Name: Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a realizar inmunotinción en embriones del guisante áfido Acyrthosiphon pisum, optimizando la permeabilidad tisular y reduciendo el fondo para detectar proteínas con precisión en estudios de biología del desarrollo.

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Estamos agradecidos a Chau-Ti Ting (Fly Core en Taiwán) por proporcionar el anticuerpo monoclonal 4D9, a Technology Commons (TechComm) de la Facultad de Ciencias de la Vida NTU por la microscopía confocal, a Hsiao-Ling Lu por corregir el manuscrito y a Chen-yo Chung por ayudar en la filmación. CC agradece especialmente a Charles E. Cook por proporcionar sugerencias estratégicas y por la edición crítica del manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio de Ciencia y Tecnología (101-2313-B-002-059-MY3 y 104-2313-B-002-022-MY3 para GWL y CC), y la Universidad Nacional de Taiwán (NTU-CESRP 101R4602D3 para CC; 103R4000 para GWL).

1. Cultura de áfidos NOTA:. La cepa de laboratorio de la partenogenética vivíparos pulgón del guisante Un pisum se recogió originalmente en el centro de Taiwan, y se ha criado en las plantas hospedantes (la sativum jardín guisante Pisum o haba Vicia faba) bajo largo día fotoperiodo para más de 300 generaciones (una generación: ~ 10 días). <ol><li> La germinación de las semillas <ol><li> Remoje las semillas de plantas hospederas en agua del grifo durante 3-5 días a temperatura ambiente. Vuelva a llenar con agua dulce una vez al día. NOTA: Como alternativa, poniendo semillas de plantas huéspedes directamente en el suelo húmedo puede inducir la germinación también. </li><li> Crece 10 semillas que germinan en una olla pequeña (9 cm de diámetro x 7 cm de altura) con el suelo en la cámara de crecimiento bajo fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad a 20 ° C. </li><li> Unos 10 días después empieza el crecimiento, transferir los áfidos sobre las plantas cuya altura es de más de 8 cm. </li></ol></li><li> Transferencia de áfidos <ol&gt; <li> Mantenga cada maceta de plantas dentro de un vaso de vidrio de 1 litro, transferir 8 pulgones adultos sobre las plantas utilizando un pincel, y luego sellar el vaso con una cubierta permeable al aire como malla de gasa para evitar que los áfidos se escape. </li><li> Incubar pulgones en una cámara de crecimiento bajo fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad a 20 ° C. Riegue cada maceta de plantas una vez al día. </li><li> Para la obtención de la próxima generación de pulgones, reiterar pasos 1.1.3-1.2.2 diez días después de la transferencia de áfidos primaria. </li></ol></li></ol> 2. La disección y fijación de Ovarios <ol><li> Recién preparar 4% de paraformaldehído (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) como tampón de fijación. </li><li> Llenar un pocillo de una placa de lugar con PFA (aproximadamente 500 l), colocar la placa bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento, y sumergir un áfido adulto dentro de la PFA para la disección. </li><li> Diseccionar ovarios mediante la celebración de la cabeza y el abdomen con un juego de pinzas, cortar y abrir el dorsalcutícula del abdomen, y arrastrando los ovarios lejos de la cavidad abdominal. </li><li> Fijar tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 ml que contiene 1 ml de PFA a TA durante 20 min. </li><li> Tampón fijación Decantar con una pipeta de transferencia (ya sea de vidrio o desechables) y luego lavar ovarios con 0,2% Triton X-100 en PBS 1x (PBST) 3 veces durante 10 minutos cada uno. Leve temblor en un mezclador / rotador (ángulo de rotación: 60 ° (F60) / velocidad de rotación: 8 RPM) se recomienda tanto para la fijación y lavado. </li></ol> 3. El tratamiento con proteinasa K (PK) para aumentar la permeabilidad de los tejidos embrionarios NOTA: El tratamiento PK se aplica a los embriones de extensión de banda de germen en adelante (etapa 11 del desarrollo). Para los embriones más jóvenes, este paso es opcional. <ol><li> En serie diluir la solución madre de PK (10 mg / ml) con PBS 1x a la concentración de trabajo 1 g / ml. </li><li> Incubar ovarios con 1 mg / ml de PK (aproximadamente 500 l) durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Decantar PK solutiy luego lavar los ovarios con 700 l de glicina (2 mg / ml) 3 veces durante 5 minutos cada uno. </li><li> Lave ovarios con 0,2% PBST dos veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Fijar ovarios de nuevo con tampón de fijación durante 15 min a RT con agitación suave. </li><li> Desechar el