Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

El objetivo general de este experimento es aislar células individuales de embriones de pez cebra en etapa temprana para su captura en un sistema multiplexado de una sola célula basado en microfluídica para evaluar la expresión génica de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como qué cambios transcripcionales experimentan las células durante la especificación y la diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que es un enfoque imparcial para revelar la heterogeneidad que se enmascara en las técnicas convencionales basadas en la población.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque la generación de las preparaciones viables de células individuales es técnicamente desafiante, pero esencial para el análisis posterior. Una vez dominado, el procesamiento de las muestras de embriones enteros en células lisadas individuales en un chip microfluídico integrado puede completarse en seis horas si los pasos se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que solo se capturen células individuales en el dispositivo microfluídico.

Después de criar peces cebra adultos de tipo silvestre y transgénicos, recoja los embriones a intervalos de 15 minutos de acuerdo con los procedimientos operativos estándar aprobados por las instalaciones y las instituciones. Al menos dos horas después, transfiera de 100 a 300 embriones fertilizados de un solo punto de tiempo a una nueva placa de Petri que contenga agua fresca de huevo. Y use pinzas finas para extraer manualmente el corion de cada embrión.

A continuación, utilice una pipeta de vidrio de diámetro ancho para transferir los embriones a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros con un volumen mínimo de agua de huevo. Cuando se hayan transferido todos los embriones, reemplace el agua con 1 mililitro de agua de huevo helada y sumerja el tubo en hielo durante 20 minutos. Después de la eutanasia, utilice una pipeta de vidrio de diámetro ancho para eliminar el sobrenadante.

Y una pipeta P-1000 para añadir dos veces agua fresca de huevo a los embriones. Después del segundo lavado, reemplace el agua del huevo con 1 mililitro de tampón desactivador y use una pipeta P-1000 para triturar los embriones de ocho a 12 veces hasta que la yema se disuelva y solo se vean los cuerpos de los embriones. Recoger el tejido por centrifugación.

A continuación, utilice la pipeta para eliminar suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet de tejido, y vuelva a suspender las células en 1 mililitro de agua fresca de huevo. Después de lavar los embriones dos veces más, vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de reactivo de disociación celular a temperatura ambiente-1. A continuación, coloque el tubo de lado para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.

Con trituración suave cada dos o tres minutos para evitar la formación de grumos. Al final de la incubación, vuelva a centrifugar las células y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de reactivo de disociación celular-2. Incube las células horizontalmente a temperatura ambiente durante otros cinco a 15 minutos con una trituración suave cada dos o tres minutos.

Cada cinco minutos, diluya 2 microlitros de sobrenadante en 18 microlitros de tampón FACS y dispense las células como una gota en una placa de cultivo celular. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y utilice un microscopio de cultivo de tejidos para evaluar la progresión de la digestión con aumentos de 10 y 20x. Cuando la preparación parezca ser una mezcla de células individuales con algunos grupos de células pequeñas y grandes y unos pocos cuerpos embrionarios en su mayoría intactos, centrifuga las células y vuelve a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón FACS frío.

A continuación, humedezca un colador de células de 40 micras con tampón FACS. Y filtre las células a través del colador en una placa de cultivo celular de 35 milímetros. Después de volver a girar las celdas, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS y cuente el número de células viables por exclusión de azul de tripán.

A continuación, diluya la muestra a 5 veces 10 a la 6ª celdas por mililitro. Y reserve del 10 al 20% de las células para el control sin teñir. Tiñe el resto de las células con un tinte fluorescente de discriminación vivo/muerto.

A continuación, humedece un tubo FACS tapado por un colador de células de 35 micras con 20 microlitros de tampón FACS, y añade las células al colador, recogiéndolas por gravedad. Usando la estrategia de compuerta ilustrada, clasifique las células vivas individuales que expresan el marcador fluorescente. Verificación de la compuerta con las celdas de doble lab.

Clasificar de 2.000 a 4.000 células de la población de interés en 5 microlitros de tampón FACS frío en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. A continuación, transfiera 1 microlitro de las células clasificadas a un nuevo tubo FACS con 100 microlitros de tampón de clasificación FACS y una dilución de 1 a 1.000 de tinción viva/muerta. Y ejecute la muestra de celdas utilizando las puertas de clasificación para evaluar la viabilidad de la clasificación posterior.

A continuación, cargue 1 microlitro de células diluidas en 9 microlitros de tampón FACS en un hemocitómetro para determinar la concentración de células y el diámetro medio. Ahora seleccione un circuito microfluídico integrado, o chip IFC, del tamaño adecuado para el diámetro medio de la celda de la muestra, y cebe los fluidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cargue las celdas en la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cargue la placa en una máquina de fluidos compatible.

A continuación, ejecute un script de carga de celdas adecuado para que el chip IFC empuje las celdas a los carriles de captura. Para confirmar que las células están alojadas en los sitios de captura, monte la placa en un microscopio equipado con un adaptador de placa y obtenga imágenes de campo claro y fluorescencia de cada sitio de captura con un aumento de 10x. A continuación, las células pueden procesarse para la evaluación posterior de su expresión génica diana mediante QRT-PCR.

En la etapa de 18 somitas, se puede utilizar la microscopía de fluorescencia para verificar la expresión de ZsYellow de los embriones. Después de la clasificación, se obtienen celdas con un rango de diámetros. La placa IFC se puede utilizar para capturar celdas con un diámetro de interés.

Por ejemplo, en este experimento, células de cinco a 10 micrómetros de diámetro. Como se esperaba, las células clasificadas y capturadas de embriones 18 horas después de la fertilización expresaron el marcador fluorescente ZsYellow. En este caso, se utilizó QRT-PCR para evaluar la expresión génica relativa de genes específicos de interés en 40 células individuales de sitios de captura de células en una placa IFC.

Dado que el rango de valores de umbral de ciclo para el gen de mantenimiento era demasiado amplio para comparar la expresión génica entre muestras y muchos valores de umbral de ciclo superaban 30, los valores se visualizaron como un mapa de calor. Al comparar entre muestras, se observó una heterogeneidad sustancial en la expresión génica en este experimento. Con células clasificadas como Tipos 1 a 5 en función de su patrón de expresión génica.

Una vez dominado, el procesamiento de las muestras de embriones enteros en células lisadas individuales en un chip microfluídico integrado puede completarse en seis horas si los pasos se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se capturan células individuales en el chip microfluídico. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de células individuales de alto rendimiento, para caracterizar completamente los transcriptomas de células individuales.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la heterogeneidad celular en embriones en desarrollo temprano. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células individuales de embriones de pez cebra, capturar células individuales en un sistema multiplexado de una sola célula de base microfluídica y evaluar la expresión génica de células individuales.