Name: Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a convertir fibroblastos de piel adulta en células secretoras de insulina mediante conversión epigenética sin inducir pluripotencia ni usar vectores retrovirales. Este método seguro avanza la terapia celular para diabetes.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (EFSD). GP es apoyado por una beca post-doctoral de la Universidad de Milán. Los autores son miembros de la Acción COST FA1201 Epiconcept: Epigenética y periconcepción medio ambiente y la Acción COST avanza en modelos animales grandes BM1308 Sharing (Salaam). TALB de es miembro de la Acción COST CM1406 epigenética Biología Química (EPICHEM).

Nota: Todos los procedimientos descritos a continuación deben realizarse bajo campana de flujo laminar en condiciones estériles. Asegúrese de que todos los procedimientos de cultivo se llevan a cabo en etapas termostáticas y las células se mantienen a 37 ° C en toda su manejo. 1. Aislamiento de fibroblastos de la piel <ol><li> Preparar Cultura Solución de revestimiento del plato <ol><li> Disolver 0,1 g de gelatina porcina en 100 ml de agua (concentración final 0,1%). Esterilizar la solución con autoclave. </li><li> Añadir 1,5 ml de gelatina porcina estéril 0,1% a 35 mm placas de Petri. Esperar 2 horas para revestir, manteniéndolas a temperatura ambiente. Nota: las biopsias de piel humana son recogidos por escisión bajo anestesia local de una zona avascular de la cara anterior del antebrazo y se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) suplementado con solución antimicótica antibiótica 2% a 4 ° C antes de su uso. </li></ol></li><li> Lavar las biopsias con nueva PBS suplementado con 2% de antibisolución antimicótica ótica. </li><li> Biopsias lugar en un plato de Petri de 100 mm y cortar en aproximadamente 2 mm 3 fragmentos con bisturís estériles. </li><li> Eliminar el exceso de solución de revestimiento inmediatamente antes de chapado fragmentos. </li><li> Coloque 5-6 fragmentos de piel en la placa de Petri pre-revestido 35 mm. </li><li> Preparar medio de cultivo de fibroblastos: 77% de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) alto nivel de glucosa, 20% suero bovino fetal (FBS), 1% de solución de L-glutamina y 2% de solución antimicótica antibiótica. </li><li> Añadir una gota de medio de fibroblastos sobre cada fragmento (por lo general 100 l por fragmento) y la cultura de ellos a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Después de 24 horas, añadir 500 l de medio de cultivo de fibroblastos en los fragmentos para mantenerlos húmedos a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Cambiar el medio con una pipeta al menos una vez cada 48 horas. </li><li> Después de 6 días de incubación, retirar cuidadosamente los fragmentos de tejido y desecharlos. Nota: Después de 6 días, fibroblastoss comienzan a crecer fuera de los fragmentos de tejido y comienzan a formar una monocapa de células. </li><li> Refrescar medio, agregar 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos y continuar el cultivo en monocapa de células a 37 ° C en 5% de CO2. </li></ol> 2. cultivo de fibroblastos <ol><li> Fibroblastos de cultivo a 37 ° C en CO2 al 5% hasta 80% de confluencia </li><li> Para los pases, medio de cultivo de fibroblastos de aspirado de placas de cultivo de tejidos. Lavar las células tres veces con 4 ml de PBS suplementado con solución antimicótica antibiótica 1%. </li><li> Añadir una capa fina (10% del volumen de medio de cultivo) de solución de tripsina-EDTA (0,5 g de tripsina / L porcina y 0,2 g / L de EDTA) y se incuba a 37 ° C hasta que monocapa de células comienza a desprenderse de la parte inferior del tejido placa de cultivo y las células se disocian. </li><li> Diluir la suspensión de células con 9 partes de medio de cultivo de fibroblastos para neutralizar la acción de la tripsina. La centrifugación no es necesario. </li><li> células de la placa en nuevas placas de cultivo (confuera de gelatina) y el cultivo a 37 ° C en 5% de CO2. Mantener la relación de paso entre 1: 2 y 1: 4, dependiendo de la tasa de crecimiento. </li><li> Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia, el paso de ellos (por lo general dos veces por semana). </li></ol> 3. fibroblastos Chapado de epigenética Conversión <ol><li> Añadir 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gelatina porcina (preparar como se describe en 1.1) a placas de cultivo celular. Esperar 2 horas para cubrir. </li><li> Retire el exceso de solución de revestimiento min 10-30 antes de chapado fibroblastos. </li><li> Retire el medio de cultivo de fibroblastos de placas de cultivo. Lavar las células tres veces con PBS suplementado con solución antimicótica antibiótica 1%. </li><li> Añadir una capa fina (10% del volumen de medio de cultivo) de solución de tripsina-EDTA (0,5 g de tripsina / L porcina y 0,2 g / L de EDTA) y se incuba a 37 ° C hasta que monocapa de células