sobrenadante y lavar ovarios con 0,2% PBST dos veces durante 10 minutos cada uno. </li></ol> 4. El metanol incubación para Suprimir la actividad de peroxidasa endógena (POD) NOTA: incubación metanol no se aplica a los embriones sometidos a faloidina de tinción de anticuerpos o epítopos que son metanol sensible. <ol><li> En serie deshidratar ovarios con diferente porcentaje de metanol en 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) mediante la incubación de los ovarios en cada concentración de la solución de metanol durante 10 min con agitación suave. </li><li> Deshidratar ovarios con 100% de metanol durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. NOTA: Los resultados satisfactorios de tinción aún podían obtenerse a partir de tejidos de áfidos que se almacenaron en el 100% de metanol a -20 y# 176; C durante un mes. </li><li> En serie rehidratar ovarios con diferente porcentaje de metanol en 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) mediante la incubación de los ovarios en cada concentración de la solución de metanol durante 10 min con agitación suave. </li></ol> 5. Anticuerpo tinción <ol><li> Diluir la solución 10x bloqueo del conjunto de búfer basado en DIG (DIG-B) a 1x. NOTA: La solución de bloqueo 1x DIG-B es más eficaz para reducir el fondo de tinción que el reactivo estándar de bloqueo compuesta de 5% (v / v) de suero de cabra normal (NGS) y 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA ) en 0,2% PBST. </li><li> Incubar los ovarios con la solución 1x DIG-B de bloqueo para 2,5 a 4 horas a RT o O / N a 4 ° C con agitación suave. NOTA: Para los tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 ml, 200 l es el volumen mínimo para el bloqueo de la muestra y la tinción de anticuerpos. </li><li> Decantar el sobrenadante y reemplazarlo con solución de bloqueo 1x DIG-B fresco que contiene anticuerpo primario a diluti apropiadaen relación. Manchar los ovarios durante 4 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación suave. NOTA: Para el experimento descrito aquí, utilice las siguientes diluciones óptimas de anticuerpos primarios: (1) anticuerpos ApVas1: 1: 500 para la tinción cromogénico, 1:50 para la tinción de inmunofluorescencia; (2) anticuerpo anti-tubulina α: 1: 500; (3) anticuerpo monoclonal 4D9: 1:25. </li><li> Lave ovarios con 0,2% PBST 4 veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar ovarios con solución de bloqueo 1x DIG-B durante 1 hora a RT con agitación suave. </li><li> Decantar el sobrenadante y reemplazarlo con solución fresca bloqueo DIG-B 1x contiene anticuerpo secundario en relación de dilución apropiado. Manchar los ovarios durante 4 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación suave. <ol><li> Utilice las siguientes relaciones de dilución de anticuerpos secundarios: (1) Para la tinción de inmunofluorescencia: 1: 500 de Alexa Fluor 633 cabra anti-IgG de conejo o Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de ratón; (2) Para la tinción cromogénico: 1: 200 para biotinilado de cabra anti-IgG de conejo. NOTA: El anticuerpo secundario biotinilado se aplica para interactuar con la avidina-biotina-complejo (ABC) en el (cromogénico) la detección basada en sustrato, a través del cual las señales de tinción se amplifican de manera significativa. </li><li> Para la tinción de inmunofluorescencia, llevar a cabo la tinción en la oscuridad debido a que el anticuerpo secundario es sensible a la luz. </li></ol></li><li> Lavar anticuerpo secundario con 0,2% PBST 4 veces durante 10 min cada uno. </li></ol> 6. Nuclear y F-actina tinción NOTA: Esto sólo se aplica para la tinción de inmunofluorescencia. <ol><li> Tinción de ovarios con 0,2% PBST que contiene DAPI (2 ng / l) y faloidina-TRITC (100 nM) durante 2 horas a RT en la oscuridad. </li><li> Lave ovarios con 0,2% PBST 4 veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar ovarios con el medio de montaje O / N a 4 ° C con agitación suave. </li></ol> 7. Desarrollo de señal NOTA: Esto sólo se aplica para la tinción cromogénico. <ol><li> Preparar 100 l dereactivo de avidina-biotina-complejo (ABC) para la mejora de las señales mediante la adición de 1 l de Reactivo A (avidina) en 98 l de 0,2% PBST, mezclando bien a través de pipeteo suave, y la adición de 1 l de Reactivo B (biotina conjugado con peroxidasa de rábano picante ), seguido de una mezcla inmediata. Incubar la mezcla durante 30 min a TA con agitación suave. </li><li> Incubar ovarios (incluyendo las cámaras de huevo disociados) en la mezcla de los reactivos A y B durante 30 