De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

El objetivo general de esta técnica de imagen es monitorear las fluctuaciones en los niveles de calcio en el lumen del retículo sarcoplásmico en respuesta a agentes movilizadores de calcio, específicamente en células de músculo liso vascular. Este método puede ser útil para elucidar el ciclo celular del calcio de una manera más directa. Por ejemplo, es muy importante conocer la relación entre nuestro transporte de calcio en el retículo sarcoplásmico y el estrés del retículo endoplásmico.

La ventaja de esta técnica es que podemos medir directamente el calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico, en lugar de tener que extrapolarlo a partir de mediciones indirectas de los cambios en el citoplasma. Esta técnica será demostrada por Gabriela Ziomek, quien es estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una dilución de uno a 25 de la mezcla de proteínas en DMEM.

A continuación, transfiera 200 microlitros de la mezcla de proteínas DMEM a cada placa de vidrio de fondo de 35 milímetros para cubrir completamente el círculo interno de vidrio inferior. Deje las placas a temperatura ambiente dentro del gabinete de seguridad durante al menos 30 minutos. Mientras tanto, caliente el DMEM con 10 por ciento de NCS a 37 grados Celsius en un baño de agua.

Posteriormente, retire el DMEM del frasco de cultivo utilizando una pipeta de vidrio. A continuación, lave el fondo del frasco con PBS estéril tibio para eliminar los restos residuales de DMEM. Para desprender las células musculares lisas cultivadas del fondo del frasco, lave el frasco rápidamente con un mililitro de tripsina y luego elimine esta solución.

Luego, agregue otro mililitro de tripsina. Agite el matraz durante aproximadamente 30 a 60 segundos para asegurarse de que la enzima entre en contacto con toda la superficie inferior del matraz antes de retirarlo. Una vez que las células hayan sido desprendidas con tripsina, agregue DMEM fresco con 10 por ciento de suero de ternera normal al matraz para detener la reacción de la tripsina.

Transfiera la solución celular resultante del matraz a un tubo cónico limpio de 50 mililitros, etiquetado. Luego, agregue un mililitro de DMEM fresco más 10 por ciento de NCS a cada placa que se esté preparando. Después, invierta suavemente el tubo que contiene la solución celular varias veces para deshacer cualquier precipitado que pueda haberse formado.

Pipetee el volumen deseado de la solución celular mezclada suavemente en cada placa. Posteriormente, agite cada placa completamente en sentido horario o antihorario para asegurar una distribución uniforme de las células sobre el vidrio en la parte inferior. Es necesario añadir suficientes células a la placa para garantizar que alcancen una confluencia suficientemente alta durante las próximas 48 horas para obtener una imagen efectiva.

Después de añadir el medio y la solución celular a cada placa, incubar las placas a 37 grados Celsius con cinco por ciento de dióxido de carbono durante al menos una hora para permitir que las células se adhieran adecuadamente al fondo de vidrio. Verificar las placas bajo un microscopio a intervalos de quince minutos hasta que las células estén claramente adheridas. Luego, retirar el alícuota de Adenavirus D uno SR del almacenamiento a menos 80 grados Celsius y transportarlo a la cabina de seguridad biológica en un baño de hielo móvil. Posteriormente.

Pipetee la dosis deseada de D one SR frío en cada placa e incube las células infectadas a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reponga el medio con un mililitro de DMEM fresco más diez por ciento de NCS. Posteriormente, incube las placas en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con cinco por ciento de dióxido de carbono durante la noche.

Tras la incubación nocturna, retire el medio de cultivo de la placa. Lave la placa de cultivo tres veces con un mililitro de tampón fisiológico tibio HEPES-PSS. A continuación, agregue inmediatamente un mililitro de tampón HEPES-PSS tibio y fresco antes de comenzar la grabación.

Realice imágenes iniciales utilizando la aplicación FRET SE abriendo el software asociado al microscopio confocal. Una vez abierta la aplicación, haga clic en la pestaña de configuración para ajustar los parámetros experimentales deseados. Cambie manualmente la configuración de los canales para que las células sean excitadas secuencialmente a 440 nanómetros para el donador y FRET y a 513 nanómetros para el aceptor.

