Name: La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica alta Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a aislar células madre mesenquimales Sca1 positivas de tejido adiposo de ratón mediante separación inmunomagnética. Este método optimiza la digestión con colagenasa para obtener células derivadas de grasa subcutánea y visceral.

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Este trabajo es apoyado por el NIH DK095137 (THC). Agradecemos a los miembros del laboratorio actuales y anteriores que han contribuido al desarrollo y sofisticación de los métodos descritos.

Declaración de Ética: La Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) ha aprobado todos los métodos y protocolos, de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Los ratones se mantienen en un vivero Universidad de Michigan y se les da acceso libre a comida y agua y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de oscuridad / luz. 1. Preparativos <ol><li> Preparar medios de cultivo primario con DMEM, 10% de FBS, 1 x P / S / G, y 1x antibióticos / antimicóticos. Esto se utiliza para mantener los tejidos en la digestión antes. Coloque el almacén, la alícuota en baño de agua 37 ºC. </li><li> Preparar cinco mililitros de solución de colagenasa de tipo III en 5 mg / ml disueltos en HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almohadilla de grasa que se aislaron, hasta cinco ratones. Por ejemplo, cuando se aísla SQ y VIS de un solo genotipo, hacer 10 ml, si es de tipo salvaje y mutante SQ y el VIS, hacen 20 ml. Ajustar el pH a 7,4 y steirritar filtro. Alícuota en 50 ml tubos. Ponga a un lado de la luz. </li><li> Utilice 70% de etanol para desinfectar campo quirúrgico. Limpie y cubra con una almohadilla azul. Rociar un poco de etanol en la plataforma azul. </li><li> Utilice las agujas de 22 G de precisar una almohadilla absorbente a la base de poliestireno y recortar con tijeras. Rocíe la almohadilla con etanol y después fijar la placa en la plataforma azul y cubrir con otra almohadilla azul hasta que comienza la disección. </li><li> Llenar dos tubos de 50 ml con etanol y colocar en una posición adyacente al campo quirúrgico. Coloque las tijeras y pinzas en el etanol. </li><li> Llene otro tubo de 50 ml con PBS más 1 x anti-anti etanol para enjuagar fuera herramientas quirúrgicas. </li><li> En la capilla, etiqueta placas de 60 mm para cada tipo de tejido y se llenan de medios de cultivo se calentó a 37 ºC. Colocar las placas adyacentes a la zona quirúrgica. </li></ol> 2. Aislamiento del subcutánea (SQ) de grasa de ratones <ol><li> La eutanasia de ratón con una sobredosis de isoflurano y neumotórax. </li><li> Suavementerocíe ratón con 70% de etanol y poner en posición supina. Fijar las patas al tablero de la espuma con 22 agujas G. </li><li> Hacer un pequeño corte en la piel de la parte inferior del abdomen. Sosteniendo la parte superior del corte con las pinzas, tomar las tijeras y separar la piel del peritoneo. </li><li> Una vez que la piel se separa de el peritoneo desde el abdomen al tórax, reflejar la piel de la peritoneo hacia la cabeza, mediante cortes laterales en la piel a lo largo del lado del cuerpo. </li><li> Reflejar la piel restante sostiene la grasa inguinal lejos del cuerpo y fijar abajo a la placa con 22 agujas G. </li><li> Cambiar a unas tijeras finas y pinzas. Coge la almohadilla de grasa inguinal con las pinzas en el origen cerca del peritoneo y cortar distancia entre la piel y la grasa inguinal avanzar hacia la ingle evitando la contaminación de la SQ con la piel. </li><li> Coloque la almohadilla de grasa inguinal insolated en el plato marcado 60 mm. </li></ol> 3. Aislamiento de Visceral (VIS) almohadillas de grasa <ol><li> De una manera similar a la etapa 2.5, cortar el peritoneo abierto para exponer la almohadillas de grasa y el intestino visceral. </li><li> Mover el intestino de distancia hacia el tórax. </li><li> Coge la almohadilla de grasa VIS en el extremo distal y tire suavemente hacia arriba. Diseccionar la almohadilla de grasa VIS teniendo cuidado de excluir del epidídimo (o del útero, si se utilizan ratones hembra) de tejido. </li><li> Colocar en el plato de la etiqueta y repita el paso 3.3 para la plataforma de VIS restante. </li></ol> 4. La colagenasa digestión de la grasa de ratones <ol><li> Mueva placas de 60 mm a la campana de cultivo de tejido y aspirar fuera de los medios de comunicación. </li><li> Picar las almohadillas de grasa con tijeras curvas a continuación, añadir a la solución de colagenasa. Asegúrese de enjuagar las tijeras y pinzas entre tipos de tejidos con etanol y PBS. </li><li> Se agita a 300 rpm y 37 ° C durante 10-20 minutos hasta que los tejidos se digieren. Es aceptable si algunas piezas de SQ son todavía visibles. Este problema se solucionará en un paso posterior. </li><li> Se añaden 25 ml de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la collagENasa tratamiento, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta serológica de 10 ml para dispersar a los tejidos digeridos. </li><li> células de la cepa utilizando un filtro de células de 100 micras. Centrifugar durante 10 min a 300 x g. </li><li> decantar con cuidado los medios de comunicación de no perturbar el pellet y añadir 5 ml de agua estéril al sedimento y suavemente pipeta para suspender las células. Espere 2 minutos para lisar los eritrocitos. </li><li> Se añaden 25 ml de medio con FBS células y deformación del 10% a través de un nuevo filtro de células de 100 micras. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 300 x g. medios Decantar y pellet se resuspende en 1 ml de medio de cultivo. </li><li> Recuento de células con un hemocitómetro usando 1: 1 de azul de tripano. </li><li> Placa 1 x 10 6 células en un pocillo en una placa de 6 pocillos. </li></ol> 5. separación celular magnética <ol><li> Después de aproximadamente 4 a 6 horas de la adhesión celular, enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg). Disociar las células adherentes utilizando tripsina al 0,05%. Diluir la suspensión celular de tripsina en tampón de separación de 1 ml y se giro para5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 l de tampón. Retirar una alícuota de 10 l y contar las células usando un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante por completo. Resuspender las células en 90 l de tampón. Añadir 10 anticuerpo primario anti-Sca1-FITC l. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender las células en 80 l de tampón. Añadir 20 microperlas anti-FITC mu l. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Retire sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 500 l de tampón. </li><li> Colocar la columna en el soporte magnético y enjuagar la columna con 500 l de tampón. </li><li> Añadir suspensión de células a la columna. Evitar las burbujas durante el pipeteado. </li><li> Recoger el Sca1 sin etiqueta - &lt;/ Sup&gt; células y lavar la columna 3 veces con 500 l de tampón. Sólo añadir nueva memoria intermedia cuando el depósito está vacío. Evitar las burbujas durante el pipeteado. </li><li> Retirar la columna del soporte magnético y colocar en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de columna y eluir Sca1 + empujando el émbolo suministrado a través del depósito de la columna. </li><li> Centrifugar fracciones de células durante 5 minutos a 300 x g. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 ml. </li><li> Retirar una alícuota de 10 l de las fracciones etiqueta y etiqueta y contar las células usando un hemocitómetro. </li><li> Placa de cada fracción de células en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos. </li></ol> 6. Verificación de separación inmunomagnética de Sca1 alta SCA con Citometría de Flujo <ol><li> Enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg) y disociar las células utilizando tripsina al 0,05%. </li><li> centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 mL y un recuento usando un hemocitómetro. </li><li> Obtener&gt; 10 6 </sup&gt; células en 1 ml de medios de cultivo y centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.3 dos veces más. </li><li> Resuspender las células con 1 ml de suero de cabra 2% + 2% de BSA y de bloque durante 30 minutos a RT. </li><li> centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Retire la solución de bloqueo. </li><li> Añadir rata IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), en 100 l de PBS con 2% de suero de cabra y 2% BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Añadir 1 ml de PBS frío a las células. Centrifugadora 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.9 dos veces más. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de PBS. Pasar las suspensiones de células a través de un filtro de células de 100 micras en preparación para análisis de citometría de flujo. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
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<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
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<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este documento se demuestra el aislamiento y separación de células inmunomagnética de ASC murinos de diferentes almohadillas de grasa y su uso para experimentos in vitro. El método presentado es eficaz para el aislamiento rápido de gran número de ASC Sca1-positivo, que es ventajoso con respecto a los técnicamente complejo y costoso aislamiento FACS mediada de ASC 9,14. A diferencia de FACS, separación celular inmunomagnética no permite el uso de antígeno múltiple para la identificación de una pobl...

