La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre mesenquimales positivas para Sca1 a partir de diversos depósitos de grasa de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que, al utilizar la clasificación celular basada en microperlas inmunomagnéticas, se pueden enriquecer eficazmente células madre derivadas del tejido adiposo procedentes de diferentes depósitos grasos para experimentos posteriores. En general, los investigadores nuevos en este método encontrarán dificultades porque la intensidad y duración de la digestión tisular mediada por colagenasa deben optimizarse para obtener un número adecuado de células para la clasificación.

Para aislar los tejidos adiposos subcutáneos, comience colocando el ratón sobre una tabla de disección de espuma en posición supina y rocíe el animal con etanol al 70 %. Después de asegurar las patas a la tabla, realice una pequeña incisión en la piel del abdomen inferior. Luego, sosteniendo el borde superior del corte con pinzas, use tijeras para separar la piel y el peritoneo desde el abdomen hasta el tórax.

Realice cortes laterales en la piel, a lo largo del costado del cuerpo, y refleje la piel desde el peritoneo hacia la cabeza. Luego, retire la piel restante, sosteniendo la grasa inguinal alejada del cuerpo, y utilice agujas de calibre 22 para fijar la piel al tablero. A continuación, use la pinza para agarrar uno de los tejidos adiposos inguinales en su origen cerca del peritoneo, y corte con tijeras finas entre la piel y la grasa inguinal, avanzando hacia la ingle, evitando contaminar el tejido adiposo subcutáneo con la piel.

Luego, coloque el páncreo inguinal aislado en una placa de 60 milímetros etiquetada como SQ que contenga medio de cultivo a 37 grados Celsius, y coseche el páncreo inguinal del otro lado del animal de la misma manera. Para aislar los páncreos viscerales, corte el peritoneo para exponer los páncreos viscerales y el intestino. A continuación, mueva el intestino hacia un lado, en dirección al tórax.

Sujetando el páncreo adiposo visceral en el extremo distal, tire suavemente hacia arriba del tejido adiposo y diséquelo, teniendo cuidado de excluir el tejido epididimal. Luego, coloque el páncreo adiposo en una placa de 60 milímetros etiquetada con VIS que contenga medio de cultivo a 37 grados Celsius. Cuando se hayan recolectado todos los páncreos adiposos, transfiera las placas a una campana de cultivo de tejidos y aspire el medio.

Utilice tijeras curvas para picar los cojinetes. Luego, agregue los trozos de grasa a tubos individuales de 50 mililitros que contengan colagenasa recién preparada. A continuación, agite los tubos a 300 RPM y 37 grados Celsius durante 10 a 20 minutos, hasta que los tejidos estén digeridos.

Es posible que aún sean visibles algunos fragmentos de tejido del páncreo adiposo subcutáneo. Añada 20 mililitros de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la digestión, y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para aspirar y dispensar la suspensión de tejido 10 veces con el fin de disociar completamente los tejidos digeridos. Filtre las células a través de filtros celulares de 100 micrones y centrifugue los tejidos.

Luego, vierta cuidadosamente el medio, teniendo cuidado de no perturbar los sedimentos, y resuspenda suavemente ambos grupos de células en cinco mililitros de agua estéril. Espere dos minutos para que los eritrocitos sean lisados. A continuación, detenga la reacción en cada tubo con 25 mililitros de medio suplementado con suero bovino fetal (FBS).

Filtre ambas poblaciones de adipocitos a través de nuevos filtros celulares de 100 micrones, centrifúgelos nuevamente y luego resuspenda los precipitados en uno a tres mililitros de medio. Después de contar mediante exclusión de azul de tripano, siembre por separado una vez diez a la sexta células del tejido adiposo subcutáneo y células viscerales en pozos individuales de una placa de cultivo celular de seis pozos. Después de la tripsinización de las células, diluya la tripsina con un mililitro de tampón de separación y luego centrifugue las placas de cultivo.

Suspendemos las células en 500 microlitros por tubo de tampón de separación, y centrifugamos las células nuevamente. Ahora, resuspendemos las células en 90 microlitros por tubo de tampón de separación, y mezclamos 10 microlitros de anticuerpo primario anti-Sca1 FITC en la suspensión celular. Tras 10 minutos de incubación a cuatro grados Celsius en la oscuridad, lavamos las células con un mililitro de tampón de separación por tubo.

Después de centrifugar, las células se resuspenden en 80 microlitros de tampón de separación por suspensión celular. Luego, mezcle 20 microlitros de microperlas anti-FITC en cada pocillo y coloque las placas a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz durante 15 minutos. Al final de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de separación y resuspenda las células en 500 microlitros de tampón fresco por tubo.

Ahora, coloque una columna en el soporte magnético y enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de separación. Transfiera las células del cultivo de tejido del páncreas adiposo subcutáneo a la columna, teniendo cuidado de evitar burbujas, y recoja las células negativas para Sca1 no marcadas en un tubo cónico de 15 mililitros. Una vez que todas las células hayan pasado, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de separación.

Luego, transfiera la columna desde el imán a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros e introduzca un mililitro de tampón de separación fresco a través de la columna para eluir las células positivas para Sca1. Finalmente, centrifugue ambas fracciones de células positivas y negativas para Sca1 y resuspenda los precipitados en un mililitro de medio de cultivo. A continuación, cuente el número de células en cada fracción y siembre las fracciones en pozos individuales de una nueva placa de cultivo celular de seis pozos.

Las células estromales vasculares aisladas de grasa subcutánea presentan una forma alargada similar a la de un fibroblasto, independientemente de su nivel de expresión de Sca1. Al igual que las células derivadas de grasa subcutánea inguinal con alta expresión de Sca1, las células derivadas de grasa visceral epididimal con alta expresión de Sca1 muestran una forma alargada similar a la de un fibroblasto. Mientras que las células VIS Sca1 bajas exhiben una forma epitelioide.

Las células Sca1 altas aisladas de ratones Sca1-GFP aislados se identifican fácilmente como células GFP positivas en cultivo tisular. De hecho, cuando estas células se evalúan mediante citometría de flujo, la mayoría de las células GFP positivas confirman la expresión de proteínas Sca1 en sus superficies celulares, tal como se detecta mediante el anticuerpo anti-Sca1. Combinado con análisis de PCR en tiempo real, se puede demostrar la expresión diferencial de las metaloproteinasas matriciales colagenolíticas entre células madre derivadas de tejido adiposo Sca1 altas procedentes de grasa inguinal y epididimaria.

Además, cuando se utilizan geles de colágeno tipo I marcados con fluoresceína para evaluar la actividad de degradación pericelular, se observa una actividad marcadamente aumentada de remodelación del colágeno mediada por células madre derivadas del tejido adiposo viscéral con alta expresión de Sca1. Una vez dominado, el aislamiento de células de la almohadilla de grasa puede completarse en dos horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un campo quirúrgico limpio y organizado para asegurar un aislamiento eficiente de la almohadilla de grasa.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de degradación de colágeno, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación tisular mediada por células madre derivadas del tejido adiposo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la obesidad y la biología de la matriz exploraran el papel de las células madre derivadas del tejido adiposo en la remodelación y función del tejido adiposo en ratones y humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y enriquecer células primarias positivas para Sca1 a partir de depósitos de tejido adiposo.