Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

El objetivo general de este protocolo de inmunotinción es detectar la expresión proteica en embriones de áfidos. Se identifican condiciones críticas que aumentan la permeabilidad del tejido y reducen la tinción de fondo, problemas persistentes al teñir tejidos embrionarios de áfidos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona condiciones específicas para una penetración eficaz de los anticuerpos y una reducción de la tinción de fondo, aspectos que por lo general no se describen en un protocolo estándar de inmunotinción.

Tuvimos por primera vez esta idea de esta medida cuando estábamos estudiando cómo se especifican las células germinales en un pulgón de la arveja, un modelo de insecto para estudios genómicos y ambientales. La cepa de laboratorio del pulgón de la arveja, a. pisum, fue recolectada originalmente en el centro de Taiwán y se ha criado en plantas hospederas durante más de 300 generaciones.

Para germinar, remoje las semillas de las plantas hospederas en agua del grifo durante tres a cinco días a temperatura ambiente. Cambie el agua fresca una vez al día. Cultive diez semillas germinadas en una maceta pequeña con suelo, en la cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 20 grados Celsius.

Aproximadamente 10 días después de que comienza el crecimiento, la altura de las plantas generalmente supera los ocho centímetros. Mantenga cada maceta de plantas dentro de un vaso de vidrio de un litro y transfiera áfidos adultos a las plantas utilizando un pincel. Luego, selle el vaso con una cubierta permeable al aire, como una malla de gasa, para evitar que los áfidos escapen.

Incube los áfidos en una cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 20 grados Celsius, regando cada maceta de plantas una vez al día. Llene un pocillo de una placa de análisis con aproximadamente 500 microlitros de paraformaldehído al 4 por ciento. Coloque la placa bajo un estereomicroscopio con baja magnificación y sumerja un áfido adulto en el paraformaldehído para su disección.

Disecte los ovarios sosteniendo la cabeza y el abdomen con un par de pinzas, cortando la cutícula dorsal del abdomen y arrastrando los ovarios fuera de la cavidad abdominal. A continuación, fije tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, con agitación suave en un mezclador. Deseche el tampón de fijación con una pipeta de vidrio y luego lave los ovarios con PBST tres veces durante 10 minutos, con agitación suave.

Para tratar los ovarios, primero incubarlos con proteinasa K durante 10 minutos con agitación suave para aumentar la permeabilidad de los tejidos embrionarios. Tras la incubación, desechar la solución de proteinasa K y luego lavar los ovarios con 700 microlitros de glicina tres veces durante cinco minutos. A continuación, lavar los ovarios con PBST dos veces durante 10 minutos.

Fije nuevamente los ovarios con tampón de fijación durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Para suprimir la actividad peroxidasa endógena, deshidrate seriamente los ovarios con diferentes porcentajes de metanol en PBST al 0,2 por ciento con relaciones de volumen de uno a tres, uno a uno y tres a uno, y luego incube adicionalmente los ovarios con metanol al 100 por ciento durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, rehidrate seriamente los ovarios, según se indica en el protocolo de texto.

Para tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 mililitros, 200 microlitros es el volumen mínimo para el bloqueo de la muestra y la tinción con anticuerpo. Incube los ovarios con la solución de bloqueo DIG-B 1x durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados Celsius, con agitación suave. Tras la incubación, deseche el sobrenadante y sustitúyalo por solución de bloqueo DIG-B 1x fresca, que contenga el anticuerpo primario en la proporción de dilución adecuada.

Tiña los ovarios durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave. Después de lavar los ovarios según se describe en el protocolo del texto, deseche el sobrenadante y reemplácelo con una solución de bloqueo DIG-B 1x fresca que contenga el anticuerpo secundario en la proporción de dilución adecuada, y tiña los ovarios como antes. Para la tinción inmunofluorescente, realice la tinción en la oscuridad, porque el anticuerpo secundario es sensible a la luz.

El grosor de los embriones de áfidos varía entre las etapas de desarrollo. Por lo tanto, las estrategias de montaje se modifican para adaptarse a embriones tempranos, intermedios y tardíos. Transfiera los ovarios, junto con el medio de montaje, a la bandeja celular utilizando un gotero de plástico, y observe las muestras bajo un estereomicroscopio con baja ampliación.

Corte los callos asociados con el oviducto lateral utilizando alfileres de insecto y luego transfiera un ovariólo aislado a un pozo de vidrio vacío con una pipeta. Ajuste el volumen final entre 50 y 100 microlitros utilizando medio de montaje. A continuación, transfiera un ovariólo a la placa con una pipeta de vidrio.

Disecte las cámaras ovocelulares utilizando alfileres para insectos. Para embriones con más de seis estadios de desarrollo, se sugiere la separación de las cámaras ovocelulares. Para los germarios y las dos primeras cámaras ovocelulares, la separación es opcional.

Reubique una cámara de huevo diseccionada en un portaobjetos limpio utilizando un gotero de vidrio. Para embriones en las etapas uno a 10 de desarrollo, coloque lentamente una cubreobjetos sobre los ovarios o cámaras de huevo diseccionadas para evitar burbujas. Alternativamente, para embriones en las etapas 11 a 18 de desarrollo, monte las cámaras de huevo en un portaobjetos con un puente de cubreobjetos de un solo lado y coloque otra cubreobjetos encima de la muestra.

Para embriones con más de la fase 19 de desarrollo, monte las cámaras ováricas sobre un portaobjetos con un puente de cubreobjetos de doble cara y coloque otro cubreobjetos encima de la muestra. A continuación, llene el espacio debajo del cubreobjetos superior con medio de montaje para evitar que la muestra se seque. Ruede suavemente el cubreobjetos superior para obtener la orientación adecuada para la observación.

Finalmente, selle alrededor del borde de las cubreobjetos, incluidas las cubreobjetos puente, con esmalte de uñas antes de realizar el análisis de imágenes, como se describe en el protocolo escrito. Aquí se muestra un par de ovarios disecados de una hembra adulta. Un ovariólo está compuesto por un germario, uno o dos sitios O, más cinco a siete embriones, todos los cuales se alojan dentro de cámaras ovulares de manera sucesiva como en una línea de ensamblaje.

Después de la fijación con paraformaldehído, se recomienda encarecidamente la digestión de los ovarios en una solución de Proteinasa K a una concentración de un microgramo por mililitro durante 10 minutos. Los resultados de tinción muestran que la intensidad de la señal aumenta significativamente en los embriones digeridos con Proteinasa K. La incubación de los embriones en la solución bloqueante de un conjunto de tampones basado en DIG reduce más la tinción de fondo que la incubación en suero de cabra normal y albúmina de suero bovino.

La actividad endógena de la peroxidasa también puede provocar una tinción de fondo elevada. Estos estudios revelan que sumergir embriones de áfidos en metanol puede suprimir la actividad de la peroxidasa de manera mucho más eficiente que tratar los embriones con peróxido de hidrógeno. Las condiciones críticas reveladas en este estudio pueden aplicarse para la detección de señales tanto en células germinales como en células somáticas.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una inmunomarcación exitosa en embriones de áfidos, incluyendo la elevación de la intensidad de señal y la reducción de la tinción de fondo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular cada embrión con cuidado para obtener una buena forma de los embriones.

No olvide que trabajar con paraformaldehído y DAPI puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, durante la realización de este procedimiento. Tras este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como la hibridación *in situ* para responder preguntas adicionales, como si el ARN mensajero se localiza junto con su producto proteico en las células embrionarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología ambiental de insectos, como la forma en que se especifican las células germinales y cómo se determinan las células ovulares en distintas fases reproductivas de los áfidos.