cargue 1 microlitro de células diluidas en 9 microlitros de tampón FACS en un hemocitómetro para determinar la concentración celular y el diámetro promedio. Ahora seleccione un circuito microfluídico integrado, o chip IFC, del tamaño adecuado para el diámetro celular promedio de la muestra, y prepare la fluídica según las instrucciones del fabricante. Cargue las células en la placa según las instrucciones del fabricante, y coloque la placa en una máquina fluídica compatible.Luego, ejecute un script de carga de células adecuado para el chip IFC con el fin de introducir las células en las canales de captura. Para confirmar que las células están alojadas en los sitios de captura, coloque la placa en un microscopio equipado con un adaptador para placas y obtenga imágenes de campo claro y de fluorescencia de cada sitio de captura con un aumento de 10x. Posteriormente, las células pueden procesarse para evaluar la expresión de sus genes diana mediante QRT-PCR.En la etapa de 18 somitas, se puede utilizar microscopía de fluorescencia para verificar la expresión de ZsYellow en los embriones. Después de la clasificación, se obtienen células con una variedad de diámetros. La placa de IFC se puede utilizar para capturar células con un diámetro de interés.Por ejemplo, en este experimento, células de cinco a diez micrómetros de diámetro. Como era de esperar, las células clasificadas y capturadas de embriones de 18 horas post-fecundación expresaron el marcador fluorescente ZsYellow. Aquí, se utilizó la QRT-PCR para evaluar la expresión génica relativa de genes específicos de interés en 40 células individuales procedentes de sitios de captura celular en una placa IFC.Dado que el rango de valores de umbral de ciclo para el gen de referencia era demasiado amplio para comparar la expresión génica entre muestras, y muchos valores de umbral de ciclo superaban 30, los valores se visualizaron como un mapa de calor. Al comparar entre muestras, se observó una heterogeneidad considerable en la expresión génica en este experimento, con células clasificadas como Tipos 1 a 5 según su patrón de expresión génica.Una vez dominado, el procesamiento de muestras de embriones completos en células individuales lisadas en un chip microfluídico integrado puede completarse en seis horas si los pasos se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se capturan células individuales en el chip microfluídico. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de células individuales de alto rendimiento, para caracterizar completamente los transcriptomas de células individuales.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la heterogeneidad celular en embriones en etapas tempranas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células individuales de embriones de pez cebra, capturar células individuales en un sistema microfluídico multiplex de base para célula única y evaluar la expresión génica de células individuales.

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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