comienza a desprenderse de la parte inferior del tejido placa de cultivo y las células se disocian. </li><li> Diluir la suspensión de células con 9 partes de fibroblmedio de cultivo ast para neutralizar la acción de la tripsina. </li><li> Recuento de células utilizando una cámara de recuento bajo un microscopio a temperatura ambiente. Calcular el volumen requerido de medio de cultivo de fibroblastos para resuspender las células, para obtener una concentración de células de 7,8 x 10 4 fibroblastos / cm 2. Esto dependerá del tipo específico de la cámara utilizada. Células / l = Promedio del número de células por rejilla (factor de multiplicación) de dilución x 90 x pequeña </li><li> suspensión de células Centrifugar a 150 g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire las células sobrenadante y resuspender con el volumen calculado previamente de medio de cultivo de fibroblastos. </li><li> Células de la placa en un 0,1% de gelatina platos y cultivarlas durante 24 horas a 37 ° C en 5% de CO2 pre-recubiertos. </li></ol> 4. Aumentar la plasticidad celular utilizando el De-metilación agente 5-aza-CR <ol><li> día 0 <ol><li> Preparar 5 aza-CR-solución madre disolviendo 2,44 mg de 5-aza-CR en 10 ml de DMEM de alta glucosa medium. Esterilizar por filtración. Preparar 5-aza-CR de stock inmediatamente antes de su uso. </li><li> Diluir 1 l de 5-aza-CR solución madre en 1 ml de medio de cultivo de fibroblastos (concentración final 1 mM). </li><li> Para aumentar la plasticidad de las células, 24 horas después de la siembra de células (subpartida 3,8), retire el medio de cultivo de fibroblastos sembrados y añadir 1 M 5-aza-CR solución madre y la cultura durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO2. </li></ol></li><li> Día 1 <ol><li> Preparar medio fresco Pluripotentes (HP) tal como se describe en la Tabla 1. </li><li> Después de la incubación con 1 M 5-aza-CR, retire medio y lavar las células tres veces con PBS para garantizar que el 5-aza-CR se enjuaga de distancia. </li><li> Incubar 5-aza-CR fibroblastos tratados con medio de HP durante 3 horas (periodo de recuperación) a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Después de que el período de recuperación, eliminar medio, lavar tres veces con PBS. </li><li> Para monitorizar la eficacia del tratamiento 5-aza-CR, comprobar en esta etapa fo la presencia de cambios morfológicos (detalla en la sección Resultados). Las células pierden la típica morfología alargada de fibroblastos y adquieren una forma redonda u ovalada, cada vez más pequeños en tamaño, con núcleos grandes. </li><li> Proceder con la diferenciación de páncreas. </li></ol></li></ol> 5. protocolo de diferenciación pancreático <ol><li> 1-6 días <ol><li> Preparar pancreático medio basal tal como se describe en la Tabla 2. </li><li> Preparar una solución madre de activina: disolver 5 g de proteína activina A humana recombinante en 166,6 l de agua estéril. </li><li> Cultura 5-aza-CR fibroblastos tratados de 0,26 ml / cm2 de páncreas medio basal suplementado con 1 l / ml activina una solución de reserva (véase 5.1.2) durante 6 días a 37 ° C en 5% de CO2. Cambiar de un día medio. </li></ol></li><li> 7-8 días <ol><li> Preparar la solución de ácido retinoico de stock mediante la adición de 16,6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 50 mg de aci retinoicore. </li><li> Células de cultivo de 0,26 ml / cm2 de páncreas medio basal suplementado con 1 l / ml de activina una solución de reserva (véase 5.1.2) y 1 l / solución de ácido retinoico Stock ml (ver 5.2.1) durante 2 días a 37 ° C en 5% de CO 2. Cambiar de un día medio. </li></ol></li><li> 9-36 días <ol><li> Células de cultivo en 0,26 ml / cm 2 de páncreas medio basal suplementado con 1% (v / v) de insulina-transferrina-selenio (ITS), 2% (v / v) B27 y 0,1% (v / v) recombinante FGF humano básico (bFGF) solución de reserva (véase la Tabla 1) a 37 ° C en 5% de CO2. Cambiar el medio al día durante los primeros 15 días. </li><li> De día 16 en adelante, volver a cargar medio cada dos días, con un microscopio, ya que la formación de células de agregado puede separar de la parte inferior de la placa de cultivo. </li></ol></li></ol>

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<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
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<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El presente manuscrito describe un método que permite la conversión de fibroblastos de piel humana en células productoras de insulina, a través de una exposición transitoria y breve a 5-aza-CR, seguido de un protocolo de inducción específica de tejido. Este enfoque permite un interruptor del mesodermo a las células relacionadas con endodermo, sin la expresión forzada de factores de transcripción o microRNAs ni la adquisición de un estado pluripotente estable, que hace que las células más inestable y propenso a errores <...

