Name: Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a detectar simultáneamente la activación de c-Fos en vías dopaminérgicas mesolímbicas y mesocorticales tras la ingesta de azúcar y grasa en ratas. Este método combina técnicas inmunohistológicas y análisis conductuales para estudiar los mecanismos neuronales de la recompensa.

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Gracias a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson y Theologia Karagiorgis por su arduo trabajo en este proyecto.

Estos protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional que certifique que todas las materias y los procedimientos están de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Los sujetos <ol><li> Compra y / o raza ratas Sprague-Dawley (260 - 300 g,). </li><li> Casa ratas individualmente en jaulas de malla de alambre. Su mantenimiento y su ciclo de 12:12 horas de luz / oscuridad con comida para ratas y agua disponible ad libitum. </li><li> Asignar los tamaños de muestra apropiados (por ejemplo, n ≈ 6-8) aleatoriamente en grupos. </li></ol> 2. Aparatos y aceptación de las pruebas Procedimientos <ol><li> Utilice tubos de centrífuga calibrados con tapones de goma y un tubo de metal para sorber ángulo de 45 ° para proporcionar una medición precisa (± 0,1 ml) de las soluciones presentadas. Asegurarlas a las jaulas por un resorte metálico tenso para permitir la visibilidad de las calibraciones. </li><li> Restringir las raciones de alimentos (~15 / g / día) de las ratas para reducir el peso a 85% de su peso corporal original para aumentar la motivación para consumir las soluciones. Nota: La reducción de peso debe tener entre 3 - 5 días. </li><li> Proporcionar soluciones pre-formación (10 ml) de 0,2% sacarina durante cuatro días durante una sesión de 1 hora para maximizar la probabilidad de que las ratas tomarán muestras de las soluciones de ensayo posteriores con una latencia corta (menos de 1 min). </li><li> Confirmar flujo a través del tubo de centrífuga derramando unas gotas. </li><li> Pesar tubos antes y después de cada sesión de medición para obtener la ingesta. </li><li> Realizar una prueba de admisión en el quinto día en los subgrupos que recibieron una de las seis soluciones (10 ml, 1 hr): a) agua, b) novela sabor (0,05% de aroma de cereza) 0,2% sacarina, c) 8% de fructosa, d) 8 % de glucosa, e) 3,5% de aceite de maíz en suspensión en 0,3% de goma de xantano, y f) 0,3% de goma de xantano. </li><li> Asegúrese de que las soluciones nutritivas son isocalórico; Por lo tanto, la concentración de aceite de maíz 3,5% es isocalóricas a las soluciones de azúcar 8%. </li><li> garantizar THen ratas soluciones de muestra con una latencia corta (menos de 1 min). Si no se cumple este requisito, entonces descartar el objeto del estudio. </li></ol> 3. Preparación del tejido <ol><li> Anestesiar a cada animal mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital 90 min después de la exposición inicial a cada solución de ensayo. Confirman que los animales estén correctamente anestesiados por lo que demuestra que el animal ya no es sensible a los reflejos tales como la retirada de pellizco pie, parpadeando tras la presión de la córnea directa o sacudir la cabeza a la estimulación del pabellón auricular profunda. </li><li> Perfundir cada animal transcardially como se describió anteriormente 69. <ol><li> Anestesiar las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico (65 mg / kg), retire la caja torácica y exponer el pecho para el libre acceso al corazón 69. </li><li> Coloque la aguja en el ápice de la válvula del corazón izquierdo, y cortar la vena cava. Administrar solución de tampón fosfato (PBS, ~ 180 ml) seguido de un co fijador tamponada con fosfatontaining 4% de paraformaldehído (~ 180 ml). </li><li> Asegúrese de que el animal es en realidad ser perfundido correctamente examinando si el líquido está dejando otras cavidades, como la nariz, la boca y áreas genitales. Nota: la fijación adecuada con paraformaldehído estará acompañado por movimientos musculares grandes. Si esto no ocurre, vuelva a ajustar la aguja hasta que se produzca esta reacción. </li></ol></li><li> Retire el cerebro del cráneo rápidamente cortando la piel y la piel lejos del cráneo. Utilice unas pinzas para romper y retirar el hueso del cerebro se mueve de atrás hacia delante. El trabajo inicialmente en el área debajo y detrás del cerebelo, asegurando que la gubia es entre el hueso y la piamadre meníngea. Una vez que la parte superior y los lados del cráneo se eliminan, utilizar una pequeña espátula para levantar el cerebro de la base, y cortar los nervios craneales con unas tijeras pequeñas. Tenga cuidado de no dañar el cerebro al intentar retirar el hueso. </li><li> Fijar los cerebros en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C.Coloque los cerebros en una solución de sacarosa al 30% / 70% de PBS a temperatura ambiente