Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

El objetivo general de este procedimiento es manipular el impacto de las entradas sinápticas del procesamiento neuronal mediante inyecciones microiontoforéticas de sustancias neuroactivas en animales despiertos. Este método puede ayudar a desentrañar funcionalidades clave utilizando sistemas sensoriales, como el papel de los neurotransmisores y su interacción en los estímulos sensoriales y la codificación. La principal ventaja de esta técnica es que permite la manipulación de las entradas sináticas locales a la pestaña y el estudio de los sistemas moduladores neuronales sin verse afectado por la anestesia.

Aunque este pródigo estaba aquí en ratones restringidos, también se puede usar en otros mamíferos como murciélagos, ratas o conejillos de indias. Para comenzar este procedimiento, coloque los alambres de tungsteno en una herramienta de alineación personalizada para cortar. Fije con cuidado los extremos sueltos de los cables con cinta adhesiva y córtelos a la longitud deseada.

A continuación, tire de la cinta suavemente para quitar los cables de tungsteno de la herramienta de alineación. Asegurándose de que todos los cables permanezcan unidos a la cinta. Luego, enrolle la cinta sobre un eje de latón pulido y sostenga los cables firmemente contra el eje para que haya una buena conexión eléctrica.

Después de eso, conecte el husillo a un motor de 5 RPM en la estación de trabajo. El acceso al husillo tiene un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie de la solución de grabado. Posteriormente, sumerja un tercio de los cables en la solución.

A continuación, sumerja un electrodo de varilla de carbono en el baño de grabado para cerrar el circuito. Encienda la estación de trabajo para que el husillo comience a girar, luego ajuste la corriente que pasa a través de los electrodos y la solución de grabado a 250 miliamperios. Detenga el grabado de la punta cuando la corriente baje a 200 miliamperios para grabar las puntas de los cables en puntos muy finos.

Ahora, coloque un alambre en un capilar de vidrio de borosilicato con su extremo inferior bloqueado con arcilla para modelar. Sujete la pipeta con un serpentín calefactor y un émbolo suspendido. Asegure el alambre cubierto de vidrio a un portaobjetos antes de colocarlo debajo del microscopio.

Coloque la punta y toque su cuenta bórica en foco. Luego calienta la cuenta hasta que se derrita un poco. Después de eso, inserte alrededor de 10 a 15 micras de la punta del cable y apague los potenciómetros de calentamiento.

A medida que la cuenta se enfría, retire el vidrio de la punta del electrodo para exponer el tungsteno. Para obtener una punta de unos 15 milímetros, ajuste el polar a los parámetros adecuados. Tire del capilar para obtener dos pipetas con la punta apartada.

Monta una pipeta de pértiga en un portaobjetos con arcilla para modelar y rompe su punta con unas tijeras finas, pinzas o el lado plano de un bisturí. Ajuste ligeramente el ángulo entre el electrodo y el multicañón para obtener una mejor unión y un conjunto más delgado. Bajo el microscopio, alinee cuidadosamente el electrodo de tungsteno sobre la punta de varios barriles.

Una vez alineado, baje el electrodo hasta que entre en contacto con el multi-barril. Encajando en la ranura entre los dos barriles superiores, deslice la punta del electrodo hasta que sobresalga de 15 a 20 micrómetros de la punta del multibarril. Ahora aplique una pequeña gota de adhesivo curable con luz sobre el tungsteno y el conjunto de varios barriles a unos 5 milímetros de distancia de sus puntas.

Evite que el pegamento llegue a las puntas para evitar bloquear los canales de varios barriles y cure el pegamento con una lámpara LED de luz azul Ahora, coloque al animal anestesiado sobre una manta térmica para mantener su temperatura a 38 grados centígrados y estabilice la cabeza del animal en un marco estereotáxico con dos barras para los oídos y una barra de mordida Luego aplique gel oftálmico para proteger los ojos. A continuación, afeita el cuero cabelludo y aplica povidona yodada para desinfectar la piel. Con un bisturí, haga una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraer el perastio que cubre el peridal y la parte más rostral de los huesos occipitales.

A continuación, aplique una capa delgada de adhesivo fotopolimerizable en el cráneo y la base del poste de la cabeza. Espere 10 segundos y coloque el poste de la cabeza sobre el área rostral de los huesos parietales a lo largo de la línea media. Utilice una fuente de luz azul para curar el adhesivo durante 20 segundos y obtener una fuerza de unión efectiva.

