Name: Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a aislar células individuales de embriones de Danio rerio para análisis de expresión génica mediante sistemas microfluídicos. Este método revela la heterogeneidad celular oculta en técnicas convencionales.

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Agradecemos al Dr. C. Geoffrey Burns por el caldo de peces. Los autores agradecen a la UNC Flow Cytometry Core Facility, a la UNC-CGIBD AAC core por los recursos que permiten este proyecto y a la instalación ZAC para el cuidado de animales. L.S. cuenta con el apoyo de la subvención T32 de los NIH HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. cuenta con el apoyo de la beca de investigación de posgrado de NSF NSF-DGE-1144081. Este estudio contó con el apoyo de la subvención P30DK034987 de los NIH (al UNC Advanced Analytics Core), la subvención de desarrollo científico de la American Heart Association 13SDG17060010 y la subvención New Scholar de la Fundación Médica Ellison AG-NS-1064-13 (al Dr. Qian), y la subvención R00 HL109079 de los NIH (al Dr. Liu).

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<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito en este documento utiliza la expresión de una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico de tipo celular para enriquecer una población de células progenitoras cardíacas a partir de embriones de pez cebra para su uso en sistema de captura única célula asistida de microfluidos para evaluar la expresión de un subconjunto de genes cardiacos en solo Células. A condición de que las capacidades de FACS de excitación láser y emisión son compatibles con el fluoróforo (s) de elección, este ...

La mayoría de los estudios actuales de la biología celular y molecular se basan en promedios de la población. Sin embargo, importantes eventos biológicos pueden estar enmascarados por estos análisis tradicionales basados ​​en la población ya que las poblaciones de menor importancia pueden desempeñar un papel importante en los procesos biológicos y evolución de la enfermedad. La comprensión de la expresión de genes en poblaciones heterogéneas a nivel de una sola célula puede (y tiene) conducir a conocimientos biológicos y clínicos 1,2. De interés para los estudios de desarrollo embrionario, en una población mayor de células, las células progenitoras son a menudo poco representados, por lo que es difícil de detectar cambios sutiles en la expresión de genes que inician en última instancia, las decisiones del destino celular 3. Del mismo modo, un solo tipo de células puede tener diferentes perfiles de expresión en respuesta a la microambiente 4. Por ejemplo, las células endoteliales residentes en el mismo órgano o en diferentes órganos (por ejemplo., Aorta o riñón) presentan una heterogeneidad significativa a pesar de compartir morp comúncaracterísticas hological y funcionales 5. Además, las células cancerosas que pueblan el mismo tumor también pueden tener diversos perfiles moleculares o mutaciones en el nivel de células individuales 6. En los sistemas modelo, transcriptómica en células individuales ha identificado con éxito nuevas poblaciones de células, que se caracteriza estados intermedios que se producen durante la diferenciación celular, y puso de manifiesto las respuestas celulares a los estímulos diferenciales 7.8.9. Estas ideas se han enmascarado en los estudios convencionales basados ​​en la población. embriones de pez cebra son una fuente tremendamente infrautilizados del tallo, células progenitoras, y diferenciación de las células para explorar cuestiones de la heterogeneidad de células individuales y la regulación molecular de identidades celulares durante el desarrollo. Su altamente estereotipada, ex vivo el desarrollo y la facilidad de manipulación genética ellas un excelente sistema modelo para este enfoque 10,11 hacen. En concreto, una limitación importante a la interpretación de un solo gen celulardatos de correo expresión es que la identificación fiable de los nuevos estados intermedios de células durante el desarrollo requiere mucho cuidado el momento de la recogida de tejidos 9. Esto es necesario para asegurar que la heterogeneidad entre las células capturadas representa heterogeneidad dentro de un tejido en un solo punto de tiempo en lugar de la heterogeneidad en la expresión génica presentado por la diferenciación de células dependiente de la edad. En comparación con los ratones, el desarrollo del embrión de pez cebra se puede sincronizar con precisión a través de un gran número de embriones 12. Además, con tamaños grandes de embrague, embriones de pez cebra se pueden utilizar como una fuente abundante de células madre y progenitoras. Este protocolo describe un método para aislar células de embriones de pez cebra y la captura de células individuales utilizando un chip y Autoprep sistema disponible comercialmente circuito microfluídica integrado (IFC) para el análisis de la expresión génica QRT-PCR. Este protocolo puede ser rápidamente transferible a ningún ensayos de alto rendimiento, incluyendo toda la multiplexaciónsecuenciación del transcriptoma que permite un análisis más exhaustivo de la heterogeneidad celular 13. También ofrece varias ventajas a los ensayos de expresión génica tradicionales. El protocolo de aislamiento de células individuales se obtiene una alta viabilidad después de FACS, lo que disminuye la proporción de células comprometidas que se incluyen en las aplicaciones posteriores. Mediante el uso de un CFI, células capturadas pueden ser observados directamente para evaluar las tasas de captura y evaluar la salud de células morfológicamente. Además, este protocolo es ampliamente aplicable a la comunidad de investigación pez cebra, que sólo requiere una línea de peces transgénicos etiquetados y el acceso a las tecnologías de captura de células de microfluidos. Como prueba de principio, se aislaron células individuales derivadas de progenitores cardíacos y capturados en un chip IFC, y luego la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaco se midió mediante qRT-PCR. análisis de la expresión génica a nivel de células individuales demuestra que los progenitores cardíacos coexisten con su differeprogenie ntiating. El conocimiento que se obtiene a partir de perfiles de una sola célula de células progenitoras cardíacas puede arrojar luz sobre la heterogeneidad en los patrones de expresión génica entre células progenitoras cardiacas durante el desarrollo de vertebrados, que puede haber sido enmascarado en los análisis tradicionales basados ​​en la población.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Para extraer el corion de los embriones</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 mmm colador de células</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS rematados con un filtro de celdas de 35 mmm</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 y puntas</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 y puntas</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo del fabricante de chips IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>La versión 100-6117 E1 se utilizó en un experimento representativo</td></tr><tr><td>Pastuer de diámetro ancho pipeta de vidrio</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>para transferencia de embriones</td></tr><tr><td>Pez cebra adulto de tipo salvaje</td><td>N/A</td><td></td><td>Utilizamos la línea AB</td></tr><tr><td>Pez cebra transgénico adulto</td><td>N/A</td><td></td><td>Usamos Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reactivos para la disociación celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua doblemente destilada</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>hacer stock en agua y uso para tampón de desyema</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>hacer stock en agua y usar para tampón de desyema</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>hacer caldo en agua y uso para tampón de desyema</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Inactivado por calor; cualquier marca de FBS debe estar bien</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; descongelar en hielo; llevar a temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Pronase (opcional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Cualquier tinción viva/muerta adecuada para la citometría de flujo funcionará</td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte> </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reactivos para uso en placas IFC y qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Specific Sondas</td><td></td><td></td> Las <td>sondas variarán según el experimento</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de expresión génica TaqMan</td> Life <td>Technologies 4369016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivos incluidos en el protocolo</td><td></td><td></td><td></td>del fabricante</tr><tr><td>IFC Kit de reactivos C1</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reactivos para la carga de células en la placa IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reactivos para las etapas de transcripción inversa y preamplificación</td></tr><tr><td>Biología molecular Agua de calidad</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC para PreAmp (5-10 mmm)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>Placa IFC para celdas pequeñas</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina C1 AutoPrep</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Para uso de placa IFC</td></tr><tr><td>Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Para el recuento de células y la evaluación del tamaño de las células</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de disección <td>Para extraer embriones de corion</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de cultivo de tejidos <td>Para evaluar la digestión de una sola célula</td></tr><tr><td>Máquina</td><td></td><td></td> FACS <td>Para aislar células de interés</td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

