Name: De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a medir fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas vasculares mediante un indicador FRET. Esta técnica permite monitorear directamente los niveles de calcio luminal en respuesta a agentes movilizadores.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud [RP-1.112.666 a CVB &amp; ME].

declaración de la ética: Todos los experimentos y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Bioseguridad en el Laboratorio de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá. 1. Preparación de placas de cultivo de 35 mm con fondo de cristal para Microscopía Confocal basados ​​en FRET <ol><li> Preparar las placas mediante el siguiente procedimiento hr 36-48 antes de los experimentos. </li><li> Recuperar mezcla de proteína gelatinosa elegido y 0,25% de tripsina-EDTA de -20 ° C de almacenamiento y mantenerlos en baño de hielo hasta su uso móvil. NOTA: La mezcla de proteína de recubrimiento sólo debe ser expuesto a la temperatura ambiente durante un breve período de tiempo para evitar que la mezcla se solidifique antes de su uso. solución de tripsina también se debe mantener refrigerado hasta que se necesite; Como alternativa, la tripsina se puede recuperar de almacenamiento -20 ° C después de la finalización de la etapa 1.5. </li><li> Preparar una dilución 1:25 de la mezcla de proteínas: DMEM (sin suero añadido, refrigerada). Transferir volumen apropiado de proteína / mezcla de DMEM a cada placa está preparando. Para placas con fondo de vidrio de 35 mm, añadir aproximadamente 200 l para cubrir completamente el círculo interior de vidrio en la parte inferior de la placa. </li><li> Deja placas para sentarse durante al menos 30 minutos dentro de la cabina de seguridad y a temperatura ambiente. DMEM caliente con 10% de NCS a 37 ° C en un baño de agua durante este período de tiempo. </li><li> tripsina caliente en baño de agua a 37 ° C inmediatamente antes de los próximos pasos. </li><li> Eliminar DMEM que está actualmente en frasco de cultivo usando una pipeta de vidrio y de succión. Lavar piso del matraz con PBS caliente estéril para eliminar cualquier residuo de DMEM. </li><li> Separar las células del músculo liso previamente cultivadas a partir matraz de fondo: NOTA: Frasco se estableció día para este paso para permitir que las células alcanzan la confluencia deseada (aproximadamente 80%) antes de la preparación de placas. Las células se suspendieron inicialmente en el matraz en 20 ml de DMEM con 10% de NCS y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO 2 de alimentación para 24 h, después de lo cual el suministro DMEM fue refrescado y se devolvieron las células para incubadora. DMEM se renovó vísperary 48 horas después de estos pasos iniciales hasta que las células alcanzaron la confluencia. <ol><li> Lavar matraz rápidamente con 1 ml de tripsina y retire 1 ml de tripsina mediante succión. </li><li> Añadir en otro 1 ml de tripsina y se deja durante más tiempo (aproximadamente 30 a 60 sec), silbante matraz para asegurar la enzima entra en contacto con toda la parte inferior del matraz. </li><li> Observe la cantidad de células se han desprendido bajo el microscopio hasta que esté satisfecho con la separación del frasco. silbante solución de tripsina alternativo y comprobar el desprendimiento de células hasta que esté satisfecho con la proporción de células separadas del frasco. NOTA: El matraz puede ser devuelta a la incubadora durante aproximadamente 30 a 60 segundos para acelerar este proceso a 37 ° C. </li><li> Una vez que las células han sido desalojado utilizando tripsina, añadir DMEM fresco con 10% NCS al matraz para detener la reacción de tripsina (volumen suficiente para que la tripsina forma 1/8 del volumen total en el matraz). NOTA: Por ejemplo, cuando se utiliza un matraz de cultivo de 250 ml, estosea ​​7 ml DMEM añadió a 1 ml de tripsina para resultar en 8 ml de solución de células. </li></ol></li><li> Transferencia de solución de células del matraz a un tubo cónico limpia (marcado) 50 ml resultante. </li><li> Añadir 1 ml de DMEM fresco, más del 10% de NCS a cada placa está preparando (medio suficiente para durar 24 horas). </li><li> Invierta suavemente el tubo que contiene la solución de