min a RT con agitación suave. </li><li> Lavar la mezcla de los reactivos A y B con 0,2% PBST 4 veces durante 10 min cada uno. </li><li> Transferencia de los ovarios sumergidas en PBST a un pocillo en la placa de punto con un cuentagotas de plástico. </li><li> Prepare la solución de sustrato de 3,3 &#39;diaminobencidina (DAB): disolver una tableta DAB más otro que contiene peróxido de hidrógeno de urea en 1 ml de ddH2O mediante vórtex vigorosamente durante 1 min. NOTA: DAB, precipitando un sustrato de peroxidasa, un cromógeno es popular para la inmunotinción. Produce una brpropia precipitado insoluble y después de ser oxidado por la peroxidasa. Las señales débiles se pueden mejorar mediante la adición de cloruro de níquel a la solución de sustrato (concentración final 0,05 a 0,08%). </li><li> Retire la solución PBST que queda en el pozo y vuelva a llenar con 100 l de la solución de sustrato DAB para el desarrollo de la señal. </li><li> Supervisar la intensidad de las señales bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento. </li><li> Deja de reacciones mediante la eliminación de la solución DAB, seguido por el rellenado de 1x PBS inmediatamente. Repita el lavado dos veces. </li><li> Traslado ovarios de nuevo al tubo de 1,5 ml y lavar con 1x PBS o PBST dos veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar ovarios en un medio basado en glicerol de montaje (70% de glicerol) O / N a 4 ° C con agitación suave. </li></ol> 8. Montaje del áfido embriones NOTA: El espesor de embriones de áfidos varía entre las etapas de desarrollo. Estrategias de montaje están por lo tanto modificarse para adaptarse a tempranas (germaria y etapas 0-10), MID (etapas11-18), y finales de embriones (etapas 19-20), que se demuestra en la Figura 2B - D. Puesta en escena embrionarias siguió Miura et al. 12 <ol><li> Traslado ovarios junto con medio de montaje a la bandeja de la célula con un gotero plástico y observar las muestras bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento. </li><li> Cortar los cálices asociados con el oviducto lateral con alfileres de insectos y luego transferir una ovariole aislado a un vaso vacío y con un gotero. Completar el volumen final a 50 a 100 l usando medio de montaje. </li><li> Transferir una ovariole sobre el portaobjetos con un gotero de vidrio y luego diseccionar cámaras de huevo utilizando pasadores de insectos. NOTA: Para los embriones mayores de la etapa 6 del desarrollo, se sugiere la separación de las cámaras de huevo; para germaria y las dos primeras cámaras de huevos menores de etapa 6, la separación es opcional. </li><li> Cambie de una cámara de huevos disecados a un portaobjetos limpio usando un gotero de vidrio. </li><li> Ponga un cubreobjetos (tamaño: 22 x 22mm) en los germaria disecados o cámaras de huevo (que contiene los embriones en etapas 1-10 del desarrollo) lentamente para evitar burbujas. <ol><li> Cámaras Monte de huevo (que contiene los embriones en etapas 11-18 del desarrollo) en una diapositiva con el puente cubreobjetos unilateral y colocar otro cubreobjetos (tamaño: 18 x 18 mm) en la parte superior de la muestra. </li><li> Cámaras Monte de huevo (que contiene los embriones mayores de la etapa 19 del desarrollo) en un portaobjetos con dos caras puente cubreobjetos y colocar otro cubreobjetos (tamaño: 18 x 18 mm) en la parte superior de la muestra. </li></ol></li><li> Llenar el espacio debajo de la parte superior cubreobjetos con medio de montaje para evitar el secado de la muestra. </li><li> Ligeramente rodar el embrión deslizando el cubreobjetos para obtener la orientación correcta para la observación. </li><li> Selle alrededor del borde del cubreobjetos (incluyendo los cubreobjetos puente) con esmalte de uñas. </li></ol> Análisis 9. Imaging <ol><li> Fotografía de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes de todo el montaje embriones con un compound microscopio equipado con óptica DIC y una lente objetivo seco (10X, 20X, 40X) conectado a una cámara. Instalar el software para la transferencia de imágenes entre la cámara y el ordenador con las instrucciones del fabricante. </li><li> Adquirir las proyecciones de los embriones marcados con fluorescencia con un microscopio confocal láser de barrido 14. Siga las instrucciones del fabricante para fotografiar, z-apilamiento, y 3D se proyecta con software de imágenes. <ol><li> Gire la corredera al revés, encontrar la muestra montada con 10 veces más objetiva, y la vuelta al área de la muestra con una pluma a base engrasada bien. NOTA: Esto hace que la