In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

El objetivo general de esta centrifugación de gradiente de velocidad es analizar las cápsidas del virus de la influenza A en condiciones que imiten el entorno endocítico que los virus entrantes encuentran durante la entrada a las células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo se desensamblan las cápsidas del virus de la influenza A durante la entrada a las células, como el efecto específico de un pH ligeramente ácido en la estabilidad de la cápside. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis cuantitativo del proceso de desenmascaramiento del virus de la gripe A en condiciones experimentales definidas.

Además de proporcionar información sobre cómo se inicia el desrecubrimiento del virus de la influenza A, este método también se puede aplicar al estudio de otros virus de la envoltura con mecanismos de desrecubrimiento relacionados. Demostrando el procedimiento, estará Firat Nebloglu, un antiguo alumno de mi laboratorio. Después de preparar los tampones y reactivos de acuerdo con el protocolo de texto, para cada condición de pH a probar, prepare la mezcla maestra de tampón detergente mezclando nueve mililitros de cloruro de sodio molar, seis mililitros de NP40 al 10%, 2,4 mililitros del caldo de inhibidores de proteasa 25X y nueve mililitros de agua doblemente destilada.

Luego, para cada condición de pH, pipete 4,4 mililitros de la mezcla maestra en un tubo cónico de 50 mililitros. Para valores de pH superiores a 5,8, añada al tubo 0,6 mililitros de la respectiva solución madre de Tris de 500 miliMolar ajustada al pH. Para valores de pH de 5,8 e inferiores, añada 0,6 mililitros de la respectiva solución madre MES de 500 milimolares ajustada al pH.

Prepare cinco mililitros de solución tampón, que contiene 300 miliMolar de cloruro de sodio, inhibidor de proteasa 2X, 60 miliMolar Tris, ajustado a pH 7.4 y agua doblemente destilada. Esto servirá como búfer de gradiente de control sin detergente. A continuación, agregue cinco mililitros de la calda de glicerol al 50 % a cinco mililitros de las mezclas tampón que contienen detergente y sin detergente, lo que da como resultado seis soluciones diferentes de glicerol al 25 %.

Utilice tiras de pH para verificar los valores de pH. Prepare una solución de glicerol al 15% mezclando una proporción de tres a siete de caldo de glicerol al 50% con agua destilada. Con una jeringa de cinco mililitros y una aguja, agregue tres mililitros de solución de glicerol al 15% a seis tubos de centrifugación ultratransparentes.

Lave la aguja con agua destilada doble después de cada paso. Utilice una jeringa de cinco mililitros y una aguja larga para inyectar cuidadosamente 3,4 mililitros de solución de glicerol al 25% debajo de la capa de glicerol al 15%, teniendo cuidado de no mezclar las dos capas. Una interfaz entre ambas capas es claramente visible.

Repita esto para las seis condiciones para probar con las respectivas soluciones de glicerol ajustado al pH. A continuación, en una cabina de bioseguridad de Clase II, utilice un mililitro de líquido alantoico clarificado y diluido, que contenga el virus de la gripe A, para superponer suavemente los gradientes de glicerol. Transfiera los tubos a los cubos del rotor, equilibre los tubos opuestos y colóquelos con cuidado en un rotor de ultracentrifugación SW-41 preenfriado.

Centrifugar a 2100 rpm y 12 grados centígrados durante 150 minutos. Después de la centrifugación, utilice una pipeta Pasteur limpia y un aspirador para eliminar cuidadosamente ambas capas de glicerol. Luego, con 40 mililitros de tampón de muestra LDS no reductor 1X, vuelva a suspender completamente el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Para llevar a cabo SDS-PAGE, caliente todas las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Cargue 20 microlitros de los gránulos disueltos en un minigel Bis-Tris de gradiente prefabricado y hágalo funcionar a 200 voltios durante una hora en el tampón de funcionamiento 1X MOPS SDS. Incubar el gel en solución de fijación durante una hora.

Enjuague una o dos veces con agua y tiña durante la noche en una placa de cultivo celular de 15 centímetros con un volumen suficiente de solución coloidal de Coomassie mientras agita suavemente a temperatura ambiente. Quita el gel en agua doblemente destilada, reemplazando el líquido cada 15 a 20 minutos hasta que el fondo del gel se aclare. Almacene el gel en agua doblemente destilada a cuatro grados centígrados hasta que se escanee para la cuantificación en banda.

Por último, escanee el gel a alta resolución y utilice un software personalizado disponible en el mercado para la cuantificación de las intensidades de las bandas de proteínas. Reste la señal de fondo de una región cercana a las bandas respectivas y normalice los valores a los valores de control sin detergente. En este experimento, X31 derivado de fluido alantoico clarificado se sometió a centrifugación en gradiente de velocidad a niveles de pH entre 7,4 y 5,0 y se analizó mediante SDS-PAGE.

Sin detergente presente en el gradiente, los viriones intactos se granulan como se refleja en el patrón característico de bandas, que representan HA, NP y M1 en el gel teñido con Coomassie. Tras la adición de NP40 a la capa inferior de glicerol, la envoltura viral, incluidos HA, NA y M2, se solubilizó y solo el núcleo viral se sedimentó en el gránulo durante la ultracentrifugación. A partir de un pH inferior a 6,5, el M1 se pierde gradualmente de la fracción de pellets, alcanzando un mínimo entre pH 5,8 y pH 5,4.

Por debajo de pH 5,8, las vRNP se disociaron y, por lo tanto, se perdieron del pellet. A partir de las bandas de proteínas analizadas, se revelaron dos umbrales de pH distintos para el desmontaje de la capa M1 y la disociación de los haces de vRNP, incluyendo pH 6,5 y pH 5,8, respectivamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, dependiendo de la cepa o mutante del virus de la influenza A en particular, se pueden observar diferentes propiedades de desmontaje.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía electrónica, para obtener información adicional, como la estructura de las cápsides aisladas del virus de la gripe.