La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica alta Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)
11 de agosto de 2016
Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.
El objetivo general de este procedimiento es aislar las células madre mesenquimales positivas para Sca1 de varias almohadillas de grasa de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que, mediante el uso de la clasificación celular inmunomagnética basada en perlas, las células madre derivadas del tejido adiposo de diferentes depósitos de grasa pueden enriquecerse eficazmente para experimentos posteriores. Por lo general, los investigadores nuevos en este método tendrán dificultades porque la fuerza y la duración de la digestión del tejido mediada por la colagenasa deben optimizarse para obtener un número adecuado de células para la clasificación.
Para aislar las almohadillas de grasa subcutánea, comience colocando al ratón sobre una tabla de disección de espuma en posición supina y rociando al animal con etanol al 70%. Después de asegurar las patas a la tabla, haga una pequeña incisión en la piel de la parte inferior del abdomen. Luego, agarrando la parte superior del corte con pinzas, use tijeras para separar la piel y el peritoneo desde el abdomen hasta el tórax.
Los cortes laterales en la piel, a lo largo del costado del cuerpo, reflejan la piel alejándola del peritoneo hacia la cabeza. Luego, retira la piel restante, manteniendo la grasa inguinal lejos del cuerpo, y usa agujas de calibre 22 para sujetar la piel a la tabla. A continuación, use las pinzas para agarrar una almohadilla de grasa inguinal en su origen cerca del peritoneo, y use unas tijeras finas para cortar entre la piel y la grasa inguinal, avanzando hacia la ingle y evitando contaminar la almohadilla de grasa subcutánea con piel.
Luego, coloque la almohadilla de grasa inguinal aislada en un plato de 60 milímetros marcado con SQ que contenga un medio de cultivo de 37 grados Celsius y coseche la almohadilla de grasa inguinal del otro lado del animal de la misma manera. Para aislar las almohadillas de grasa visceral, corte el peritoneo para exponer las almohadillas de grasa visceral y el intestino. A continuación, mueve la tripa a un lado, hacia el tórax.
Agarrando la almohadilla de grasa visceral en el extremo distal, tire suavemente hacia arriba del tejido graso y diseccione, teniendo cuidado de excluir el tejido epididimario. A continuación, coloque la almohadilla de grasa en un plato de 60 milímetros marcado con VIS que contenga un medio de cultivo de 37 grados centígrados. Cuando se hayan recogido todas las almohadillas de grasa, transfiera las placas a una campana de cultivo de tejidos y aspire el medio.
Usa unas tijeras curvas para picar las almohadillas. A continuación, añade los trozos de grasa a tubos individuales de 50 mililitros que contengan colagenasa recién preparada. A continuación, agite los tubos a 300 RPM y 37 grados centígrados durante 10 a 20 minutos, hasta que se digieran los tejidos.
Es posible que algunos trozos de tejido de la almohadilla de grasa subcutánea aún sean visibles. Agregue 20 mililitros de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la digestión, y use una pipeta serológica de 10 mililitros para aspirar y dispensar la suspensión de tejido 10 veces para disociar completamente los tejidos digeridos. Filtre las células a través de filtros de células de 100 micras y centrifugue los tejidos.
A continuación, decantar cuidadosamente el medio, teniendo cuidado de no alterar los gránulos, y resuspender suavemente ambos grupos de células en cinco mililitros de agua estéril. Espere dos minutos para que se lisen los eritrocitos. A continuación, detenga la reacción en cada tubo con 25 mililitros de medio suplementado con FBS.
Filtre ambas poblaciones de adipocitos a través de nuevos filtros de células de 100 micras, gírelos nuevamente y luego vuelva a suspender los gránulos en uno a tres mililitros de medio. Después de contar por exclusión de azul de tripano, por separado la placa una por diez a la sexta almohadilla de grasa subcutánea y células viscerales en pocillos individuales de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Después de tripsinizar las células, diluya la tripsina con un mililitro de tampón de separación y luego centrifugue las placas de cultivo.
Suspendemos las células en 500 microlitros por tubo de tampón de separación y volvemos a centrifugar las células. Ahora, vuelva a suspender las células en 90 microlitros por tubo de tampón de separación y mezcle 10 microlitros de anticuerpo primario anti-Sca1 FITC en la suspensión celular. Después de 10 minutos de incubación a cuatro grados centígrados en la oscuridad, lave las células con un mililitro de tampón de separación por tubo.