identificación de la muestra más fácil cuando se busca a través de los objetivos de un microscopio confocal. </li><li> Añadir una gota de aceite en la parte superior del área cubreobjetos cuyo lado opuesto se etiqueta como se describe en 9.2.1. </li></ol></li><li> Encuentra el plano focal a 40X objetivo de inmersión en aceite y luego cambiar a un objetivo de inmersión en aceite 63X. Mueva manualmente el control de enfoque fino y hacerwn para capturar el mejor plano focal. NOTA: Para la observación de detalles estructurales de germaria y principios de los embriones, sugerimos usar 40X objetivos o aquellos con mayor aumento. </li><li> Analiza el embrión en diferentes canales de excitación y de obtener una imagen de z-stack. NOTA: Para los tejidos de pulgón del guisante, reducir el espesor de cada sección óptica hasta 1,5 micras o menos. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Identificamos óptimas condiciones críticas para la inmunotinción éxito en el pulgón del guisante A. Pisum, un organismo modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo 3,15. Condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad del tejido y la reducción de la tinción de fondo mejorado la intensidad y especificidad de las señales. Se diferencian de los protocolos estándar para la inmunotinción en otros modelos animales en los pasos para la creación de poros en las membranas celulare...

Los áfidos son insectos hemípteros con pequeñas (1.10 mm) cuerpos blandos. Se alimentan de las plantas al chupar la savia del floema con piezas bucales penetrantes. Además, se basan en una bacteria endosimbiótica obligado, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos esenciales que son deficientes en la dieta savia del floema. Los áfidos tienen una historia de vida complejo que incluye la reproducción vivípara partenogenética durante la primavera y el fotoperíodo largo día de verano y la reproducción ovípara sexual provocada por fotoperiodos de día corto durante el cual se ponen un número limitado de huevos invernantes 1,2. En la primavera de estos huevos eclosionan para producir la primera generación de la todo-hembra áfidos (fundatrices), después de muchas rondas de reproducción partenogenética hasta el otoño. La partenogénesis cíclica de áfidos, donde las fases asexuales y sexuales se alternan en el ciclo de vida anual, ha sido considerado como un 1,2 novedad evolutiva. En los áfidos vivíparos partenogenéticos, La embriogénesis se lleva a cabo dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles). Por el contrario, los embriones ovíparos sexuales se desarrollan en los huevos fertilizados. Aparte de la plasticidad reproductiva, los áfidos pueden mostrar polyphenism ala transgeneracional: en respuesta a señales de hacinamiento y las amenazas de depredadores, las hembras sin alas asexuales pueden producir vivíparas descendiente alado para la migración de larga distancia. La publicación de la secuencia del genoma del pulgón del guisante Acyrthosiphon pisum -la primera secuencia del genoma de un basal insectos permite hemimetabolous mayor exploración de la plasticidad reproductiva, ala polyphenism, y otras características que incluyen interacciones insecto-planta, vectorización viral y la simbiosis de áfidos en una molecular base 3. Además de la secuencia del genoma, se requieren herramientas para la caracterización de la expresión génica y la función de promover el pulgón del guisante como un organismo modelo madura 4. Hemos descrito los protocolos robustos de todo el montaje <em&gt; hibridación in situ para detectar la expresión de mRNA en embriones de áfidos 5-7. ARN de interferencia (RNAi) a través de la inyección de ARN de doble cadena y la alimentación se ha utilizado para el silenciamiento de genes en ninfas de áfidos y adultos, pero las condiciones estables para el gen desmontables en los embriones aún no se ha informado de 8-10. La inmunotinción, un enfoque basado en anticuerpos que puede detectar la expresión de proteínas en las muestras antes y después de RNAi desmontables, se ha realizado en embriones pulgón del guisante 11-13. Sin embargo, el aumento de la permeabilidad de los tejidos y la eliminación de la tinción de fondo es aún insatisfactoria utilizando protocolos estándar para la inmunotinción en los embriones vivíparos asexuales del pulgón del guisante. Por ejemplo, hemos encontrado que la penetración de los anticuerpos a los tejidos disminuyó en embriones gastrulating (etapas 8-10) y que los embriones con yemas de las extremidades morfológicamente identificables (etapas 13-14) eran apenas permeable al anticuerpo. Además, la tinción de fondo se visualizó en el vivíparo asexualnosotros los embriones pulgón del guisante teñidas utilizando el anticuerpo contra el marcador de la línea germinal Vasa, así como que contra la proteína Engrailed / Invected expresado en los segmentos embrionarias 12,13. En realidad la tinción de fondo seguía siendo claramente visible en los embriones teñidos con el anticuerpo secundario solo. Con el fin de aumentar la permeabilidad sin dañar la integridad de los tejidos de áfidos, que valora cuidadosamente la concentración de proteinasa K y se determinó las condiciones óptimas para la digestión del tejido con embriones de áfidos. Con el fin de evitar la tinción no específica en el pulgón del guisante, se realizaron búsquedas de compuestos que podrían bloquear con eficacia los embriones y reprimir la actividad de la peroxidasa endógena (POD), una enzima utilizada para amplificar señales durante inmunotinción. Un reactivo de bloqueo proporcionada por un digoxigenina (DIG) juego de tampones con base, en lugar del suero normal de cabra utilizado tradicionalmente (NGS) / albúmina de suero bovino (BSA), redujo significativamente la tinción de fondo. Por otra parte, el metanol se encontró que INHImordió la actividad POD endógena de manera más eficaz que el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). Los detalles relativos a estas condiciones de áfidos específica para la inmunotinción con embriones se describen en las siguientes secciones.

<table><tbody><tr><td>30% de hidrógeno perxidasa (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Para el blanqueo de peroxidasa endógena de embriones.</td></tr><tr><td>4' 6-diamidino-2-fenil-indol diclorhidrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Para el etiquetado del ADN de doble cadena. NOCIVO. Use guantes, dispense en alícuotas pequeñas y feeze para minimizar la exposición</td></tr><tr><td>4D9 anticuerpo monoclonal de ratón anti-engrailed/invected</td><td>Estudios del desarrollo banco de hidomas</td><td></td><td>AB_528224 Para el etiquetado de los segmentos en desarrollo del embrión.</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo ApVas1</td><td>Nuestro laboratorio</td><td>N/A</td><td>Para el marcaje de la proteína Vas1 específica de la línea germinal del pulgón en embriones. Este anticuerpo fue fabricado por nuestro laboratorio.</td></tr><tr><td>Austerlitz Alfileres para insectos</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Para separar cada cámara de huevos de una ováricola. Tamaño 000, ESMALTADO NEGRO.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Cámara conectada al microscopio compuesto</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Para fotografiar embriones de pulgones.</td></tr><tr><td>Bandeja colorimétrica de 8 celdas</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Para desarrollar la señal de tinción de embriones de pulgón. Diámetro 95 x 57 mm, profundidad de la celda 2 mm.</td></tr><tr><td>Microscopio compuesto con óptica DIC</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Para fotografiar embriones de pulgón montados en los portaobjetos.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos. Diluimos la solución de bloqueo 10x en 1x como reactivo de bloqueo.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Para la disección de ovarios de pulgones. Pieza de fabricante n.º 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gotero de vidrio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para transferir los ovarios de los pulgones de la placa de la trama a los tubos. 150 mm de longitud total y 5 3/4" de longitud de punta.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Para la limpieza de embriones de pulgón y el montaje.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Para bloquear la actividad enzimática de la proteinasa K (PK).</td></tr><tr><td>IgG anti-ratón de cabra conjugada Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Para la detección de anticuerpos primarios de ratón.</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo de cabra conjugada Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Para la detección de anticuerpos primarios de conejo.</td></tr><tr><td>Mezclador Intelli</td><td>Equipo de laboratorio ELMI</td><td>RM-2M</td><td>Para mejorar la reacción completa de los reactivos con los ovarios.</td></tr><tr><td>Microscopía confocal de barrido láser</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Para fotografiar embriones de pulgón montados en los portaobjetos con etiqueta florecente.