hasta que se asientan en la parte inferior del recipiente. </li><li> Bloquear el cerebro <ol><li> Retire la parte rostral del cerebro corte caudal transversalmente al bulbo olfatorio. </li><li> Retire la parte caudal del cerebro cortar transversalmente a nivel del cerebelo y la protuberancia. </li></ol></li><li> Monte el cerebro coronal con la parte caudal fijo a la etapa de un micrótomo de deslizamiento, y cortaron secciones coronales (40 micras) a través del córtex prefrontal medial (2,86-2,20 mm rostral al bregma), el núcleo y la cáscara NAC y el cuerpo estriado dorsal (+ 1,76-1,60 mm rostral al bregma), el AMY (-2,12 a -2,92 mm caudal a bregma), y el VTA (-5,20 a -5,60 mm caudal a bregma). Use un atlas del cerebro de rata 70 para recibir orientación. </li><li> Recoger las secciones que flotan libremente en los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos lleno de PBS para el análisis inmunohistoquímico eventual 71. Use Parafilm para sellar la 24 nosll placa para asegurarse de que el sistema de cartilla no se evapora en el contenedor y secar el cerebro. Almacenar el tejido cerebral en 4 ° C. </li></ol> 4. Procedimientos c-fos (Adaptado de 71) <ol><li> Tratar a cada sección con 5 ml de 5% suero de cabra normal y 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hr. </li><li> Incubar las secciones tratadas con anticuerpos primarios (conejo anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C durante 36 horas en pocillos que contenían 1 ml de PBS. </li><li> secciones de enjuague 3 veces con PBS (5 ml) durante 10 min cada uno. </li><li> Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo biotinilado; 1: 200) a TA durante 2 h en pocillos que contenían 1 ml de PBS. </li><li> Enjuague cada sección 3x en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno. </li><li> Incubar las secciones enjuagaron durante 2 h en una mezcla avidina-peroxidasa de rábano picante disponible en el mercado que viene en un kit compuesto de avidina DH (100 l) y peroxidasa de rábano picante biotinilada H (100 l) en 5 ml de PBS. </li><li> Vuelva a enjuagar las secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno. </li><li> Reaccionar las secciones con 0,05% de diaminobencidina (DAB) en presencia de 0,0015% H 2 O 2 5 - 10 min, dependiendo de la reactividad del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB. </li><li> Haga doble etiqueta las secciones de VTA. Incubar con un anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH) (conejo anti-rata TH, 1: 2000) en PBS (5 ml) durante la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno. </li><li> Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra biotinilado anti-conejo; 1: 200) en PBS (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno. </li><li> Visualizar los anticuerpos mediante el uso de un complejo anticuerpo-peroxidasa secundaria. Reaccionar con una combinación de 0,05% DAB y una solución de sulfato de níquel 0,3%, el 5 - 10 min, dependiendo de la reacción del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB / NiCl. </li><li> Asegúrese de que la solución DAB es de color verde claro de color lechoso de ellas reacción con el sulfato de níquel 0,3%. Si la solución es demasiado verde, a continuación, la reacción será demasiado oscuro. </li><li> Montar todas las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina. dejarlos secar durante la noche y, a continuación, los cubres con unas pocas gotas de una solución de tolueno-base (TBS). </li><li> Código desliza de modo que la condición experimental es desconocido para los observadores. </li></ol> 5. Determinación de c-fos Inmunorreactiva Counts <ol><li> Asignar pares de observadores imparciales para contar las neuronas Fos-positivas en estas regiones de interés (ROI): prelimbic córtex prefrontal medial, infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, NAC cáscara, núcleos AMY basolateral, AMY centro-cortico-medial, estriado dorsal, y VTA. Delinear si c-Fos inmunoreactividad estuvo presente en TH TH + y células en el VTA. La figura 1 proporciona una imagen de pantalla capturada de la NAC del microscopio. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53897/53897fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Sección Representante del núcleo accumbens (NAC) Viendo Regiones de interés delineadas por la red mediante el cual se hizo el recuento de c-fos. La cáscara NAC se encuentra medial y ventral al núcleo NAC. El núcleo NAC rodea la comisura anterior (anterior Comm.). La extensión ventral del ventrículo lateral (lateral Vent.) Es visible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53897/53897fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Analizar al menos tres rebanadas representativos por sitio común a todos los animales en todas las condiciones de prueba. </li><li> Utilizar software y un microscopio óptico para analizar toda la región para cada ROI mediante el trazado de un esquema (Figura 1). <ol><li> Para un determinado lugar, abrir la aplicación y haga clic en el menú desplegable de adquisición y haga clic en &quot;Imagen en directo&quot;. Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. A continuación, tras de la región del cerebro elegido utilizando la red como una guía. Una vez que se ha completado la traza, contar las células (pasos 5.3.1.1 - 5.3.1.3). <ol><li> Haga doble clic en el icono del software. Ir a la barra de menús, haga clic en &quot;Adquisición&quot; y luego &quot;Imagen en directo&quot;. Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. </li><li> Ir a la barra de herramientas de red y haga clic en &quot;Mostrar cuadrícula&quot; y &quot;etiquetas&quot; Uso de la rejilla. Delinear el retorno de la inversión con una traza predeterminada. </li><li> Contar todas las células en cada área ROI, seleccione un &quot;+&quot; en la barra lateral izquierda para mantener el recuento de células c-fos. Haga clic en cada celda por separado para registrar los cargos. Considere una célula positiva para c-fos cuando un círculo rojo oscuro definido se observó (Figura 1). </li></ol></li><li> Repita este procedimiento para cada sitio. </li><li> Registro de cuenta en un cuaderno de laboratorio y en el equipo para futuros análisis. Ir a la barra de menús, haga clic en &quot;Archivo&quot;, &quot;Guardar archivo de datos&quot; para guardar la localización y recuentos. </li></ol&gt; </li><li> Asegúrese de que la confiabilidad entre calificadores (usando correlación de cuentas) de los dos evaluadores no informados para cada sección en cada ROI siempre supera 0,8. </li></ol> 6. Estadísticas <ol><li> Evaluar la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días usando un análisis de medidas repetidas de 1 vía de la varianza (ANOVA) comparar la ingesta de sacarina de los Días 1, 2, 3 y 4 69. </li><li> Comparación de la ingesta de sacarina (día 4) con tomas de prueba (día 5) de los seis grupos que utilizan un bloque al azar ANOVA de 2 vías 69. </li><li> Utilizar comparaciones de Tukey (p &lt;0.05) para determinar los efectos significativos individuales 69. </li><li> Determinar la confiabilidad entre calificadores, y luego usar el recuento de un observador común. </li><li> Los recuentos de c-fos promedio para los tres rebanadas representativos para cada sitio 69. <ol><li> Realizar un ANOVA de 1 vía de la activación de c-fos inducida por la ingesta de las seis soluciones de (aceite de 3,5% de maíz, 8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, xaNthan control de goma y agua) para el perilímbica mPFC 69. </li><li> análisis paralelos de la repetición de los seis grupos de infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, AMY centro-cortico-medial, VTA y el cuerpo estriado dorsal. Utilizar comparaciones de Tukey (p &lt;0,05) para revelar efectos significativos individuales 69. </li></ol></li><li> Comparación de la ingesta de aceite de maíz con tanto ingestión de agua y de su agente de suspensión, goma xantana. Comparación de la ingesta de fructosa y glucosa con tanto la ingesta de agua y el consumo del edulcorante no nutritivo, sacarina. </li><li> Establecer si se observaron relaciones significativas entre la ingesta de soluciones y la activación de c-fos en cada uno de los sitios usando correlaciones r Bonferroni (p &lt;0,05). <ol><li> Sistemáticamente comparar los recuentos de c-fos en el perilímbica y la corteza prefrontal infralímbica para cada animal en el grupo de aceite de maíz 3,5%. </li><li> Repetir análisis sistemáticamente paralelas de cada par de los seis sitios (VTA, el cuerpo estriado dorsal, infralimbic córtex prefrontal medial, perilímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, centro-cortico-medial AMY) para el aceite de maíz 3,5%. </li><li> Repetir análisis sistemáticamente paralelas de estos seis sitios para los otros cinco condiciones de admisión experimentales (8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, de control de la goma de xantano y agua). </li></ol></li><li> Aprovechar el hecho de que los mismos animales dentro de una condición solución se evaluaron en todos los sitios mediante la determinación de las relaciones significativas entre la activación de c-fos en todas las soluciones y dentro de cada solución utilizando Bonferroni r correlaciones (p &lt;0,05). </li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

El objetivo del estudio fue determinar si la fuente (VTA) y los objetivos de proyección del cerebro anterior (NAC, Amy, córtex prefrontal medial) de DA neuronas relacionadas con la recompensa se activan simultáneamente después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas mediante la técnica celular de c-fos . El presente estudio es una descripción detallada de los protocolos de un estudio publicado previamente 69. Se planteó la hipótesis de que el VTA, sus principales zonas de proyección a la preli...