El pez cebra (Danio rerio) es un poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo de los vertebrados. Aunque muchos aspectos del desarrollo embrionario del pez cebra se han descrito a nivel morfológico, se sabe poco sobre las bases moleculares de los cambios celulares que ocurren a medida que el organismo se desarrolla. Con los recientes avances en microfluídica y tecnologías de multiplexación, ahora es posible caracterizar la expresión génica en células individuales. Esto permite investigar la heterogeneidad entre células individuales de poblaciones celulares específicas para identificar y clasificar subtipos de células, caracterizar estados intermedios que ocurren durante la diferenciación celular y explorar respuestas celulares diferenciales a estímulos. Este estudio describe un protocolo para aislar células individuales viables de embriones de pez cebra para ensayos de multiplexación de alto rendimiento. Este método se puede aplicar rápidamente a cualquier tipo de célula embrionaria de pez cebra con marcadores fluorescentes. Una extensión de este método también se puede utilizar en combinación con tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para caracterizar completamente el transcriptoma de células individuales. Como prueba de principio, se evaluó la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaca en células individuales aisladas derivadas de progenitores cardíacos nkx2.5 positivos. Mediante la evaluación de la expresión génica a nivel de una sola célula y en un solo punto de tiempo, los datos respaldan un modelo en el que los progenitores cardíacos coexisten con la progenie en diferenciación. El método y el flujo de trabajo descritos aquí son ampliamente aplicables a la comunidad de investigación del pez cebra, ya que solo requieren una línea de peces transgénicos etiquetados y acceso a tecnologías de microfluídica.

Como prueba de principio, la expresión génica se evaluó para explorar la dinámica de diferenciación durante el desarrollo cardíaco. En el pez cebra, surgen progenitores cardíacos de una población mesodérmico de células que migran a la anterior mesodermo de la placa lateral donde se fusionan para formar el tubo lineal corazón. Antes de la fusión, progenitores cardíacos comienzan a expresar el factor de transcripción nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se cree que es el primer marcador e...

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

El objetivo general de este experimento es aislar células individuales de embriones de pez cebra en etapas tempranas para su captura en un sistema microfluídico de multiplexación a nivel de célula individual, con el fin de evaluar la expresión génica de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como por ejemplo qué cambios transcripcionales experimentan las células durante la especificación y la diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un enfoque imparcial para revelar la heterogeneidad que queda enmascarada en las técnicas convencionales basadas en poblaciones.Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque generar preparaciones viables de células individuales es técnicamente complejo, pero esencial para el análisis posterior. Una vez dominado, el procesamiento de muestras de embriones completos en células individuales lisadas en un chip microfluídico integrado puede completarse en seis horas si los pasos se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que solo se capturen células individuales en e

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Somitogenesis es un proceso de desarrollo rítmico que espacialmente los patrones de los ejes corporales de los embriones de vertebrados. Anteriormente, hemos desarrollado líneas de pez cebra transgénico que utilizan los reporteros fluorescentes para observar los genes cíclicos que impulsan este proceso. En este sentido, la cultura dispersamos las células de estas líneas y la imagen de sus oscilaciones en el tiempo en vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar...

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

Presentamos un protocolo eficiente y fácil de usar para la preparación de cultivos celulares primarios de células de embriones de pez cebra para transfección celular directo imágenes así como un protocolo para preparar células primarias del cerebro del pez cebra adulto.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

El presente protocolo describe el aislamiento agudo de células viables del músculo liso cardíaco y vascular de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios (Danio rerio), adecuados para estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos

Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

Aprenda a aislar células individuales de embriones de Danio rerio para análisis de expresión génica mediante sistemas microfluídicos. Este método revela la heterogeneidad celular oculta en técnicas convencionales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

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