Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas

El objetivo general de este protocolo experimental es determinar si el VTA y sus principales zonas de proyección de DA mesotelenfáticas mostrarían una activación coordinada y simultánea de c-Fos después de una nueva ingesta de soluciones de aceite de maíz, glucosa, fructosa o sacarina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la motivación, e identificar si múltiples sitios del cerebro se activan de manera coordinada en respuesta a estímulos palatables. La principal ventaja de esta técnica es que combina los ensayos conductuales establecidos, las técnicas de activación celular y los análisis estadísticos.

Para configurar el aparato, use un tubo de centrífuga calibrado con un tapón ladrón y un tubo sorbedor de metal en ángulo de 45 grados para proporcionar una medición precisa de la solución presentada a la rata. Asegúrelo a la jaula de inicio mediante un resorte de metal tenso y para permitir la visibilidad de la calibración. De tres a cinco días antes del entrenamiento, restrinja las raciones de comida a la rata para reducir su peso corporal al 85% de su peso original, con el fin de aumentar la motivación para consumir la solución.

Mientras tanto, proporcione 10 mililitros de solución de pre-entrenamiento, con un 0,2% de sacarina, al animal durante cuatro días, durante una sesión de una hora, para maximizar la probabilidad de que la rata muestree la solución de prueba posterior con una latencia corta. Pesar el tubo antes y después de cada sesión para obtener la medición de la ingesta. Luego, realice una prueba de ingesta al quinto día en subgrupos que recibieron una de las seis soluciones.

Asegúrese de que las ratas muestreen la solución con latencia corta y excluya a los sujetos del estudio si no se cumple este requisito. Para preparar el tejido, después de sacrificar al animal, extraiga el cerebro del cráneo rápidamente. Use los rongeurs para romper y quitar con cuidado el hueso del cerebro, comenzando de atrás hacia adelante.

Trabaje en el área debajo del cerebelo y asegúrese de que los rongeurs estén entre el hueso y la piamadre meníngea. Una vez que se hayan extraído la parte superior y los lados del cráneo, use una espátula pequeña para levantar el cerebro de su base y corte los nervios craneales con unas tijeras pequeñas. Luego, fije el cerebro en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, coloque el cerebro en la solución de sacarosa a temperatura ambiente, hasta que se asiente en el fondo del recipiente. Después de eso, retire el bulbo olfativo. Posteriormente, retira el cerebelo y la protuberancia.

A continuación, monta el cerebro coronalmente, con la parte caudal fijada a la etapa del micrótomo, y corta secciones coronales de 40 mirómetros. En este procedimiento, tratar las secciones con cinco mililitros de suero de cabra al 5%normal y 0,2% de Triton x-100 en PBS, durante una hora. A continuación, incubar las secciones tratadas con anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante 36 horas, en los pocillos que contengan un mililitro de PBS.

Después de 36 horas, enjuague las secciones tres veces con cinco mililitros de PBS durante 10 minutos cada vez. A continuación, incubar las secciones con anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante dos horas, en los pocillos que contengan un mililitro de PBS. Luego, enjuague las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS durante 10 minutos cada vez.

A continuación, incube las secciones enjuagadas durante dos horas en una mezcla de peroxidasa de rábano picante Avidin disponible en el mercado. Después de dos horas, enjuague las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. Posteriormente, reaccione las secciones con DAB en presencia de peróxido de hidrógeno, durante cinco a diez minutos.

Después de eso, marque dos veces las secciones de VTA incubándolas con un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa, en cinco mililitros de PBS, durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. A continuación, incubar las secciones con anticuerpo secundario en cinco mililitros de PBS, a temperatura ambiente, durante dos horas.

Después de dos horas, enjuague las secciones tres veces en cinco mililitros de PBS, durante diez minutos cada vez. Para visualizar el anticuerpo utilizando un complejo de peroxidasa de anticuerpos secundarios, reaccione con una combinación de DAB y una solución de sulfato de níquel al 0,3% durante cinco a diez minutos. Cuente las celdas haciendo doble clic en el icono del software.

Vaya a la barra de menú, haga clic en Adquisición y luego en Imagen en vivo. Después de eso, enfoca la región de interés y haz clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. A continuación, vaya a la barra de herramientas de la cuadrícula y haga clic en Mostrar cuadrícula y Usar etiquetas de cuadrícula.

Delinee la región de interés con un trazado predeterminado. A continuación, cuente todas las celdas de cada región de interés y seleccione Más en la barra lateral izquierda para registrar los recuentos de las células c-Fos. Considere una celda positiva para c-Fos cuando se observa un círculo rojo oscuro definido.

Repita este proceso para cada sitio y asegúrese de que la confiabilidad entre evaluadores de los dos evaluadores no informados para cada sección en cada región de interés, siempre supere 0,8. Después, cuente las neuronas c-Fos positivas en las regiones de interés. Defina si la inmunorreactividad de c-Fos está presente en las células TH-positivas y TH-negativas en el VTA.

Esta imagen muestra que la ingesta de grasas o azúcares aumenta diferencialmente la activación de c-Fos en toda la amígdala, así como en las subáreas de la amígdala basolateral y la corteza central-medial. En esta imagen, se observó la activación real de la amígdala c-Fos en animales expuestos a ingestas de aceite de maíz, glucosa y fructosa. La activación de C-Fos en el VTA también se observó en animales expuestos al aceite de maíz y al agua.

Las flechas negras indican las células TH c-Fos positivas representativas, con doble marcado, mientras que las flechas grises indican las células representativas de c-Fos solamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro semanas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir una metodología, almacenamiento y conteo precisos.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.