</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Burdick y Jackson</td><td>AH2304</td><td>Para el blanqueo de la peroxidasa endógena de embriones.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Para el montaje de embriones. Bordes del suelo SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos</td><td>Marienfeld 0101030</td><td></td><td>Para el montaje de embriones en los portaobjetos. Tamaño 18 x 18 mm. Espesor Nº 1 (0,13 a 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Para el montaje de embriones en los portaobjetos. Tamaño: 22 x 22 mm. Espesor Nº 1 (0,13 a 0,16 mm)</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal anti-alfatubulina de ratón (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Para el marcaje de la distribución de alfa-tubulina de las células.</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para sellar los cubreobjetos de los portaobjetos.</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Para la fijación de ovarios de pulgones.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Para etiquetar la distribución de F-actina en embriones.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Como solución isotónica para ovarios de pulgones.</td></tr><tr><td>Gotero de plástico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para transferir los ovarios de los pulgones del tubo a la bandeja de células. Tamaño 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Merck 124678</td><td></td><td>Para crear poros (perforaciones) en la membrana celular y facilitar el acceso de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Placa puntual de Pyrex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para la disección y las reacciones de color de los ovarios de pulgón bajo microscopía. Cada cavidad con un diámetro de 22 mm y&nbsp; Profundidad 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidina (DAB) comprimidos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Para el desarrollo de señales subtituladas. También se llama juego de tabletas de sustrato de peroxidasa DAB.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Para la disección y observación de ovarios de pulgones.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Para crear poros (perforación) en la membrana celular.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Laboratorios vectoriales</td><td>PK-6101</td><td>Para la mejora de la señal. Incluyendo anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra biotinilado, reactivos A y B.</td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>H1000</td><td>Para la limpieza de embriones de pulgón y el montaje.</td></tr></tbody></table>

identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: el aumento del tejido permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

El Acyrthosiphon pisum pulgón del guisante, con un genoma secuenciado y abundante plasticidad fenotípica, se ha convertido en un modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo. Al igual que otros pulgones, A. Pisum propaga rápidamente a través de la reproducción vivípara partenogenética, donde los embriones se desarrollan dentro de las cámaras de huevo en forma de línea de montaje en el ovariole. Anteriormente hemos establecido una plataforma robusta de todo el montaje hibridación in situ que permite la detección de la expresión de mRNA en los embriones de áfidos. Para el análisis de la expresión de la proteína, sin embargo, establecido protocolos para inmunotinción los ovarioles de áfidos vivíparos asexuales no produjo resultados satisfactorios. Aquí mostramos condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad de los tejidos y la disminución de la tinción de fondo, los cuales eran los problemas en la aplicación de enfoques establecidos. Optimizaciones incluyen: (1) incubación de proteinasa K (1 mg / ml, 10 min), que se encontró f esencialo la penetración de anticuerpos en embriones de mediados y finales de etapa de áfidos; (2) la sustitución de albúmina de suero de suero de cabra / bovino normal con un reactivo de bloqueo suministrada por un digoxigenina (DIG) a base de juego de tampones y (3) la aplicación de metanol en lugar de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para el blanqueo de la peroxidasa endógena; que redujo significativamente la tinción de fondo en los tejidos de áfidos. Estas condiciones críticas optimizados para inmunotinción permitirá la detección eficaz de los productos de los genes en los embriones de A. Pisum y otros pulgones.