células múltiples veces para romper cualquier sedimento que pueda haberse formado. </li><li> Pipeta de volumen de solución de células se mezcló suavemente en cada placa se desea. NOTA: El número SMC recomendada chapado para este protocolo es 0,5-0,8 x 10 6 por placas de 35 mm de cultivo. Estos números pueden variar dependiendo del tipo de célula y debe ser probado y modificado por cada laboratorio. </li><li> Agitar cada placa de fondo en sentido horario / antihorario para asegurar una distribución equitativa de las células a través de fondo de cristal. </li></ol> 2. Transfección transitoria con adenoviral vector que lleva D1SR Ca 2 + Indicador <ol><li> Después de la adición de míDium y solución de células a cada placa, placas dejan incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 de alimentación durante al menos 1 hora para permitir que las células se unan adecuadamente al vidrio en la parte inferior de platos. Compruebe placas bajo un microscopio a intervalos de 15 min hasta que las células están claramente unidos. </li><li> Recuperar alícuota del adenovirus-D1SR de almacenamiento -80 ° C y mantener en baño de hielo móvil para el transporte de cabina de seguridad biológica. </li><li> Pipeta dosis deseada (multiplicidad de infección de 100) de D1SR refrigerada a cada placa. NOTA: El cálculo para el volumen de solución adenoviral necesario por placa depende de la concentración de virus en la solución madre original, que se presenta como la unidad de formación de placas (PFU). Sobre la base de nuestra experiencia, recomendamos una multiplicidad de infección (MOI) de 100, que se interpreta como las partículas o número de virus necesarios para infectar una célula del músculo liso (SMC) en la placa de cultivo. </li><li> Se incuban las células infectadas a 37 ° C con 5% de CO 2 de suministro de O / N. </li><li> Al día siguiente, reemplazar a las células con 1 ml de DMEM fresco, más del 10% de NCS. </li><li> Incubar las placas en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 3. Medición de la SR Ca 2 + luminal Uso de imagen confocal basado en FRET <ol><li> Después de O / N incubación, se elimina el medio de cultivo de la placa. </li><li> Lavar la placa de cultivo con 1 ml de tampón fisiológico caliente HEPES-PSS que contiene (en mmol·L - 1) NaCl 140, glucosa 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl 2 1,5 y MgCl 2 1 (pH 7,4) tres veces. </li><li> Añadir 1 ml de tampón HEPES caliente-PSS fresco inmediatamente antes del inicio de la grabación. </li><li> Realizará una imagen inicial mediante la aplicación de FRET SE (sensibilizados Emisión) (o una función similar) en el software asociado del microscopio confocal. <ol><li> Una vez que la aplicación está abierta, haga clic en la pestaña &quot;Configuración&quot; para ajustar la configuración para lograr condiciones experimentales deseadas. </li> &lt;li&gt; cambiar manualmente los ajustes de canales para que las células se excitan secuencialmente a 440 nm (para el donante FRET y canales) y 513 nm (para el canal aceptor). Recoger las longitudes de onda de emisión a 488 nm (por donante) y 535 nm (para FRET y aceptor). </li><li> Ajustar la intensidad de la luz en la transmisión del 15%, con un tiempo de exposición de 150 ms excitación de las células (tiempo de grabación para tres donantes secuencial PPC, FRET, y los canales de aceptores YFP) y 10 seg intervalos entre exposiciones. </li></ol></li><li> Estabilizar la placa sobre la platina del microscopio. </li><li> Utilice el botón &quot;vivo&quot; para comprobar la resolución de la imagen. Ajustar la configuración más hasta que se alcanza la resolución deseada. </li><li> Todavía bajo la pestaña &quot;Configuración&quot;, tomar una imagen de la muestra utilizando el botón &quot;Captura de imagen&quot;. </li><li> Pasando a la pestaña &quot;Evaluación&quot;, elegir el método adecuado para calcular la eficiencia de FRET para los experimentos que se realizan. Método 3, utilizando el cálculo Ratiometric [E A (i) = B / A], Se recomienda para los experimentos que implican cameleons como el indicador D1SR. </li><li> Cambiar a la pestaña &quot;Gráfico&quot; para poder observar los valores de intensidad se registran en forma de gráfico durante el experimento. </li><li> Dibujar un