Antígeno de células 1 (Sca1, o Ly6A / E) del tallo fue identificado por primera vez como un marcador de superficie celular expresada por hematopoyéticas y mesenquimales células 5,6. La fracción vascular del estroma (SVF) de tejido adiposo obtenido de los depósitos de grasa del ratón es una población heterogénea de células que comprenden de fibroblastos, macrófagos, células endoteliales vasculares, células neuronales y células progenitoras de los adipocitos 7. Las células progenitoras de los adipocitos o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son células no cargadas de lípidos que residen en la matriz extracelular rica en colágeno perivascular (ECM) 8. Aproximadamente el 50% de la SVF constan de ASC, que se caracterizan como linaje negativo (Lin -) y CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La mayoría de estas células se Sca1 +: CD24 - progenitores de adipocitos, que son capaces de diferenciación de adipocitos in vitro; sin embargo, sólo una fracción de células (0,08% de SVF) constituye Sca1 <sarriba&gt; +: CD24 + células que son plenamente capaces de proliferar y diferenciarse en adipocitos en las condiciones in vivo 9. A pesar de la advertencia potencial del uso de Sca1 + SVF sin discriminar las células CD24 + CD24 de - células, aislar Sca1 + ASC de los depósitos de grasa utilizando la separación celular inmunomagnética es un método eficaz y práctico para determinar el fenotipo de células autónomas de las células progenitoras de los adipocitos primaria. En el campo de la obesidad y la diabetes, fibrosis tisular y la inflamación juega un papel crítico en el desarrollo y mantenimiento de la diabetes de tipo 2 3. Recientemente, Tokunaga et al. mostraron que las células aisladas de alto Sca1 inguinal (o subcutánea, SQ) y perigonadal (o visceral, VIS) los depósitos de grasa C57BL6 / J exhiben diferentes firmas de genes y la remodelación de ECM in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un miembro prototípico de la membrana-tmetaloproteinasa de matriz ipo (MMP) de la familia media en el desarrollo del tejido adiposo blanco (WAT) a través de su actividad colagenolítica 1. Los ejemplos de experimentos que pueden llevarse a cabo con las células aisladas y enriquecidas a través de la siguiente protocolo incluyen cultivo en tres dimensiones, los estudios de diferenciación, los ensayos de degradación de colágeno, y la secuenciación de ARN 10,11. Ensayos de degradación deben llevarse a cabo con el colágeno extraído con ácido para asegurar la preservación de telopéptido 11,12. El siguiente protocolo demostrará los métodos para aislar células del estroma vascular primarias de diferentes depósitos de grasa y enriquecer las células progenitoras de los adipocitos mediante separación celular inmunomagnética. La validez de la clasificación de células se evaluó con citometría de flujo y mediante el uso de ratones Sca1-GFP que expresan GFP en células Sca1 +, dirigido por un promotor Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Tipo 3 Colagenasa</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS004182</td><td>Digestión tisular</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Medio de cultivo con alto contenido de glucosa</td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo/Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; Filtro de células m</td></tr><tr><td>Placas de 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td> grandes <td>FST</td><td>14091-11</td><td>Punta fina y curvada</td></tr><tr><td>Pinzas grandes</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas 25G 5/8"</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Agujas 22G 1.5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de separación MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microesferas Anti-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Ab y microesferas anti-FITC 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS tampón de ejecución</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas chux azules</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Tablero de espuma de poliestireno</td><td></td><td></td><td>Uso de tubos de 50 ml</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2a anti-ratón Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2a anti-ratón F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Para solución de colagenasa</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I (2,7 mg/ml en ácido acético de 37 mm</td><td>Preparar en casa12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Preparar en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ácido carboxílico, éster de succinimidilo, isómeros mixtos</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

la separación inmunomagnética de sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; células madre derivadas de tejido adiposo (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

El aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) es un método importante en el campo de la biología del tejido adiposo, la adipogénesis y la remodelación de la matriz extracelular (MEC). In vivo, el entorno rico en ECM, que consiste en colágenos fibrilares, proporciona un soporte estructural a los tejidos adiposos durante la progresión y regresión de la obesidad. La remodelación fisiológica de la MEC mediada por metaloproteinasas de matriz (MMPs) desempeña un papel importante en la regulación del tamaño y la función del tejido adiposo1,2. La pérdida de la remodelación fisiológica de la MEC colagenolítica puede conducir a una acumulación excesiva de colágeno (fibrosis tisular), infiltración de macrófagos y, en última instancia, una pérdida de la homeostasis metabólica, incluida la resistencia a la insulina3,4. Cuando se observa un cambio fenotípico del tejido adiposo en modelos de ratón con genes dirigidos, el aislamiento de las ASC primarias de los depósitos de grasa para estudios in vitro es un enfoque eficaz para definir el papel del gen específico en la regulación de la función de las ASC. A continuación, definimos una separación inmunomagnética de ASCsaltas de Sca1.