Después del centrifugado, las células se resuspenden en 80 microlitros de tampón de separación por suspensión celular. A continuación, mezcle 20 microlitros de Microperlas Anti-FITC en cada pocillo y coloque las placas a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz durante 15 minutos. Al final de la incubación, lave las células en un mililitro de tampón de separación y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón fresco por tubo.
Ahora, coloque una columna en el soporte magnético y enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de separación. Transfiera las células del cultivo de tejido de la almohadilla de grasa subcutánea a la columna, teniendo cuidado de evitar burbujas, y recoja las células Sca1 negativas no marcadas en un tubo cónico de 15 mililitros. Cuando todas las celdas hayan pasado, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de separación.
A continuación, transfiera la columna del imán a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y sumerja un mililitro de tampón de separación fresco a través de la columna para eluir las células Sca1 positivas. Por último, centrifugar las fracciones celulares positivas y negativas de Sca1 y volver a suspender los gránulos en un mililitro de medio de cultivo. A continuación, cuente el número de células en cada fracción y coloque las fracciones en pocillos individuales de una nueva placa de cultivo celular de seis pocillos.
Las células del estroma vascular aisladas de la grasa subcutánea muestran una forma celular estirada similar a la de un fibroblasto, independientemente de su nivel de expresión de Sca1. Al igual que las células altas Sca1 derivadas de la grasa inguinal subcutáneas, las células altas Sca1 derivadas de la grasa del epidídimo visceral muestran una forma celular estirada similar a la de los fibroblastos. Mientras que las células bajas VIS Sca1 exhiben una forma epitelioide.
Las células altas de Sca1 aisladas de ratones Sca1-GFP aislados se identifican fácilmente como células positivas para GFP en cultivo de tejidos. De hecho, cuando estas células se evalúan mediante citometría de flujo, se confirma que la mayoría de las células GFP positivas expresan proteínas Sca1 en sus superficies celulares, según lo detectado por el anticuerpo anti-Sca1. Junto con análisis de PCR en tiempo real, se puede demostrar la expresión diferencial de las metaloproteinasas de la matriz colagenolítica entre células madre Sca1 de alta derivación adiposa de la grasa inguinal y del epidídimo.
Además, cuando se utilizan geles de colágeno tipo I marcados con fluoresceína para evaluar la actividad de degradación pericelular, se observa un marcado aumento de la actividad de remodelación del colágeno mediada por células madre viscerales derivadas de alto tejido adiposo Sca1. Una vez dominado, el aislamiento de las células de la almohadilla grasa se puede completar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un campo quirúrgico limpio y organizado para garantizar un aislamiento eficiente de las almohadillas de grasa.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de degradación de colágeno, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación del tejido mediada por células madre derivadas del tejido adiposo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la obesidad y la biología de la matriz exploraran el papel de las células madre derivadas del tejido adiposo en la remodelación y función del tejido adiposo en ratones y humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y enriquecer células primarias Sca1 positivas de depósitos de tejido adiposo.
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Resumen
Este artículo presenta un método para aislar células madre mesenquimales positivas para Sca1 a partir del tejido adiposo de ratón, específicamente de los depósitos inguinales y perigonadales. La técnica utiliza clasificación celular inmunomagnética para enriquecer las células madre derivadas del tejido adiposo para experimentos posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Investigación del Tejido Adiposo
- Técnicas de Aislamiento Celular
Antecedentes
- El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) es fundamental para estudiar las células madre derivadas del tejido adiposo.
- Las células madre derivadas del tejido adiposo con alta expresión de Sca1 desempeñan un papel importante en la regeneración tisular.
- Optimizar la digestión mediada por colagenasa es esencial para una recuperación eficaz de las células.
- Diferentes depósitos de grasa pueden producir resultados variables en el aislamiento de células madre.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para aislar células madre de los tejidos adiposos de ratón.
- Mejorar la comprensión de la expresión génica y la actividad colagenolítica en células madre derivadas del tejido adiposo.
- Facilitar investigaciones futuras sobre el potencial terapéutico de estas células.
Métodos Utilizados
- Separación inmunomagnética de células para enriquecer ASCs con alta expresión de Sca1.
- Digestión del tejido mediada por colagenasa para aislar la FVS.
