Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

El objetivo general de este método es crear un dispositivo de muestreo a microescala, la sonda única, para analizar células individuales vivas mediante espectrometría de masas en condiciones ambientales. Y para realizar imágenes de espectrometría de masas ambientales de tejidos biológicos con alta resolución espacial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en estudios biológicos y farmacéuticos.

Por ejemplo, cuáles son las moléculas presentes en las células individuales vivas y cómo se distribuyen en los tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que la sonda única es un dispositivo multifuncional que se puede utilizar tanto para el análisis de células individuales vivas como para los experimentos de imágenes de espectrometría de masas ambiental de alta resolución. Aunque este método puede analizar células y tejidos individuales, también se puede aplicar a otros sistemas en los que es deseable el muestreo a microescala, como el análisis de espato de productos químicos y microcolonias y biopelículas vivas.

Wei Rao, un postdoc de mi laboratorio, demostrará el procedimiento conmigo. Coloque todo un órgano de ratón de interés en el centro de un pequeño pozo de plástico. Sumerja el órgano en un compuesto de inclusión de tejido hasta una altura de unos 10 mm.

Coloque inmediatamente los pañuelos en nitrógeno líquido para la congelación instantánea. Para preparar la sección de tejido de ratón, tome el órgano de ratón congelado y descongele a 15 grados centígrados en un criomicrótomo a temperatura controlada. Asegure el tejido en una base de acero con aproximadamente 500 microlitros de compuesto de inclusión de tejido y colóquelo en un soporte de corte de criomicrótomo para que se presente la orientación de corte deseada al cuchillo.

Divida el tejido hasta que tenga un grosor de 12 micras. A continuación, coloque las rodajas de tejido seccionadas en portaobjetos de microscopio de policarbonato y déjelas secar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Obtenga una muestra de célula, como 1 mililitro de suspensión celular HeLa, y agréguela a 9 ml de medio de cultivo celular completo en una placa de cultivo celular estándar de 10 cm.

Mantenga las células en cultivo a 37 grados centígrados, con 5% de CO2 durante dos o tres días, hasta que la superficie de crecimiento esté cubierta al 70-80% en la placa de cultivo celular. Realice el paso de células en la placa de cultivo celular. Para ello, aspire el medio de crecimiento y enjuague las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x.

Retire el PBS con una punta de aspiración estéril e incube las células con 2,5 ml de tripsina durante aproximadamente 5 minutos a 37 grados centígrados para separar las células de la placa de cultivo. Detenga la actividad de la tripsina agregando 7,5 ml de medio de cultivo celular completo y luego resuspenda las células de manera uniforme. Para preparar las muestras de células para una espectrometría de masas de una sola célula, o experimento SCMS, primero coloque portaobjetos individuales de microcubierta en los pocillos de una placa de 12 pocillos.

A continuación, añada 1,8 ml de medio de cultivo celular y 0,2 ml de suspensión celular en el pocillo. Mezcle suavemente las células con una leve agitación de la placa antes de incubar en un entorno con 5% de CO2 a 37 grados centígrados, durante aproximadamente 24 horas. Para realizar el tratamiento farmacológico de las células cultivadas, agregue una solución de compuesto farmacológico en la placa de cultivo celular de 12 pocillos.

Coloque el tubo de cuarzo de doble orificio en un extractor de micropipetas láser y tire de una aguja de cuarzo de doble orificio. Como puntos de partida, establece el calor en 400, el filamento en tres, la velocidad en 80, el retraso en 150 y el tirón en 250. Corte la punta de tracción de modo que queden aproximadamente 5 mm de capilar de cuarzo de doble orificio sin tirar en el otro extremo.

Corte una sección de 80 mm de capilar de sílice fundida como capilar proveedor de solvente. A continuación, inserte el capilar en un orificio en el extremo plano de la aguja de cuarzo de doble orificio. Usando la llama para tirar de un capilar de sílice fundida como emisor de nanoESI, corte a 7-10 mm de largo e insértelo en el otro orificio en el extremo plano de la aguja de cuarzo de doble orificio.

Aplique una cantidad mínima de resina de curado UV en el extremo plano de la aguja de cuarzo de doble orificio. Solidifique la resina con una lámpara LED UV durante aproximadamente 20 segundos, para asegurar el capilar que proporciona solvente y el emisor de nanoESI. A continuación, corte un portaobjetos de vidrio de microscopio estándar por la mitad a lo largo.

A continuación, coloque la sonda única en un extremo del portaobjetos de vidrio, de modo que el emisor nanoESI apunte hacia fuera. Aplique el epoxi regular al cuerpo de la sonda única para que quede asegurado en el portaobjetos de vidrio antes de dejarlo toda la noche para que se endurezca. Este sistema incluye una brida de interfaz de fuente de iones personalizada del espectrómetro de masas y una placa óptica de aluminio que se conecta con un microscopio digital USB, una etapa de traducción XYZ manual en miniatura y el sistema de etapa de traducción XYZ motorizado.

Modifique la brida de la interfaz de la fuente de iones del espectrómetro de masas y fabrique el soporte del microscopio estereoscópico digital como se describe en el protocolo de texto. Conecte el microscopio estereoscópico digital modificado, un microscopio digital USB, una platina de traducción manual XYZ en miniatura con un soporte de abrazadera flexible y el sistema de platina de traslación XYZ motorizado a la placa óptica de aluminio. Utilice el soporte de abrazadera flexible para fijar el portaobjetos de vidrio conectado con una sola sonda.