Posteriormente, taladre dos agujeros alrededor y detrás de la base del poste principal con una broca pequeña. Coloque un tornillo de reloj en un orificio perforado para que sirva como punto de contacto adicional entre el cráneo y la etapa de la cabeza. Haga una vuelta y media para ajustar los tornillos y pruebe con pinzas para asegurarse de que no estén sueltos.

Luego, inserte la punta del cable de tierra plateado en el tercer orificio y asegúrese de que entre en contacto con la duramadre. Aplica una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato resistente al agua para unir el alambre al cráneo. A continuación, aplique un compuesto fotopolimerizable para reforzar la unión del poste de la cabeza con el cráneo cubriendo la base del poste de la cabeza, la parte inferior del alambre de plata y los tornillos.

Tenga cuidado de no extenderse más allá de lambda para permitir el acceso durante la grabación y curar el compuesto con una fuente de luz azul. Luego, retrae el músculo en la parte posterior del cuello cerca de su inserción en el cráneo. Con una trépano pequeña, perfore una ventana redonda justo debajo de la sutura lambda y lateral a la línea media para exponer el colículo inferior.

En este procedimiento, coloque el cuerpo del animal en un sujetador acolchado de espuma hecho a medida. Asegure el poste de la cabeza a un soporte conectado al marco estereotáxico. Este es un buen momento para darle al animal una recompensa líquida.

A continuación, cubra el cuerpo del animal con una manta de algodón y asegúrelo sin apretar con un hemicilindro de plástico y cinta adhesiva. Utilice una jeringa con punta flexible para llenar los barriles con los medicamentos elegidos. Con el micromanipulador, coloque el electrodo de barril múltiple en su soporte.

A continuación, coloque un alambre de plata sin codificar dentro de cada barril para que un extremo entre en contacto con la solución y el otro extremo sea accesible. A continuación, conecte esos extremos al dispositivo de microiontoforesis. Después de eso, conecte el terminal positivo al extremo del electrodo de tungsteno y el terminal de tierra al cable de plata que entra en contacto con la duramadre.

Posteriormente, mueva el electrodo de barril múltiple hasta que la punta entre en contacto con la superficie del cerebro. Aplique solución salina estéril tibia para prevenir la desecación del tejido cerebral. En ese punto, aplique corriente de retención para evitar fugas de medicamento por la punta del cañón mientras busca la actividad de una sola unidad.

Registre la actividad neuronal y la aplicación iontoforética de gabazina. Aquí se muestra el área de respuesta de frecuencia de cuatro neuronas registradas en el colículo inferior antes y durante la inyección microiontoforética de gabazina. Las cruces negras indican que las frecuencias elegidas para ser presentadas como sonidos raros y repetitivos.

Aquí, se muestran los histogramas de tiempo periestímulo acumulados de la respuesta neuronal a todas las frecuencias e intensidades presentadas para construir el área de respuesta antes y durante la inyección de gabazina. Las barras negras indican la duración del sonido. Aquí están los rásteres de puntos de la respuesta de pico a un par de frecuencias presentadas como raras en rojo y estímulos repetitivos en azul antes y durante la aplicación de gabazina.

El fondo sombreado indica la duración del estímulo. Estos rásteres de puntos muestran las respuestas cuando se intercambiaron las probabilidades relativas de las parafrecuencias. Este gráfico muestra las respuestas de una sola neurona a siete pares de frecuencias presentadas como el sonido raro y repetitivo antes y durante la aplicación de gabazina.

Y este gráfico, muestra los índices SSA de la respuesta neuronal a sonidos raros y repetitivos medidos antes y durante la aplicación de gabazina. Una vez dominado, el procedimiento descrito permite el ajuste de los parámetros específicos según la estructura neuronal y el tipo de neurona de interés. Al intentar grabar animales con sujetadores de cabeza, es fundamental recordar que los tiempos de grabación están determinados y limitados por el nivel de habituación del animal, pero una ventaja importante es que se pueden realizar múltiples incisiones de registro en el mismo animal durante varios días, minimizando el número de animales utilizados.

Al realizar la microiontoforética utilizando electrodos superpuestos, se pueden combinar otros procedimientos, como inyecciones de transistores neuronales, para responder a preguntas adicionales, como la fuente de entradas y el objetivo de proyección de las neuronas dentro del sitio de grabación. Un tema crítico cuando se trabaja con animales despiertos es su bienestar, así que nunca exceda la cantidad de tiempo de recuerdo aprobado en su protocolo y monitoree constantemente para verificar cualquier signo de malestar. Si es así, debe detener la grabación inmediatamente.