retorno de la inversión en el visor de imágenes para observar la intensidad media correspondiente de esta área de interés en la gráfica a medida que avanza experimento. NOTA: El investigador también puede optar por dibujar varias regiones de interés y tienen intensidades correspondientes se registran y se muestran simultáneamente en el gráfico. Como alternativa, los investigadores pueden esbozar una sola retorno de la inversión para el registro inicial, y proceder a esbozar varias regiones de interés en un momento posterior al abrir el archivo de experimento en una versión orientada análisis de datos del software. NOTA: más detalles sobre los pasos necesarios para configurar experimentos basados ​​en FRET se puede encontrar en los manuales de FRET asistente aplicación. Si el microscopio no está equipado con el asistente de FRET, el siguiente protocolo se puede utilizar para configurar los parámetros dela grabación manualmente. </li><li> Iniciar la grabación y permitir la recogida de datos durante al menos 3 minutos para asegurar una grabación basal constante de la señal antes de introducir el agente de interés. </li><li> Introducir Ca 2+ agente -Los que se mueven (por ejemplo, 2 M thapsigargin; 100 nm endotelina-1) como una herramienta para el ozono SR Ca 2 +, pipeteando manualmente la dosis predeterminada directamente en la placa en un lugar lo más cerca a la región de interés ser registrado como sea posible. Continuar la grabación para un tratamiento posterior a la hora deseada. </li><li> radiométrica de captura de imágenes en serie de FRET (512 x 512 píxeles) con un objetivo de inmersión en aceite 63X del microscopio confocal invertido mediante la aplicación de FRET SE. </li><li> Recoger los datos resultantes de las imágenes de un grupo de 5-10 CML en cada región de interés (ROI) y, posteriormente, dar formato y analizar el uso de software basado en estadísticas. <ol><li> Para guardar los datos para su uso posterior, haga clic sobre la traza grabada y elegir la opción &quot;Exportar&quot; para SAVe la hoja de cálculo con intensidades medias de señales grabadas en la unidad elegida por el investigador. </li><li> Normalizar los datos de cada experimento individual dividiendo cada punto de datos por el valor de la intensidad de partida observado en el punto de tiempo 0 seg. </li><li> Importar datos normalizados de las hojas de cálculo en un archivo de proyecto de programa de estadística de copiar y pegar filas de datos relevantes de su original de la hoja de cálculo / seg manualmente. </li><li> generar automáticamente gráficos correspondientes a los conjuntos de datos pegados en el programa. NOTA: Los valores predeterminados del programa generan gráficos de líneas de datos importados. Tipo de gráfico visualizado se puede modificar haciendo clic en el botón &quot;Elegir un tipo diferente de gráfico&quot; bajo el &quot;cambio&quot; de partida se encuentra dentro de la barra de herramientas principal. </li><li> agrupar los datos que representan múltiples ensayos independientes dentro de un grupo más grande de experimentos idénticos en una sola hoja de datos para producir una traza promedio para la prueba específica realizada. </li></ol></li></ol&gt; 4. Preparación de la citoplasmática de Ca2 + Indicador <ol><li> Disolver 0,0125 g de ácido Pluronic (PA) en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo de microcentrífuga negro (puede tener que calentar el tubo en un baño de agua móviles para ayudar a disolver PA). </li><li> Recuperar un tubo (50 g) de la citoplasmática de Ca2 + colorante indicador (Fluo-4 AM) de almacenamiento de -20 ° C. </li><li> Envolver el tubo de tinte en papel de aluminio para protegerlo tanto como sea posible del contacto con la luz. </li><li> Pipetear 45 l de la solución de DMSO + PA en el tubo que contiene el colorante. Envolver solución de DMSO + PA en papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar contenido del tubo a fondo por pipeteo solución arriba y abajo varias veces. Alternativamente, sonicar tubo de teñir de 10 min. NOTA: Cualquiera de los métodos de distribuir a fondo el medio de contraste a través de la solución de DMSO + PA será suficiente; es simplemente una cuestión de preferencia del investigador. Si el investigador decide someter