Dopamina en el cerebro (DA) se ha implicado en respuestas centrales a la ingesta de azúcares de sabor agradable a través propuesto hedónica de 1,2, esfuerzo-relacionadas 3 y el hábito de base 4,5 mecanismos de acción. La vía DA primaria implicados en estos efectos se origina en el área tegmental ventral (ATV), y proyectos a la accumbens (NAC) núcleo y la cubierta, la amígdala basolateral y centro-cortico-medial (AMY), núcleo y el prelimbic y medial infralímbica corteza prefrontal (córtex prefrontal medial) (ver comentarios 6,7). El VTA ha sido implicada en la ingesta de sacarosa 8,9, y la liberación de DA es observado después de la ingesta de azúcar en el NAC 10-15, AMY 16,17 y mPFC 18-20. El consumo de grasas también estimula la liberación de DA NAC 21, y otro DA-rica zona de proyección con el cuerpo estriado dorsal (caudado-putamen) también se ha asociado con la alimentación mediada por DA 22,23. Kelley 24-27 propuso que estos proyectos múltipleszonas de iones de este sistema mediada por DA formaron una red cerebral distribuido integrado e interactivo a través de amplias e íntimas interconexiones 28-34. Además de la capacidad de los antagonistas de los receptores DA D1 y D2 para reducir la ingesta de azúcares y grasas 35-37 38-40, la señalización de DA también se ha implicado en la mediación de la capacidad de los azúcares y las grasas para producir las preferencias de sabor acondicionado (PPC) 41- 46. La microinyección de un antagonista de los receptores D1 DA en el NAC, AMY o mPFC 47-49 eliminan adquisición de PPC provocada por la glucosa intragástrico. Mientras que microinyecciones de antagonistas de los receptores DA ya sea D1 o D2 en el córtex prefrontal medial elimina la adquisición de la fructosa-PPC 50, la adquisición y expresión de la fructosa-PPC están diferencialmente bloqueados por los antagonistas de DA en el NAC y AMY 51,52. La técnica 53,54 c-fos se ha empleado para investigar activatio neuraln inducida por la ingesta de palatable y la activación neural. El término &quot;activación de c-fos&quot; se utiliza en todo el manuscrito, y se define operacionalmente por el aumento de la transcripción de c-Fos durante la despolarización neuronal. La ingesta de sacarosa aumentó fos-como inmunoreactividad (FLI) en el núcleo central AMY, el VTA, así como la cáscara, pero no del núcleo, de la NAC 55-57. Mientras que la ingesta de sacarosa en ratas sham-alimentación aumentado significativamente FLI en el AMY y la NAC, pero no el VTA 58, intragástrica de sacarosa o glucosa infusiones aumentaron significativamente FLI en el NAC y núcleos centrales y basolateral de la AMY 59,60. Además repetida de sacarosa para el acceso Chow programada aumentó FLI en el córtex prefrontal medial, así como la cáscara NAC y el núcleo 61. Un paradigma de reducción de marcha concentración de sacarosa reveló que los mayores incrementos FLI se produjeron en el AMY basolateral y NAC, pero no el VTA 62. Después del acondicionamiento, la extinción de rewa naturales relacionadas con el azúcarcomportamientos rd aumentaron FLI en el AMY basolateral y la NAC 63. Por otra parte, el emparejamiento de la disponibilidad de azúcar a un tono resultó en el tono, posteriormente, aumentar los niveles de FLI en el AMY basolateral 64. Ingesta alta en grasas también aumentó FLI en el NAC y mPFC sitios 65-67. La mayoría de los estudios anteriormente citados examinaron los efectos de azúcar y grasa en la activación de c-fos en sitios individuales que no proporcionan información sobre la identificación de las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos 24-27. Además, muchos de los estudios tampoco delinear las contribuciones relativas de las sub-áreas de la NAC (núcleo y la cubierta), AMY (basolateral y cortico-medial central) y el córtex prefrontal medial (prelimbic y infralímbica) que potencialmente podrían ser examinado por el ventaja de excelente, la resolución de una sola célula espacial en c-Fos mapeo 68. Nuestro laboratorio 69 utilizado recientemente la activación de c-fos y alteraciones medidos simultáneamente en la vía VTA DA y su prozonas Jection (NAC, Amy y mPFC) después de la novela de la ingestión de grasas y azúcares en ratas. El presente estudio describe los pasos procedimentales y metodológicos para analizar simultáneamente si la exposición aguda a seis soluciones diferentes (el aceite de maíz, glucosa, fructosa, sacarina, agua y un control de la emulsión de grasa) se diferencialmente