Un objetivo fundamental de la medicina regenerativa es la generación de células nuevas y funcionales que se pueden utilizar para reparar o reemplazar dañado, degenerado tejidos. Rehacer células adultas fácilmente disponibles en otros nuevos, mediante la conversión de un tipo de célula a otra, es un enfoque particularmente atractivo, especialmente cuando la población de células requerido no es abundante o de difícil acceso. Sin embargo, las células adultas son extraordinariamente estables. Adquieren su estado diferenciado a través de una restricción gradual en sus opciones y, una vez que lleguen a la terminal de especialización madura, que se retengan de manera estable 1. En los últimos años se han desarrollado una serie de protocolos, que permitan la reasignación a la pluripotencia de una célula somática (iPS) logrado a través de la expresión forzada de un conjunto de factores de transcripción 2,3. Alternativamente, la conversión de células puede obtenerse por transdiferenciación linaje directo, la introducción de un solo 4 </sup&gt; o una combinación de factores de transcripción 5-7. Esta estrategia no implica la transición a través de un estado de-diferenciado, pero sí requiere una alta expresión de los factores de la transcripción específica 8. Hemos desarrollado recientemente un protocolo de conversión basado en la breve exposición de las células adultas a las propiedades de desmetilación del análogo de citidina 5-azacitidina (5-aza-CR), un inhibidor de la metiltransferasa de ADN bien caracterizado. La etapa de desmetilación es seguido inmediatamente por un protocolo de diferenciación específica 9-11 que permite obtener el fenotipo de terminal requerida. Este método es capaz de convertir células maduras, diferenciadas en células de un linaje diferente y tiene la ventaja sustancial para evitar tanto el uso de vectores virales y la transfección de los factores de transcripción exógenas. La adquisición de un estado pluripotente estable, y el aumento de la susceptibilidad relacionada con la inestabilidad celular también se evita. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; El protocolo detallado que permite la conversión de fibroblastos de piel humana adultas en células completamente funcionales secretoras de insulina se presenta aquí. Sin embargo, vale la pena señalar que la técnica se ha aplicado a diferentes tipos de células y ha generado resultados positivos, al dirigirse a células hacia diferentes vías de diferenciación. Además, la conversión epigenética se ha utilizado con éxito en la especie humana y porcina 9-13, así como en el perro (manuscrito presentado) lo que sugiere una amplia eficacia y la robustez de la aproximación.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; para el lavado celular y la preparación de soluciones</td></tr><tr><td>Solución antibiótica antimicótica</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>Para el aislamiento de fibroblastos</td></tr><tr><td>Gelatina porcina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Para el recubrimiento de platos</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Para la preparación de soluciones</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Para el aislamiento de fibroblastos</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Para medio de cultivo de fibroblastos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies 10500064</td><td></td><td>FBS; Componente de fibroblastos y medios HP</td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos</td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>para la disociación de fibroblastos</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 CON REJILLAS</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Recuento</td></tr><tr><td>de células 5-Azacitidina</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, para células crécreas Plasticidad en fibroblastos</td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-10</td> de Ham <td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>para medio HP</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa baja, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>para medio HP</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>componente de la</td></tr><tr><td>solución de aminoácidos no esenciales MEM</td> medio HP <td>Life Technologies</td><td>11140035</td><td>Componente de HP y medios basales pancreáticos</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td></td><td>Sigma M7522</td><td>Componente de HP y medios basales pancreáticos</td></tr><tr><td>Guanosina</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP</td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 & m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Para la esterilización de la solución</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF; Componente del medio basal HP y pancreático</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina Sigma</td><td></td><td>A3311</td><td>BSA; Componente del medio basal pancreático</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>para medio basal pancreático</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento Menos Vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>Componente del medio pancreático</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td> Life <td>Technologies</td><td>17502048</td><td>componente del medio basal pancreático</td></tr><tr><td>Activina A Proteína humana recombinante</td> Life <td>Technologies</td><td>PHG9014</td><td>Para el medio pancreático</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Para el medio pancreático</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO; para la preparación de caldos de ácido retinoico</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS; para el medio final pancreático</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Vimentina&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo&nbsp; 1 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>5-Metilcitidina</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo de péptido anti-C &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PDX1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insulina ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>Para la detección de liberación de insulina</td></tr></tbody></table>

conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

La medicina regenerativa requiere células nuevas y completamente funcionales que se entregan a los pacientes para reparar los tejidos degenerados o dañados. Cuando estas células no están fácilmente disponibles, pueden obtenerse utilizando diferentes enfoques que incluyen, entre los muchos, la reprogramación y la transdiferenciación, con ventajas y limitaciones que son específicas de las diferentes técnicas. Aquí se describe una nueva estrategia para la conversión de un fibroblasto maduro adulto en una célula secretora de insulina, designada arbitrariamente como células epigenéticas convertidas (EpiCC). El método se ha desarrollado sobre la base de la creciente comprensión de los mecanismos que controlan la regulación epigenética del destino y la diferenciación celular. En particular, el primer paso utiliza un modificador epigenético, a saber, la 5-aza-citidina, para llevar a las células adultas a un estado "altamente permisivo". A continuación, aprovecha esta breve y reversible ventana de plasticidad epigenética para redirigir las células hacia un linaje diferente. El enfoque se denomina "conversión celular epigenética". Es una forma sencilla y robusta de obtener un conmutador interlinaje celular eficiente, controlado y estable. Dado que el protocolo no implica el uso de ninguna transfección de genes, está libre de vectores virales y no implica un estado pluripotente estable, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Establecimiento de cultivo primario a partir de biopsias de la piel Las biopsias de piel se cortaron en fragmentos pequeños y se colocan en platos de gelatina pre-revestidas. Después de 6 días, los fibroblastos empezaron a crecer fuera de los fragmentos de tejido y formaron una monocapa de células (Figura 1A). Las células mostraron una típica forma alargada y, como se esperaba, mostraron una inmune-positividad uniforme para el fibroblasto vimentina marcador especí...

Aquí, se presenta un nuevo método que permite la conversión de fibroblastos adultos de la piel en células secretoras de insulina. Esta técnica se basa en la conversión epigenética, no implica el uso de vectores retrovirales ni la adquisición de un estado pluripotente estable. Por lo tanto, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