En este estudio, hemos realizado todo el montaje-inmunotinción con embriones de áfidos del guisante asexuales (Figura 1A). Estas hembras producen crías partenogenéticamente y vivíparas. Estos embriones femeninos se desarrollan dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles) (Figura 1B y la Figura 2A). Antes de la microscopía, las ovarioles disecados son los objetivos de tinción; sin embargo, se requie...

Se presenta un protocolo de inmunotinción de montaje completo en embriones de pulgón, en el que se abordan las condiciones críticas para disminuir la tinción de fondo y aumentar la permeabilidad del tejido. Estas condiciones se han desarrollado específicamente para la detección eficaz de la expresión de proteínas en los tejidos embrionarios de los pulgones.

Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

El objetivo general de este protocolo de inmunotinción es detectar la expresión proteica en embriones de áfidos. Se identifican condiciones críticas que aumentan la permeabilidad del tejido y reducen la tinción de fondo, problemas persistentes al teñir tejidos embrionarios de áfidos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona condiciones específicas para una penetración eficaz de los anticuerpos y una reducción de la tinción de fondo, aspectos que por lo general no se describen en un protocolo estándar de inmunotinción.Tuvimos por primera vez esta idea de esta medida cuando estábamos estudiando cómo se especifican las células germinales en un pulgón de la arveja, un modelo de insecto para estudios genómicos y ambientales. La cepa de laboratorio del pulgón de la arveja, a. pisum, fue recolectada originalmente en el centro de Taiwán y se ha criado en plantas hospederas durante más de 300 generaciones.Para germinar, remoje las semillas de las plantas hospederas en agua del grifo durante tres a cinco días a temperatura ambiente. Cambie el agua fresca una vez al día. Cultive diez semillas germinadas en una maceta pequeña con suelo, en la cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 20 grados Celsius.Aproximadamente 10 días después de que comienza el crecimiento, la altura de las plantas generalmente supera los ocho centímetros. Mantenga cada maceta de plantas dentro de un vaso de vidrio de un litro y transfiera áfidos adultos a las plantas utilizando un pincel. Luego, selle el vaso con una cubierta permeable al aire, como una malla de gasa, para evitar que los áfidos escapen.Incube los áfidos en una cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 20 grados Celsius, regando cada maceta de plantas una vez al día. Llene un pocillo de una placa de análisis con aproximadamente 500 microlitros de paraformaldehído al 4 por ciento. Coloque la placa bajo un estereomicroscopio con baja magnificación y sumerja un áfido adulto en el paraformaldehído para su disección.Disecte los ovarios sosteniendo la cabeza y el abdomen con un par de pinzas, cortando la cutícula dorsal del abdomen y arrastrando los ovarios fuera de la cavidad abdominal. A continuación, fije tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, con agitación suave en un mezclador. Deseche el tampón de fijación con una pipeta de vidrio y luego lave los ovarios con PBST tres veces durante 10 minutos, con agitación suave.Para tratar los ovarios, primero incubarlos con proteinasa K durante 10 minutos con agitación suave para aumentar la permeabilidad de los tejidos embrionarios. Tras la incubación, desechar la solución de proteinasa K y luego lavar los ovarios con 700 microlitros de glicina tres veces durante cinco minutos. A continuación, lavar los ovarios con PBST dos veces durante 10 minutos.Fije nuevamente los ovarios con tampón de fijación durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Para suprimir la actividad peroxidasa endógena, deshidrate seriamente los ovarios con diferentes porcentajes de metanol en PBST al 0,2 por ciento con relaciones de volumen de uno a tres, uno a uno y tres a uno, y luego incube adicionalmente los ovarios con metanol al 100 por ciento durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, rehidrate seriamente los ovarios, según se indica en el protocolo de texto.Para tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 mililitros, 200 microlitros es el volumen mínimo para el bloqueo de la muestra y la tinción con anticuerpo. Incube los ovarios con la solución de bloqueo DIG-B 1x durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados Celsius, con agitación suave. Tras la incubación, deseche el sobrenadante y sustitúyalo por solución de bloqueo DIG-B 1x fresca, que contenga el anticuerpo primario en la proporción de dilución adecuada.Tiña los ovarios durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave. Después de lavar los ovarios según se describe en el protocolo del texto, deseche