A continuación, conecte la configuración de una sola sonda al espectrómetro de masas. Ajuste el soporte de abrazadera flexible y la etapa XYZ en miniatura para colocar el emisor de la sonda única frente a la entrada del espectrómetro de masas. Descongele la sección de muestra a temperatura ambiente y colóquela en el sistema de etapa de traducción XYZ motorizado debajo de la sonda única.

Ajuste la posición de la muestra cambiando las coordenadas en el software de control. Utilice una jeringa para bombear el disolvente de muestreo a una velocidad adecuada. Y luego, aplique el voltaje de ionización.

Ajuste la altura de la sonda única para que descanse justo por encima de la superficie de la muestra y pueda realizar la extracción superficial de metabolitos. Levante con cuidado la platina Z y, a continuación, utilice el microscopio digital USB para controlar el cambio de distancia entre la punta de una sola sonda y la superficie del tejido. Establezca los parámetros para el ráster en la sección de interés dentro de la muestra.

Para las secciones de riñón de ratón que se presentan aquí, use una velocidad de trama de 10 micrómetros por segundo y una distancia de 20 micrómetros entre líneas. Establezca los parámetros para el ráster en la sección de interés dentro de la muestra. Para las secciones de riñón de ratón que se presentan aquí, utilice una velocidad de trama de 10,0 micrómetros por segundo y una distancia de 20 micrómetros entre líneas.

Configure un método para la adquisición automatizada de espectros MS desde el espectrómetro de masas. Para MSI de alta resolución de masa en una muestra de riñón de ratón, use una resolución de masa de 60, 000, un modo positivo de 5 kV, 1 microescaneo, tiempo de inyección máximo de 150 milisegundos y control automático de ganancia activado. Inicie la adquisición de datos MSI y, a continuación, construya imágenes MS a partir de archivos MS sin procesar, tal como se describe en el protocolo de texto.

Configure el sistema de sonda única según las instrucciones de MSI y ajuste el caudal de disolvente. Lave las células cultivadas adheridas a los portaobjetos de vidrio de microcubierta con PBS para eliminar los medios de cultivo y los componentes extracelulares del fármaco. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio que contiene células en el sistema de etapa de traslación motorizado XYZ para el experimento.

Enfoque el microscopio estereoscópico digital por encima de la muestra, en la punta de la sonda única para controlar la penetración de la célula durante el análisis. Utilice el microscopio digital USB en el lateral de la sonda única para controlar las condiciones de trabajo del emisor nanoESI en la sonda única. Utilice el programa de control de platina motorizado XYZ y el microscopio estereoscópico digital para localizar una celda de interés y posicionar con precisión la punta de una sola sonda por encima de la muestra.

Inicie la adquisición de datos de MS antes de que la punta de una sola sonda se inserte en la celda. Baje la placa contenedora de la célula para sacar la punta de una sola sonda de la célula. Finalmente, deje que el solvente fluya durante aproximadamente tres minutos, para enjuagar completamente la sonda única.

Se realizaron imágenes de espectrometría de masas ambiental de secciones de riñón de ratón y se pudo detectar una gran cantidad de moléculas presentes en la superficie del tejido. Se trazó la distribución espacial y la abundancia relativa de múltiples moléculas en la superficie del tejido. Se ha logrado una resolución espacial de 8,5 micras mediante la observación de transiciones bruscas de las características presentes en los datos de espectrometría de masas.

La fabricación de la sonda única con una punta afilada y canales abiertos es fundamental para el análisis de una sola célula. Se necesitan microscopios para localizar las células objetivo y controlar el proceso de penetración de las células. El cambio de señal de los espectros de masas también proporciona información adicional para confirmar la penetración de la célula.

Se ha detectado un gran número de moléculas a partir de células individuales vivas. Cuando se usan para estudios de medicamentos contra el cáncer, los experimentos con células de control se usan para mostrar la diferencia del tratamiento con medicamentos contra el cáncer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se fabrica la sonda única y cómo se usa este dispositivo para el análisis de espectrometría de masas de imágenes de espectrometría de masas de células individuales y ambientales de tejidos biológicos.

Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se necesitan instrucciones detalladas para fabricar el dispositivo de una sola sonda, configurar todo el sistema y operar los instrumentos. Una vez dominado, el análisis de una sola célula se puede realizar de forma continua para muchas células. Y cada análisis tarda menos de tres minutos.

Terminar un experimento de imágenes de MS ambiental puede llevar unas horas, dependiendo del tamaño de la muestra, la resolución espacial y el espectrómetro de masas utilizado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la fabricación de una sola sonda de alta calidad es el paso clave. Además, la afinación y el funcionamiento del instrumento son fundamentales para llevar a cabo con éxito un experimento.

Se pueden desarrollar otros métodos siguiendo procedimientos similares a los que aquí se presentan. Por ejemplo, se pueden agregar reactivos al solvente de la muestra y se pueden realizar análisis reactivos de una sola célula y MSI ambiental para mejorar la detección de moléculas de las muestras. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores tanto en el análisis de una sola célula como en los estudios de imágenes de espectrometría de masas en condiciones ambientales.

Esta técnica puede utilizarse potencialmente para la investigación en biología celular, estudios de farmacología y pruebas clínicas. No olvide que trabajar con capilares de cuarzo afilados y epoxi de curado UV puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas de seguridad UV al realizar este procedimiento.