- Diseción del tejido adiposo de ratón en condiciones estériles.
- Clasificación celular basada en marcadores de superficie para análisis posteriores.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células madre mesenquimales positivas para Sca1 a partir de diferentes depósitos de grasa.
- Condiciones optimizadas para la digestión con colagenasa mejoraron el rendimiento celular.
- El enriquecimiento de ASC permite estudios detallados de expresión génica.
- La evaluación de la actividad colagenolítica proporciona información sobre la remodelación del tejido.
Conclusiones
- El método descrito es efectivo para aislar y enriquecer células madre derivadas del tejido adiposo.
- Comprender las características de estas células puede avanzar en la medicina regenerativa.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para explorar aplicaciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar células madre derivadas del tejido adiposo Sca1high específicas de depósitos permite reducir riesgos mecanicistas en la investigación de la obesidad y la fibrosis, vinculando la función génica con la actividad colagenolítica y la remodelación del tejido. Este enfoque apoya la validación de dianas al proporcionar un sistema celular purificado y específico de depósitos para evaluar las contribuciones del estroma al equilibrio metabólico. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al reducir la variabilidad biológica inherente a las preparaciones heterogéneas de la fracción vascular estromal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los roles específicos de los genes en la regulación de la función de las células madre derivadas del tejido adiposo dentro de depósitos grasos definidos.
- Valor operativo: Proporciona poblaciones enriquecidas de Sca1high para ensayos posteriores, reduciendo el ruido provocado por células estromales contaminantes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados adecuados para evaluar la degradación pericelular del colágeno y la actividad de las metaloproteinasas de matriz.
- Valor operativo: Produce preparaciones celulares reproducibles y específicas del depósito que permiten condiciones de ensayo estandarizadas en diferentes experimentos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Facilita la comparación de la capacidad intrínseca de remodelación del colágeno entre células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo y visceral, aportando información sobre mecanismos relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el aislamiento hasta la evaluación funcional, posibilitando el avance ajustado al riesgo de dianas implicadas en la remodelación de la matriz extracelular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un paso de aislamiento de células madre específico del depósito antes de los ensayos funcionales en las etapas de validación del objetivo y la identificación de compuestos iniciales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la comparación de la expresión génica y la actividad proteolítica entre células Sca1high derivadas de depósitos grasos.
- Selección: Proporciona células listas para ensayos con una morfología consistente similar a la de fibroblastos y expresión detectable de marcadores de superficie, para realizar selecciones fiables de compuestos o genéticas.
- Análisis: Permite lecturas cuantitativas como PCR en tiempo real para metaloproteinasas de matriz y ensayos de degradación de gel de colágeno para medir las contribuciones del estroma en la remodelación tisular.
- Investigación Traducional: Conecta el aislamiento con la continuidad preclínica al proporcionar un sistema celular definido para evaluar los roles específicos de los depósitos en la función del tejido adiposo y en la fibrosis.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado de aislamiento que puede aplicarse en múltiples depósitos grasos y modelos genéticos, favoreciendo la reproducibilidad a nivel de plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el objetivo al vincular las células madre derivadas del tejido adiposo Sca1high con la remodelación de la matriz extracelular colagenolítica y la regulación metabólica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante enriquecimiento inmunomagnético y pasos estandarizados de digestión, lavado y elución.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases tardías al permitir la eliminación temprana de riesgos mecanicistas en dianas estromales de las vías de obesidad y fibrosis.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos funcionales específicos del depósito que reflejan la heterogeneidad fisiológica del tejido adiposo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección del tejido adiposo murino y en técnicas quirúrgicas estériles para evitar contaminación y garantizar el aislamiento específico del depósito.
- Depende de la concentración optimizada de colagenasa y del tiempo de digestión para obtener un rendimiento celular adecuado sin comprometer la viabilidad celular ni la integridad de los marcadores superficiales.
- Necesita acceso a columnas de separación magnética, anticuerpos anti-Sca1 y microesferas conjugadas con FITC para el enriquecimiento inmunomagnético.
- Requiere adaptación de los parámetros de digestión y lavado al aplicar el método a diferentes depósitos grasos o fondos genéticos.
- Limitado por la necesidad de procesar el tejido fresco y su uso inmediato en pasos posteriores para mantener el fenotipo Sca1high y la actividad funcional.