Luego, ajuste las longitudes de onda de emisión a 488 nanómetros para el donador y a 535 nanómetros para la transferencia de resonancia de energía de tipo Förster (FRET) y el aceptor. Posteriormente, establezca la intensidad de luz al 15 por ciento de transmisión, con un tiempo de exposición de excitación de 150 milisegundos para las células y intervalos de 10 segundos entre exposiciones. A continuación, estabilice la placa sobre la platina del microscopio.

Utilice el botón en vivo para verificar la resolución de la imagen. Ajuste aún más la configuración para obtener la resolución deseada. En la pestaña de configuración, tome una imagen de la muestra utilizando el botón capturar imagen.

Ahora, al pasar a la pestaña de evaluación, elija el método apropiado para calcular las eficiencias de FRET para los experimentos que se están realizando. Se recomienda el método tres, que utiliza el cálculo ratiométrico, para experimentos que involucran Cameleones como el indicador D uno SR. Después, cambie a la pestaña de gráfica para observar los valores de intensidad registrados en una gráfica.

Si se desea, dibuje un ROI en el visor de imágenes para observar la intensidad promedio correspondiente de esta área de interés en la gráfica. Comience la grabación para recopilar los datos durante al menos tres minutos, a fin de asegurar una señal estable de línea base antes de introducir el agente de interés. Luego, introduzca un agente movilizador de calcio como herramienta para agotar el calcio del retículo sarcoplasmático, aplicándolo directamente en la placa cerca de la región de interés que se está registrando.

Continúe la grabación durante la duración deseada después del tratamiento. Posteriormente, capture las imágenes seriadas de FRET con relación de intensidades mediante un microscopio confocal invertido utilizando la aplicación FRET SE. En este paso, para preparar las placas de cultivo de células musculares lisas aórticas de rata, lave la placa de cultivo tres veces con un mililitro de tampón fisiológico tibio HEPES-PSS.

Luego, mezcle el indicador con un mililitro de HEPES-PSS tibio y añádalo a las placas de cultivo. Incube las células de músculo liso con el indicador durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, retire el indicador de la placa de cultivo y lávelo con un mililitro de tampón fisiológico de HEPES-PSS tibio tres veces.

Luego, agregue un mililitro de tampón HEPES-PSS tibio y fresco inmediatamente antes de comenzar la grabación. Capture imágenes en serie con el microscopio confocal invertido. Posteriormente, introduzca el agente movilizador de calcio como herramienta para agotar el calcio del retículo sarcoplásmico y continúe la grabación durante el tiempo deseado después del tratamiento.

Se muestran aquí instantáneas representativas de una célula muscular lisa transfectada con el indicador D uno SR utilizando filtros de paso de banda para CFP, FRET y YFP. Esta figura muestra instantáneas en pseudocolor en tiempo real de células musculares lisas aórticas de rata en cultivo, transfectadas con D uno SR. El tratamiento con dos micromoles de tapsigargina mostró una disminución en la intensidad de la señal, lo que indicó una caída significativa en el contenido de calcio del retículo sarcoplásmico debido a la liberación de calcio inducida por tapsigargina. Y este gráfico muestra el trazado representativo de la relación D uno SR normalizada en las células musculares lisas en cultivo tratadas con dos micromoles de tapsigargina, lo que confirmó una disminución significativa en el calcio del retículo sarcoplásmico.

A continuación se muestran imágenes representativas de células musculares lisas aórticas de rata en cultivo, cargadas con un indicador de calcio citoplasmático y tratadas con dos micromoles de tapsigargina. Como se observa, la tapsigargina provoca un aumento significativo en la intensidad de la señal dentro del citoplasma debido a la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico. Y este gráfico muestra un trazo representativo de la relación normalizada de Fluo cuatro AM en las células musculares lisas en cultivo tratadas con dos micromoles de tapsigargina. Se considera que el aumento representado en la señal de calcio es proporcional a la cantidad de calcio liberada desde el retículo sarcoplásmico. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 48 horas desde el inicio hasta el final, si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en las condiciones descritas para asegurar su salud antes de la transfección con el indicador de calcio. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo preparar células cultivadas para permitir la medición de los niveles de calcio en el retículo sarcoplásmico utilizando el indicador D one SR.