a ultrasonidos solución,se debe hacer en un área aislada / sala donde otros no se verán afectadas por el ruido. Investigador también debe utilizar silenciadores pesados ​​para proteger los oídos. <ol><li> Si sonicating solución, introduzca el tubo envueltas en papel aluminio que contiene el colorante dentro de un contenedor de tubos de espuma y el lugar en el interior del aparato de ultrasonidos 2/3 baño completo (con dH2O). </li><li> Lugar del baño de ultrasonidos en el área aislada / sala de máquinas y la alimentación (garantizar la protección para la cabeza está en su lugar antes de iniciar el proceso de sonicación). Deje espacio y dejar máquina en funcionamiento durante 10 minutos antes de apagarlo y recuperar el tubo (mantener envuelto en papel para proteger de la luz durante el mayor tiempo posible). </li></ol></li><li> Alícuota de la solución ahora completamente mezclada en tubos de microcentrífuga oscuros (5 l por tubo, debe ser capaz de hacer 10 tubos en total). </li><li> Envolver cada tubo alícuota en papel de aluminio. tubos de etiquetas y almacenar en condiciones desecante a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 5. Medición de citoplasmática de Ca2 + <ol><li> Siga los pasos de 1/1 a 1/12 para preparar placas de cultivo de SMC de aorta de rata. </li><li> Retire el medio de cultivo de la placa a 48 horas después de la cultura. </li><li> Retire la alícuota previamente preparada de citoplasmática indicador de Ca 2+ (5 l) de almacenamiento de -20 ° C y se mantiene en el baño de hielo hasta su uso móvil. </li><li> Lavar la placa de cultivo con 1 ml de tampón fisiológico caliente HEPES-PSS que contiene (en mmol·L - 1) NaCl 140, glucosa 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl 2 1,5 y MgCl 2 1 (pH 7,4) tres veces. </li><li> Mezclar el indicador con 1 ml de HEPES caliente-PSS y cargarlo en la placa de cultivo. </li><li> Incubar SMCs con el indicador durante 1 hora a RT (24 ° C). </li><li> Retire el indicador de placa de cultivo y se lava con 1 ml cálidos fisiológicas HEPES-PSS tampón tres veces. </li><li> Añadir 1 ml de tampón HEPES caliente-PSS fresco inmediatamente antes del inicio de la grabación. </li><li> Capturar imágenes en serie (512 x 512 píxeles) con una o 63Xobjetivo il-inmersión del microscopio confocal invertido. <ol><li> cambiar manualmente la configuración de modo que las células se excitan a 488 nm, y las longitudes de onda de emisión se recogen a 555 nm con una velocidad de barrido de 700 Hz. </li><li> Ajustar la intensidad de la luz en la transmisión del 15%, con 150 ms de tiempo de exposición excitación de las células (la cantidad de tiempo que las células están expuestas a la luz, a intervalos de tiempo designados durante la grabación) y de intervalos de 5 segundos entre las exposiciones. </li></ol></li><li> Estabilizar la placa sobre la platina del microscopio y empezar a grabar. </li><li> Record durante al menos 3 minutos para asegurar una grabación basal constante de la señal antes de introducir el agente de interés. </li><li> Introducir Ca2 + agente -Los que se mueven (por ejemplo, 2 micras thapsigargina) como herramienta para el ozono SR Ca2 + (tal como se describe en el paso 3.16) y continuar la grabación de la cantidad deseada de tiempo posterior al tratamiento. </li><li> la intensidad de señal de grabación utilizando un software específico-microscopio de fluorescencia promediando SIertas señales (F / F 0) de un grupo de 5 a 10 SMCs en cada región de interés (ROI). Recoger, formatear y analizar los datos resultantes de las imágenes utilizando el software de análisis de datos. Consulte los pasos 3.18.1-3.18.5 para la descripción de la recogida y análisis de datos utilizando este software. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo describe la transfección de CMLV con el adenovirus D1SR para estudiar las concentraciones de Ca2 + en el lumen de la SR. Este método permite la medición directa de Ca 2+ dentro de este orgánulo, así como su movimiento en / fuera de la SR como resultado de la aplicación de diferentes agentes de calcio en movimiento. Este método tiene muchas ventajas para los investigadores que trabajan hacia una comprensión global de cómo los cambios en los niveles de SR y citoplásmicos Ca 2+</su...

