Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

El objetivo general de este procedimiento es convertir los fibroblastos en células secretoras de insulina sin inducir pluripotencia ni utilizar vectores retrovitales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa y, en particular, en la terapia celular de la diabetes. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener un cambio en el fenotipo sin inducir un estado pluripotente estable en las células convertidoras y sin vectores retrovirales.

La responsable de la demostración del procedimiento correrá a cargo de Georgia Pennarossa, investigadora postdoctoral en nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue 1,5 mililitros de gelatina porcina estéril al 0,1% a las placas de Petri de 35 milímetros y deje que se reboce durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lavar las biopsias de piel humana con PBS suplementado con una solución antimicótica antibiótica al 2%.

Después, coloque las biopsias en una placa de Petri de 100 milímetros y córtelas en fragmentos de aproximadamente dos milímetros cúbicos con bisturíes estériles. Luego, coloque de cinco a seis fragmentos de piel en la placa de Petri de 35 milímetros prerrecubierta. Agregue una gota de medio fibroblasto sobre cada fragmento y cultívelos a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%.

Después de seis días de incubación, deseche los fragmentos de tejido con cuidado. Los fibroblastos deben comenzar a crecer a partir de los fragmentos de tejido y comenzar a formar una monocapa celular. En este procedimiento, se cultivan los fibroblastos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono hasta una confluencia del 80%.

A continuación, coloque las células en nuevas placas de cultivo. Cultívelos a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono y mantenga la proporción de paso entre uno a dos y uno a cuatro, dependiendo de la tasa de crecimiento. A continuación, agregue gelatina porcina al 0,1% a las placas de cultivo celular y deje que se cubra durante dos horas.

Retire el exceso de solución de recubrimiento de 10 a 30 minutos antes de colocar los fibroblastos. A continuación, retire el medio de cultivo de fibroblastos de las placas de cultivo. Lavar las células tres veces con PBS suplementado con una solución antimicótica antibiótica al 1%.

A continuación, añada una fina capa de solución de tripsina-EDTA. Incubar a 37 grados centígrados hasta que la monocapa celular comience a desprenderse del fondo de la placa de cultivo de tejidos y las células se disocien. Después de eso, diluya la suspensión celular con nueve partes de medio de cultivo de fibroblastos para neutralizar la acción de la tripsina.

Luego, cuente las células usando una cámara de conteo bajo el microscopio a temperatura ambiente. Calcular el volumen de medio de cultivo de fibroblastos necesario para volver a suspender las células y obtener la concentración celular de 7,8 veces 10 al 4º fibroblasto por centímetro cuadrado. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 150 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con un volumen calculado de medio de cultivo de fibroblastos. A continuación, coloque las células en las placas prerrecubiertas de gelatina al 0,1% y cultívelas durante 24 horas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. El día cero, inmediatamente antes de su uso, prepare la solución madre de 5-aza-CR disolviendo 2,44 miligramos de 5-aza-CR en 10 mililitros de medio DMEM con alto contenido de glucosa.

Esterilizarlo por filtración. A continuación, diluya un microlitro de solución madre de 5-aza-CR en un mililitro de medio de cultivo de fibroblastos. Para aumentar la plasticidad celular, 24 horas después de la siembra celular elimine el medio de cultivo de los fibroblastos sembrados.

Añadir una solución madre micromolar de 5-aza-CR y cultivar durante 18 horas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. El primer día, prepare un medio HP fresco. Después de la incubación con un micromolar 5-aza-CR, retire el medio y lave las células tres veces con medio HP para asegurarse de que se enjuague el 5-aza-CR.

A continuación, se incuabase los fibroblastos tratados con 5-aza-CR con medio HP durante tres horas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Para controlar la eficacia del tratamiento con 5-aza-CR, compruebe si hay cambios morfológicos. Las células deben perder la morfología alargada típica de los fibroblastos y adquirir una forma redonda u ovalada más pequeña con núcleos agrandados.

Del uno al sexto día, prepare el medio basal pancreático y la solución madre de activina A. A continuación, se cultivan los fibroblastos tratados con 5-aza-CR en medio basal pancreático suplementado con solución madre de activina A durante seis días a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% y se cambia el medio diariamente. En los días siete a ocho, prepare la solución madre de ácido retinoico agregando 16.6 mililitros de DMSO a 50 miligramos de ácido retinoico.

Cultive las células en medio basal pancreático suplementado con una solución madre de activina A y una solución madre de ácido retinoico durante dos días a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% y cambie el medio diariamente. Del día nueve al 36, cultive las células y el medio basal pancreático suplementado con una solución madre de ITS, B27 y BFGS y cambie el medio diariamente durante los primeros 15 días y refresque el medio cada dos días a partir del día 16. Cultive las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.

Esta figura muestra los cambios morfológicos que tienen lugar durante la diferenciación endocrina pancreática. Después de siete días de inducción, las células humanas se organizan gradualmente en grupos. En respuesta a la adición de ácido retinoico, se reorganizan en un patrón reticular y se agrupan en agregados distinguibles.

Estas formaciones progresan con el tiempo, reclutando células y agregando colonias 3D ampliadas. Finalmente, las colonias se convierten en estructuras esféricas que tienden a desprenderse y fluyen libremente en el medio de cultivo, lo que recuerda a los típicos islotes pancreáticos in vitro. Después de 36 días de inducción pancreática, los niveles globales de metilación del ADN de las células epigenéticas humanas convertidas volvieron a los observados en los fibroblastos no tratados.

La colocalización de PDX1 con CPEP se observa al final del período de conversión, mientras que estos marcadores pancreáticos endocrinos están completamente ausentes en los fibroblastos no tratados. Este gráfico muestra la cantidad de insulina liberada de las células epigenéticas convertidas en respuesta a una exposición de 20 milimolares a la D-glucosa y a 20 milimolares de L-glucosa. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 38 días si se realiza correctamente.

Después de su desarrollo, esta investigación allanó el camino para que los investigadores en el área de la medicina regenerativa exploraran la terapia celular de la diabetes en humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir los fibroblastos en células secretoras de insulina sin inducir pluripotencia ni usar vectores retrovirales.