El objetivo general de este procedimiento es convertir fibroblastos en células secretoras de insulina sin inducir pluripotencia ni utilizar vectores retrovirales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa y, en particular, en la terapia celular de la diabetes. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener un cambio en el fenotipo sin inducir un estado pluripotente estable en las células en conversión y sin emplear vectores retrovirales.La procedura será demostrada por Georgia Pennarossa, una posdoctoranda en nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue 1,5 mililitros de gelatina porcina estéril al 0,1 % a las placas de Petri de 35 milímetros y permita el recubrimiento durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lave las biopsias de piel humana con PBS suplementado con una solución antibiótica antimicótica al 2 %.Posteriormente, coloque las biopsias en una placa de Petri de 100 milímetros y córtelas en fragmentos de aproximadamente dos milímetros cúbicos con escalpelos estériles. Luego, coloque de cinco a seis fragmentos de piel en la placa de Petri de 35 milímetros previamente recubierta. Añada una gota de medio para fibroblastos sobre cada fragmento y cultívelos a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono.Después de seis días de incubación, deseche cuidadosamente los fragmentos de tejido. Los fibroblastos deben comenzar a crecer a partir de los fragmentos de tejido y empezar a formar una monocapa celular. En este procedimiento, cultive los fibroblastos a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono hasta alcanzar el 80% de confluencia.Luego, siembre las células en nuevas placas de cultivo. Incúbelas a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono y mantenga la relación de pase entre uno a dos y uno a cuatro, según la tasa de crecimiento. A continuación, agregue 0,1% de gelatina porcina a las placas de cultivo celular y permita el recubrimiento durante dos horas.Elimine el exceso de solución de recubrimiento entre 10 y 30 minutos antes de sembrar los fibroblastos. A continuación, retire el medio de cultivo de los fibroblastos de las placas de cultivo. Lave las células tres veces con PBS suplementado con una solución antibiótico antimicótica al 1 %.Luego, agregue una capa delgada de solución de tripsina-EDTA. Incube a 37 grados Celsius hasta que la monocapa celular comience a desprenderse del fondo del recipiente de cultivo de tejidos y las células se disocien. A continuación, diluya la suspensión celular con nueve partes de medio de cultivo para fibroblastos con el fin de neutralizar la acción de la tripsina.A continuación, cuente las células utilizando una cámara de recuento bajo el microscopio a temperatura ambiente. Calcule el volumen de medio de cultivo de fibroblastos necesario para resuspender las células y obtener una concentración celular de 7,8 × 10⁴ fibroblastos por centímetro cuadrado. Posteriormente, centrifugue la suspensión celular a 150 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, elimine el sobrenadante y re-suspenda las células con un volumen calculado de medio de cultivo para fibroblastos. Posteriormente, siembre las células en placas recubiertas previamente con gelatina al 0,1 % y cultívelas durante 24 horas a 37 grados Celsius en un ambiente con 5 % de dióxido de carbono. En el día cero, inmediatamente antes de su uso, prepare la solución stock de 5-aza-CR disolviendo 2,44 miligramos de 5-aza-CR en 10 mililitros de medio DMEM con alta concentración de glucosa.Sterilícelo mediante filtración. A continuación, diluya un microlitro de la solución stock de 5-aza-CR en un mililitro de medio de cultivo de fibroblastos. Para aumentar la plasticidad celular, 24 horas después del siembra de las células, retire el medio de cultivo de los fibroblastos sembrados.Añada una solución stock de 5-aza-CR de un micromolar y cultive durante 18 horas a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono. En el día uno, prepare medio HP fresco. Tras la incubación con 5-aza-CR de un micromolar, retire el medio y lave las células tres veces con medio HP para asegurar que el 5-aza-CR se haya eliminado completamente.A continuación, incubar los fibroblastos tratados con 5-aza-CR en medio HP durante tres horas a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono. Para monitorear la eficiencia del tratamiento con 5-aza-CR, verificar cualquier cambio morfológico. Las células deben perder la morfología alargada típica de los fibroblastos y adquirir una forma más pequeña, redonda u ovalada, con núcleos agrandados.Desde el día uno hasta el seis, prepare el medio basal pancreático y la solución stock de Activina A. A continuación, cultive los fibroblastos tratados con 5-aza-CR en medio basal pancreático suplementado con la solución stock de Activina A durante seis días a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono y cambie el medio diariamente. Desde el día siete hasta el ocho, prepare la solución stock de ácido retinoico añadiendo 16,6 mililitros de DMSO a 50 miligramos de ácido retinoico.Cultive las células en medio basal pancreático suplementado con solución stock de Activina A y solución stock de ácido retinoico durante dos días a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono y cambie el medio diariamente. De los días nueve al 36, cultive las células en medio basal pancreático suplementado con soluciones stock de ITS, B27 y BFGS, y cambie el medio diariamente durante los primeros 15 días y renueve el medio cada dos días a partir del día 16. Cultive las células a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono.Esta figura muestra los cambios morfológicos que tienen lugar durante la diferenciación pancreática endocrina. Después de siete días de inducción, las células humanas se organizan gradualmente en cúmulos. En respuesta a la adición de ácido retinoico, se reorganizan en un patrón reticular y se agrupan en agregados distinguibles.Estas formaciones progresan con el tiempo, reclutando células y agregando colonias tridimensionales aumentadas. Finalmente, las colonias se convierten en estructuras esféricas que tienden a desprenderse y flotar libremente en el medio de cultivo, recordando a los islotes pancreáticos típicos in vitro. Después de 36 días de inducción pancreática, los niveles globales de metilación del ADN en las células epigenéticamente convertidas regresaron a los observados en los fibroblastos no tratados.La co-localización de PDX1 con CPEP se observa al final del período de conversión, mientras que estos marcadores pancreáticos endocrinos están completamente ausentes en los fibroblastos no tratados. Este gráfico muestra la cantidad de insulina liberada por las células convertidas epigenéticamente en respuesta a la exposición a D-glucosa 20 milimolar y L-glucosa 20 milimolar. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 38 días si se lleva a cabo correctamente.Tras su desarrollo, esta investigación allanó el camino para que los investigadores en el área de la medicina regenerativa exploraran la terapia celular de la diabetes en humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir fibroblastos en células secretoras de insulina sin inducir pluripotencia ni utilizar vectores retrovirales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

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Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

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Aprende a convertir fibroblastos de piel adulta en células secretoras de insulina mediante conversión epigenética sin inducir pluripotencia ni usar vectores retrovirales. Este método seguro avanza la terapia celular para diabetes.

Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos (Video) | JoVE Journal

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