Ca 2 + es un ion muy importante que se encuentra en abundancia dentro de cada célula en el cuerpo. Tiene un papel importante en muchos diferentes funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferación, la migración y apoptosis 1-4. Está bien establecido que el Ca 2+ puede afectar a estos procesos a través de ambas acciones directas e indirectas, y por lo tanto, los cambios en las concentraciones intracelulares normales de este ion puede dar lugar fácilmente a resultados negativos para las células afectadas. La SR se considera como el más grande 2+ tienda intracelular de Ca en la célula 5. Niveles de estado estacionario de Ca2 +, tanto en el SR y el citoplasma normalmente se mantienen a través de un flujo constante dentro y fuera de los canales de Ca2 + -transporting de este orgánulo. Las condiciones de estrés impuestas a las células debido a cualquier tipo de lesión o enfermedad se asocian con cambios significativos en la SR Ca2 + que pasan a tener efectos duraderos en la queALTH de la célula. En el más grave de los casos, la incapacidad de una célula subrayado para recuperar y mantener Ca SR estado estacionario 2+ niveles incluso pueden culminar en la muerte por apoptosis 6-8. La investigación actual en celulares Ca 2+ dinámica está limitada por el hecho de que pocos estudios orgánulo prueba de Ca 2+ del contenido del almacén directamente 9-11. La práctica más común en cambio consiste en la medición de los niveles de Ca2 + citoplasmáticos como mediciones indirectas de los cambios en el contenido de SR Ca2 + 12-14. En estos experimentos, Ca 2+ se induce comúnmente para ser liberado de la SR a través del uso de agentes farmacológicos que causan el agotamiento de los orgánulos (por ejemplo, thapsigargin). Conclusiones son extraídas con respecto a los cambios SR Ca2 + en base a las fluctuaciones en las concentraciones de Ca 2+ citoplásmicos. A pesar de la capacidad restante para los investigadores extraer las conclusiones en una rotonda manner, este método de medición SR Ca2 + es claramente una forma indirecta de recoger dicha información, con muchas limitaciones relativas a la interpretación de los datos recogidos. Con el fin de evitar esta restricción clara, es necesario medir la cantidad de Ca 2+ se encuentra directamente dentro de la red luminal SR. Vital para el resultado final de ser capaz de grabar directamente SR niveles intraluminales de Ca2 + son las herramientas de cultivo celular y el indicador de Ca 2+ utilizado. Para los datos de referencia en el manuscrito actual, es importante señalar que CMLV utilizados procedían de una línea celular congelada. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternero recién nacido (NCS) sobre pasajes 22-26 para los experimentos descritos, se incubaron a una constante de 37 ° C con 5% de CO 2 de suministro. Utilizando el método actual, por ejemplo, las células han sido cultivadas con mucho éxito en una mezcla de proteínas que simula el extracelularentorno de muchos tipos diferentes de tejidos 15. Importante para el éxito a lo largo de la vena de la SR Ca 2+ investigación es el tipo de mezcla de proteína utilizada; en este caso, una variedad bajo factor de crecimiento era necesario para evitar componentes de esta herramienta de afectar a la señalización normal de Ca2 + y movimientos que se producen constantemente dentro de las células de la prueba. Tras el crecimiento con éxito de células de ensayo, el indicador de Ca 2 + también se debe introducir de manera efectiva a estas células cultivadas. Esto ha sido posible