el sobrenadante y reemplácelo con una solución de bloqueo DIG-B 1x fresca que contenga el anticuerpo secundario en la proporción de dilución adecuada, y tiña los ovarios como antes. Para la tinción inmunofluorescente, realice la tinción en la oscuridad, porque el anticuerpo secundario es sensible a la luz.El grosor de los embriones de áfidos varía entre las etapas de desarrollo. Por lo tanto, las estrategias de montaje se modifican para adaptarse a embriones tempranos, intermedios y tardíos. Transfiera los ovarios, junto con el medio de montaje, a la bandeja celular utilizando un gotero de plástico, y observe las muestras bajo un estereomicroscopio con baja ampliación.Corte los callos asociados con el oviducto lateral utilizando alfileres de insecto y luego transfiera un ovariólo aislado a un pozo de vidrio vacío con una pipeta. Ajuste el volumen final entre 50 y 100 microlitros utilizando medio de montaje. A continuación, transfiera un ovariólo a la placa con una pipeta de vidrio.Disecte las cámaras ovocelulares utilizando alfileres para insectos. Para embriones con más de seis estadios de desarrollo, se sugiere la separación de las cámaras ovocelulares. Para los germarios y las dos primeras cámaras ovocelulares, la separación es opcional.Reubique una cámara de huevo diseccionada en un portaobjetos limpio utilizando un gotero de vidrio. Para embriones en las etapas uno a 10 de desarrollo, coloque lentamente una cubreobjetos sobre los ovarios o cámaras de huevo diseccionadas para evitar burbujas. Alternativamente, para embriones en las etapas 11 a 18 de desarrollo, monte las cámaras de huevo en un portaobjetos con un puente de cubreobjetos de un solo lado y coloque otra cubreobjetos encima de la muestra.Para embriones con más de la fase 19 de desarrollo, monte las cámaras ováricas sobre un portaobjetos con un puente de cubreobjetos de doble cara y coloque otro cubreobjetos encima de la muestra. A continuación, llene el espacio debajo del cubreobjetos superior con medio de montaje para evitar que la muestra se seque. Ruede suavemente el cubreobjetos superior para obtener la orientación adecuada para la observación.Finalmente, selle alrededor del borde de las cubreobjetos, incluidas las cubreobjetos puente, con esmalte de uñas antes de realizar el análisis de imágenes, como se describe en el protocolo escrito. Aquí se muestra un par de ovarios disecados de una hembra adulta. Un ovariólo está compuesto por un germario, uno o dos sitios O, más cinco a siete embriones, todos los cuales se alojan dentro de cámaras ovulares de manera sucesiva como en una línea de ensamblaje.Después de la fijación con paraformaldehído, se recomienda encarecidamente la digestión de los ovarios en una solución de Proteinasa K a una concentración de un microgramo por mililitro durante 10 minutos. Los resultados de tinción muestran que la intensidad de la señal aumenta significativamente en los embriones digeridos con Proteinasa K. La incubación de los embriones en la solución bloqueante de un conjunto de tampones basado en DIG reduce más la tinción de fondo que la incubación en suero de cabra normal y albúmina de suero bovino.La actividad endógena de la peroxidasa también puede provocar una tinción de fondo elevada. Estos estudios revelan que sumergir embriones de áfidos en metanol puede suprimir la actividad de la peroxidasa de manera mucho más eficiente que tratar los embriones con peróxido de hidrógeno. Las condiciones críticas reveladas en este estudio pueden aplicarse para la detección de señales tanto en células germinales como en células somáticas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una inmunomarcación exitosa en embriones de áfidos, incluyendo la elevación de la intensidad de señal y la reducción de la tinción de fondo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular cada embrión con cuidado para obtener una buena forma de los embriones.No olvide que trabajar con paraformaldehído y DAPI puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, durante la realización de este procedimiento. Tras este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como la hibridación *in situ* para responder preguntas adicionales, como si el ARN mensajero se localiza junto con su producto proteico en las células embrionarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología ambiental de insectos, como la forma en que se especifican las células germinales y cómo se determinan las células ovulares en distintas fases reproductivas de los áfidos.

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Investigación

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Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo (Video) | JoVE Journal

Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

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