activar FLI en sub-áreas de la NAC, AMY, mPFC así como el cuerpo estriado dorsal. Esta detección simultánea de diferencias permite la confirmación de efectos significativos en FLI en cada sitio y determinación en cuanto a si los cambios en un sitio particular, correlacionados con los cambios en los sitios relacionados, proporcionando de ese modo soporte para una red cerebral distribuido 24-27. Estos procedimientos probados si el VTA, el prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, el núcleo y la cubierta de la NAC y el AMY basolateral y centro-cortico-medial), así como el cuerpo estriado dorsal exhibiría coordinada y activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de glucosa (8%), fructosa (8%), aceite de maíz (3,5%) y las soluciones de sacarina (0,2%).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rats Charles</td><td>River Laboratories</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas de malla de alambre</td><td>Productos de laboratorio, Seaford, DE</td><td>Bastidor</td><td></td>de 30 jaulas</tr><tr><td>Rat Chow</td><td>PMI Nutrition International</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Taut Metal Spring</td><td>Lab Products, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Báscula de pesaje para ratas</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Nalgene</td><td>Productos de laboratorio, Seaford, DE</td><td>10-0501</td><td></td>Productos de</tr><tr>laboratorio con<td>tapón de goma</td><td>, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Productos de laboratorio para sorbos de metal</td><td>, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sacarina</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>82385-42-0</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, Cereza</td><td>Kool-Aid</td><td>Comercial</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, Uva</td><td>Kool-Aid</td><td>Comercial</td><td></td></tr><tr><td>Fructosa Sigma</td><td>Chemical Co</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de Maíz</td><td>Mazzola</td><td></td> Goma Xantana Comercial <td></td></tr><tr><td>Sigma Chemical</td><td>Co</td><td>11138-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo Deslizante</td><td>Microm International</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Neurolucida MBF</td><td>Bioscience</td><td>Aplicación</td><td></td></tr><tr><td>de software Portaobjetos recubiertos de gelatina</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Cepillos de nailon dorados</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Pelo Natural Sable&nbsp;</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2022</td><td></td></tr><tr><td>24 Placas de pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>6 Placas de pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de Pyrex de 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de tejido (filtro de tejido)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7200214</td><td></td></tr><tr><td>Eagle pipetas&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>E10 para 1-10&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de águila&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>E100 para 20-100&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de águila&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>E200 para 50-200&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de águila&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>E1000 para 100-1000&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de águila&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>E5000 para 1000-5000&#956; l&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntas universales .1-10 &#956; l</td><td>Instrumentos de precisión del mundo</td><td>500192</td><td></td></tr><tr><td>puntas universales 5-200 &#956; l</td><td>Instrumentos de precisión del mundo</td><td>500194</td><td></td></tr><tr><td>puntas universales 500-5,000 &#956; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>500198</td><td></td></tr><tr><td>Blade Vibroslice 100</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLADE</td><td></td></tr><tr><td>DPX Medio de montaje&nbsp;</td><td>Microscopía Electrónica&nbsp;</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Biologix Research Co.</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de portaobjetos</td><td>Biologix Research Co.