mediante el uso de un vector adenoviral que lleva el SR-residente Ca 2+ D1SR indicador. Para lograr una alta eficiencia de la transfección, las células deben ser incubadas con vectores virales durante al menos 36 a 48 horas antes de la formación de imágenes. Esta preparación proporciona una herramienta fiable para medir Ca 2 + transitorios dentro de la luz SR con alta precisión y reproducibilidad. D1SR indicador utilizado en este protocolo es una variante modificada del D1ER Ca2 + indicator que fue creado originalmente por el laboratorio del Dr. Roger Y. Tsien en la Universidad de California, San Diego, EE.UU. 9,16. El D1ER original, pertenece a una segunda generación de codificados genéticamente Ca 2+ indicadores llamados cameleons que muestran sensibilidades Ca 2 + a través de una gama mucho más amplia (0,5 a 160 mM) en comparación con anteriores Ca 2+ indicadores 9,16. La nueva variante D1SR, una especie de regalo del Dr. Wayne Chen (Universidad de Alberta, Canadá), sin embargo, lleva una secuencia mutante calsecuestrina (en lugar de una secuencia calreticulina como en el D1ER original). El calsecuestrina mutante tiene una reducida unión a Ca2 + que elimina el problema de competir con calsecuestrina endógena en la unión a Ca2 + dentro del lumen 11 SR. El indicador D1SR lleva una proteína fluorescente cian truncada mejorado (CFP) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) que se unen por una proteína de unión que contiene calmodulina modificado (CaM) y M13 (tél péptido de 26 restos de la miosina de cadena ligera quinasa que se une a secuencias CAM). La secuencia de CaM-M13 ha sido modificado para evitar M13 de la unión a calmodulina endógeno. Además, para asegurar la retención de SR, una secuencia calsecuestrina se ha añadido en el extremo 5 &#39;de la PPC 11. Cuando se une a Ca 2 +, el dominio CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales que resultan en un aumento en la transferencia de energía entre la PPC y que flanquean YFP, que se registra como un aumento en la intensidad de la señal de FRET. Por otro lado, cuando la concentración de SR Ca 2 + luminal gotas, el dominio de CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales inversa, lo que resulta en una disminución en la transferencia de energía entre la PPC y YFP flanqueantes, y una caída significativa en la intensidad de la señal FRET .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (alta glucosa, piruvato)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Warm in 37 &deg; C Baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Matrigel Membrana Basal Matriz Factor de Crecimiento Reducido, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Mantener a -20 &deg; C hasta justo antes de usar</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Keep at -20 &deg; C hasta justo antes</td></tr><tr><td>de usar placas con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &mu; Matraz de tapón con tapón de sellado azul ventilado</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA Soluciones</td><td>Tecnologías de vida</td><td>25200056</td><td>Mantener a -20 & grados; C hasta justo antes de usar</td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Regalo</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Mantener a -20 &deg; C hasta justo antes</td></tr><tr><td>de usar 1,5 ml Tubos de microcentrífuga negros</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (con aplicación FRET SE Wizard)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas uso de fret a base de