El enriquecimiento de altos ASC Sca1 de diferentes almohadillas de grasa. Las células del estroma vascular aisladas de la grasa SQ pantalla similar a fibroblastos, estiran la forma celular, independientemente del nivel de expresión Sca1 (Figura 1A). Células de baja Sca1 alta y Sca1 Por otro lado, VIS (derivados de eWAT) demuestran clara diferencia en su forma de la célula. Como...

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre mesenquimales positivas para Sca1 a partir de diversos depósitos de grasa de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que, al utilizar la clasificación celular basada en microperlas inmunomagnéticas, se pueden enriquecer eficazmente células madre derivadas del tejido adiposo procedentes de diferentes depósitos grasos para experimentos posteriores. En general, los investigadores nuevos en este método encontrarán dificultades porque la intensidad y duración de la digestión tisular mediada por colagenasa deben optimizarse para obtener un número adecuado de células para la clasificación.Para aislar los tejidos adiposos subcutáneos, comience colocando el ratón sobre una tabla de disección de espuma en posición supina y rocíe el animal con etanol al 70 %. Después de asegurar las patas a la tabla, realice una pequeña incisión en la piel del abdomen inferior. Luego, sosteniendo el borde superior del corte con pinzas, use tijeras para separar la piel y el peritoneo desde el abdomen hasta el tórax.Realice cortes laterales en la piel, a lo largo del costado del cuerpo, y refleje la piel desde el peritoneo hacia la cabeza. Luego, retire la piel restante, sosteniendo la grasa inguinal alejada del cuerpo, y utilice agujas de calibre 22 para fijar la piel al tablero. A continuación, use la pinza para agarrar uno de los tejidos adiposos inguinales en su origen cerca del peritoneo, y corte con tijeras finas entre la piel y la grasa inguinal, avanzando hacia la ingle, evitando contaminar el tejido adiposo subcutáneo con la piel.Luego, coloque el páncreo inguinal aislado en una placa de 60 milímetros etiquetada como SQ que contenga medio de cultivo a 37 grados Celsius, y coseche el páncreo inguinal del otro lado del animal de la misma manera. Para aislar los páncreos viscerales, corte el peritoneo para exponer los páncreos viscerales y el intestino. A continuación, mueva el intestino hacia un lado, en dirección al tórax.Sujetando el páncreo adiposo visceral en el extremo distal, tire suavemente hacia arriba del tejido adiposo y diséquelo, teniendo cuidado de excluir el tejido epididimal. Luego, coloque el páncreo adiposo en una placa de 60 milímetros etiquetada con VIS que contenga medio de cultivo a 37 grados Celsius. Cuando se hayan recolectado todos los páncreos adiposos, transfiera las placas a una campana de cultivo de tejidos y aspire el medio.Utilice tijeras curvas para picar los cojinetes. Luego, agregue los trozos de grasa a tubos individuales de 50 mililitros que contengan colagenasa recién preparada. A continuación, agite los tubos a 300 RPM y 37 grados Celsius durante 10 a 20 minutos, hasta que los tejidos estén digeridos.Es posible que aún sean visibles algunos fragmentos de tejido del páncreo adiposo subcutáneo. Añada 20 mililitros de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la digestión, y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para aspirar y dispensar la suspensión de tejido 10 veces con el fin de disociar completamente los tejidos digeridos. Filtre las células a través de filtros celulares de 100 micrones y centrifugue los tejidos.Luego, vierta cuidadosamente el medio, teniendo cuidado de no perturbar los sedimentos, y resuspenda suavemente ambos grupos de células en cinco mililitros de agua estéril. Espere dos minutos para que los eritrocitos sean lisados. A continuación, detenga la reacción en cada tubo con 25 mililitros de medio suplementado con suero bovino fetal (FBS).Filtre ambas poblaciones de adipocitos a través de nuevos filtros celulares de 100 micrones, centrifúgelos nuevamente y luego resuspenda los precipitados en uno a tres mililitros de medio. Después de contar mediante exclusión de azul de tripano, siembre por separado una vez diez a la sexta células del tejido adiposo subcutáneo y células viscerales en pozos individuales de una placa de cultivo celular de seis pozos. Después