</td><td>41-6100</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital&nbsp;</td><td>Corporación Madell&nbsp; &nbsp;</td><td>ZD-9556</td><td></td></tr><tr><td>barcos de pesaje&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas desechables de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator Software</td><td>Micro Bright Field</td><td>Software application</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído granular</td><td>Fisher Scientific</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio difásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrógeno Peróxido&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear II&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-044-192</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Vector de suero de cabra normal</td><td></td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ABC Kit Peroxidasa Vector</td><td>Estándar</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cFos (Ab-5) Conejo</td><td>EMD chem/Cal Biochem</td><td>PC38</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>SigmaAldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>3,3' diaminobencidina tetra clorhidrato&nbsp;</td><td>SigmaAldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>SigmaAldrich</td><td>5881</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo TH primario</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Euthosol</td><td>Virbac AH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección simultánea de c-fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical siguiendo naive la ingestión de azúcar y grasa en ratas

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Este estudio utiliza la activación celular de c-fos para evaluar los efectos de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en las vías de la dopamina del cerebro (DA) en ratas. La ingesta de azúcares y grasas están mediadas por sus atracciones innatas, así como las preferencias aprendidas. dopamina en el cerebro, especialmente meso-límbico y proyecciones meso-cortical desde el área tegmental ventral (ATV), ha sido implicado en estas dos respuestas sin letras y aprendido. El concepto de las redes cerebrales distribuidas, en la que varios sitios y sistemas emisor / péptidos interaccionan, se ha propuesto para mediar en la ingesta de alimentos sabrosos, pero no hay evidencia limitada que demuestra empíricamente este tipo de acciones. Por lo tanto, el consumo de azúcar provoca inmunorreactividad DA de liberación y aumenta c-fos-como (FLI) de las zonas individuales de proyección VTA DA incluyendo el núcleo accumbens (NAC), la amígdala (AMY) y la corteza prefrontal medial (mPFC), así como el cuerpo estriado dorsal. Además, la administración central de antagonistas de los receptores DA selectivos en estos sitioss diferencialmente reducir la adquisición y expresión de las preferencias de sabor acondicionado provocados por azúcares o grasas. Un método por el cual, para determinar si estos sitios interactuaron como una red cerebral distribuida en respuesta a la ingesta de azúcar o grasa sería simultánea evaluar si el VTA y sus principales zonas de proyección mesotelencefálica DA (prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo y la cubierta de la NAC, basolateral y centro-cortico-medial AMY), así como el cuerpo estriado dorsal mostraría coordinado y la activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de aceite de maíz (3,5%), glucosa (8%), fructosa (8%) y sacarina (0,2 %) soluciones. Este enfoque es un exitoso primer paso para identificar la viabilidad de utilizar la activación celular c-fos simultáneamente a través de los sitios relevantes del cerebro para estudiar el aprendizaje relacionado con la recompensa en la ingestión de alimentos palatable en roedores.

Todos los resultados representativos se describen a continuación se han publicado previamente 69, y se re-presentado aquí para apoyar a &quot;prueba de concepto&quot; en la indicación de la eficacia de la técnica. ingesta de solución No se observaron diferencias significativas en la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días para todos los animales (F (3,108) = 57,2...

El objetivo de este estudio es identificar las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos por delinear una técnica fiable inmunohistoquímico mediante la activación celular de c-fos para medir los cambios simultáneos en las vías de la dopamina y sitios de terminal después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas.

Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

El objetivo general de este protocolo experimental es determinar si la VTA y sus principales zonas de proyección mesotelencefálica de DA muestran una activación coordinada y simultánea de c-Fos tras la ingesta novedosa de soluciones de aceite de maíz, glucosa, fructosa o sacarina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la motivación, y a identificar si múltiples regiones cerebrales se activan de forma coordinada en respuesta a estímulos sabrosos. La principal ventaja de esta técnica es que combina ensayos conductuales establecidos, técnicas de activación celular y análisis estadísticos.Para configurar el aparato, utilice un tubo de centrífuga calibrado con un tapón de goma y un tubo metálico para sorber en ángulo de 45 grados para obtener una medición precisa de la solución presentada a la rata. Fíjelo a la jaula individual mediante un resorte metálico tenso, permitiendo así la visibilidad de la calibración. De tres a cinco días antes del entrenamiento, restrinja las raciones de alimento a la rata para reducir su peso corporal al 85 % de su peso original, con el fin de aumentar la motivación para consumir la solución.Mientras tanto, administre 10 mililitros de solución previa al entrenamiento, con sacarosa al 0,2%, al animal durante cuatro días, en sesiones de una hora, para maximizar la probabilidad de que la rata consuma la solución de prueba subsecuente con una latencia corta. Pese el tubo antes y después de cada sesión para obtener la medición del consumo. Luego, realice una prueba de consumo el quinto día en subgrupos que reciban una de las seis soluciones.Asegúrese de que las ratas muestreen la solución con una latencia corta, y excluya a los sujetos del estudio si no se cumple este requisito. Para preparar el tejido, tras sacrificar al animal, retire rápidamente el cerebro del cráneo. Utilice el rongeur para romper y retirar cuidadosamente el hueso del cerebro, comenzando desde la parte trasera hacia la delantera.Trabaje en la zona debajo del cerebelo y asegúrese de que los rongeurs estén entre el hueso y la piamadre meníngea. Una vez que se hayan retirado la parte superior y los lados del cráneo, utilice una espátula pequeña para levantar el cerebro desde su base y corte los nervios craneales con tijeras pequeñas. A continuación, fije el cerebro en solución al 4 % de paraformaldehído durante la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, coloque el cerebro en la solución de sacarosa a temperatura ambiente hasta que se asiente en el fondo del recipiente. Después de eso, retire el bulbo olfatorio. Posteriormente, retire el cerebelo y la protuberancia.Luego, monte el cerebro en sentido coronal, con la parte caudal fijada a la platina del microtomo, y corte secciones coronales de 40 µm. En este procedimiento, trate las secciones con cinco mililitros de suero de cabra normal al 5 % y 0,2 % de Triton X-100 en PBS, durante una hora. A continuación, incube las secciones tratadas con el anticuerpo primario a cuatro grados Celsius durante 36 horas, en pozos que contengan un mililitro de PBS.Después de 36 horas, lave las secciones tres veces con cinco mililitros de PBS durante 10 minutos cada vez. A continuación, incube las secciones con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante dos horas, en pozos que contienen un mililitro de PBS. Posteriormente, lave las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS durante 10 minutos cada vez.A continuación, incubar las secciones lavadas durante dos horas en una mezcla comercial de avidina y peroxidasa de rábano picante. Después de dos horas, lavar las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. Posteriormente, hacer reaccionar las secciones con DAB en presencia de peróxido de hidrógeno, durante cinco a diez minutos.Después de eso, marque doblemente las secciones de la VTA incubándolas con un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa, en cinco mililitros de PBS, durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, enjuague las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. A continuación, incube las secciones con el anticuerpo secundario en cinco mililitros de PBS, a temperatura ambiente, durante dos horas.Después de dos horas, enjuague los cortes tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. Para visualizar el anticuerpo utilizando un complejo de anticuerpo secundario con peroxidasa, reaccione con una combinación de DAB y una solución al 0,3 % de sulfato de níquel durante cinco a diez minutos. Cuente las células haciendo doble clic en el icono del software.Vaya a la barra de menú, haga clic en Adquisición y luego en Imagen en Vivo. A continuación, enfoque la región de interés y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. Luego, vaya a la barra de herramientas de cuadrícula y haga clic en Mostrar Cuadrícula y Usar Etiquetas de Cuadrícula.Delinee la región de interés con un trazado predeterminado. A continuación, cuente todas las células en cada región de interés y seleccione Más en la barra lateral izquierda para registrar los conteos de las células c-Fos. Considere positiva para c-Fos a una célula cuando se observe un círculo rojo oscuro bien definido.Repita este proceso para cada sitio y asegúrese de que la fiabilidad entre evaluadores de los dos evaluadores no informados para cada sección en cada región de interés siempre supere 0,8. Posteriormente, cuente las neuronas positivas para c-Fos en las regiones de interés. Determine si la inmunorreactividad para c-Fos está presente en las células positivas y negativas para TH en el área tegmental ventral (VTA).Esta imagen muestra que la ingesta de grasa o azúcar aumenta de forma diferencial la activación de c-Fos en toda la amígdala, así como en las subáreas amigdalinas basolateral y corticomedial central. En esta imagen, se observó la activación real de c-Fos en la amígdala en animales expuestos a la ingesta de aceite de maíz, glucosa y fructosa. También se observó la activación de c-Fos en el área tegmental ventral (VTA) en animales expuestos al aceite de maíz y al agua.Las flechas negras indican las células representativas positivas para TH y c-Fos con doble etiquetado, mientras que las flechas grises indican las células representativas solo positivas para c-Fos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro semanas, si se lleva a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir una metodología precisa, así como el almacenamiento y el conteo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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