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

El mantenimiento de los niveles de calcio (Ca2+) en estado estacionario en el retículo sarcoplásmico (SR) de las células del músculo liso vascular (VSMCs) es vital para su salud general. Una parte significativa del contenido intracelular de Ca2+ se encuentra dentro de las reservas de SR en los VSMC. Como el único orgánulo intracelular con una asociación cercana con el espacio extracelular circundante a través de las uniones membrana plasmática-SR, se puede considerar que el SR constituye la primera línea de respuesta a cualquier irregularidad en los transitorios de Ca2+ o estrés experimentado por la célula. Entre sus muchas funciones, una de las más importantes es su papel en la transmisión de señales reguladas por Ca2+ a través de la célula para inducir más reacciones posteriores en toda la célula. El uso más común de los indicadores citoplasmáticos de Ca2+ en este sentido es en general insuficiente para la investigación de los cambios altamente dinámicos en el almacenamiento intraluminal de Ca2+ SR que aún no se han caracterizado completamente. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la medición directa y clara de luminal SRCa 2+. Esta herramienta es útil para la investigación de los cambios matizados en SR Ca2+ que tienen efectos posteriores significativos en la función normal y la salud de la célula. Las fluctuaciones en el contenido de SR Ca2+ específicamente pueden proporcionarnos una cantidad significativa de información relacionada con las respuestas celulares a las enfermedades o condiciones de estrés experimentadas por la célula. En este método, se utiliza una versión modificada de un indicador de Ca2+ dirigido a SR, D1SR, para detectar fluctuaciones de Ca2+ en respuesta a la introducción de agentes en células de músculo liso aórtico (SMC) cultivadas en ratas. Después de la incubación con el indicador D1SR, se utilizan microscopía de fluorescencia confocal e imágenes basadas en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para observar directamente los cambios en los niveles intraluminales de SRCa 2+ en condiciones de control y con la adición de agentes agonistas que funcionan para inducir el movimiento intracelular de Ca2+.

Esta sección proporciona ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el método descrito para capturar Ca 2+ datos de concentración luminal SR, en comparación con la forma comúnmente empleado para medir indirectamente cambios a orgánulos Ca 2+ concentraciones de tienda mediante la observación de las fluctuaciones en citoplasmática de Ca2 + . La Figura 1A...

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

El objetivo general de esta técnica de imagen es monitorear las fluctuaciones en los niveles de calcio en el lumen del retículo sarcoplásmico en respuesta a agentes movilizadores de calcio, específicamente en células de músculo liso vascular. Este método puede ser útil para elucidar el ciclo celular del calcio de una manera más directa. Por ejemplo, es muy importante conocer la relación entre nuestro transporte de calcio en el retículo sarcoplásmico y el estrés del retículo endoplásmico.La ventaja de esta técnica es que podemos medir directamente el calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico, en lugar de tener que extrapolarlo a partir de mediciones indirectas de los cambios en el citoplasma. Esta técnica será demostrada por Gabriela Ziomek, quien es estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una dilución de uno a 25 de la mezcla de proteínas en DMEM.A continuación, transfiera 200 microlitros de la mezcla de proteínas DMEM a cada placa de vidrio de fondo de 35 milímetros para cubrir completamente el círculo interno de vidrio inferior. Deje las placas a temperatura ambiente dentro del gabinete de seguridad durante al menos 30 minutos.

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La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Se describe aquí un método para medir directamente las chispas de calcio, las unidades elementales de la liberación de Ca2 + desde el retículo sarcoplásmico en las fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica estrés mediada por activación de Ca 2 + liberación del receptor de rianodina en fibras musculares aisladas. La dinámica y la capacidad homeostática del Ca2 + intracelular de señalización pueden emplearse para evaluar la función muscular en la salud y la enfermedad.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

Aquí presentamos técnicas para obtener imágenes de eventos locales de Ca2+ mediados por IP3 utilizando microscopía de fluorescencia en células de mamíferos intactas cargadas con indicadores de Ca2+ junto con un algoritmo que automatiza la identificación y el análisis de estos eventos.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca2 + reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .

Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor de Captura<supUnesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org</sup

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

El protocolo describe el método de carga de un tinte de calcio fluorescente a través del nervio cortado en las terminales nerviosas motoras del ratón. Además, se presenta un método único para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas mediante microscopía confocal.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Aprende a medir fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas vasculares mediante un indicador FRET. Esta técnica permite monitorear directamente los niveles de calcio luminal en respuesta a agentes movilizadores.

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