de la tripsinización de las células, diluya la tripsina con un mililitro de tampón de separación y luego centrifugue las placas de cultivo.Suspendemos las células en 500 microlitros por tubo de tampón de separación, y centrifugamos las células nuevamente. Ahora, resuspendemos las células en 90 microlitros por tubo de tampón de separación, y mezclamos 10 microlitros de anticuerpo primario anti-Sca1 FITC en la suspensión celular. Tras 10 minutos de incubación a cuatro grados Celsius en la oscuridad, lavamos las células con un mililitro de tampón de separación por tubo.Después de centrifugar, las células se resuspenden en 80 microlitros de tampón de separación por suspensión celular. Luego, mezcle 20 microlitros de microperlas anti-FITC en cada pocillo y coloque las placas a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz durante 15 minutos. Al final de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de separación y resuspenda las células en 500 microlitros de tampón fresco por tubo.Ahora, coloque una columna en el soporte magnético y enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de separación. Transfiera las células del cultivo de tejido del páncreas adiposo subcutáneo a la columna, teniendo cuidado de evitar burbujas, y recoja las células negativas para Sca1 no marcadas en un tubo cónico de 15 mililitros. Una vez que todas las células hayan pasado, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de separación.Luego, transfiera la columna desde el imán a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros e introduzca un mililitro de tampón de separación fresco a través de la columna para eluir las células positivas para Sca1. Finalmente, centrifugue ambas fracciones de células positivas y negativas para Sca1 y resuspenda los precipitados en un mililitro de medio de cultivo. A continuación, cuente el número de células en cada fracción y siembre las fracciones en pozos individuales de una nueva placa de cultivo celular de seis pozos.Las células estromales vasculares aisladas de grasa subcutánea presentan una forma alargada similar a la de un fibroblasto, independientemente de su nivel de expresión de Sca1. Al igual que las células derivadas de grasa subcutánea inguinal con alta expresión de Sca1, las células derivadas de grasa visceral epididimal con alta expresión de Sca1 muestran una forma alargada similar a la de un fibroblasto. Mientras que las células VIS Sca1 bajas exhiben una forma epitelioide.Las células Sca1 altas aisladas de ratones Sca1-GFP aislados se identifican fácilmente como células GFP positivas en cultivo tisular. De hecho, cuando estas células se evalúan mediante citometría de flujo, la mayoría de las células GFP positivas confirman la expresión de proteínas Sca1 en sus superficies celulares, tal como se detecta mediante el anticuerpo anti-Sca1. Combinado con análisis de PCR en tiempo real, se puede demostrar la expresión diferencial de las metaloproteinasas matriciales colagenolíticas entre células madre derivadas de tejido adiposo Sca1 altas procedentes de grasa inguinal y epididimaria.Además, cuando se utilizan geles de colágeno tipo I marcados con fluoresceína para evaluar la actividad de degradación pericelular, se observa una actividad marcadamente aumentada de remodelación del colágeno mediada por células madre derivadas del tejido adiposo viscéral con alta expresión de Sca1. Una vez dominado, el aislamiento de células de la almohadilla de grasa puede completarse en dos horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un campo quirúrgico limpio y organizado para asegurar un aislamiento eficiente de la almohadilla de grasa.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de degradación de colágeno, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación tisular mediada por células madre derivadas del tejido adiposo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la obesidad y la biología de la matriz exploraran el papel de las células madre derivadas del tejido adiposo en la remodelación y función del tejido adiposo en ratones y humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y enriquecer células primarias positivas para Sca1 a partir de depósitos de tejido adiposo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica

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