Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

El objetivo general de este experimento es etiquetar y aislar las neuronas nodosas que inervan las vías respiratorias del nervio vago. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Neurobiología Periférica. Por ejemplo, ¿qué propiedades identificatorias poseen las neuronas que inervan las vías respiratorias?

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método robusto y de alto rendimiento para dirigirse a poblaciones neuronales específicas y aislarlas. Después de recolectar los ganglios sensoriales, aspire 500 microlitros de solución de disociación de ganglios de cada tubo, sin perturbar los ganglios. A continuación, agregue un mililitro de PBS a cada muestra y espere a que los ganglios sedimenten en el fondo de los tubos.

Luego, retire el PBS y agregue un mililitro de solución de disociación de ganglios suplementada con enzima de digestión a las neuronas, seguido por la adición de 20 microlitros de Azul Rápido al tubo de control positivo. Incube los tubos a 37 grados Celsius durante el tiempo adecuado según la edad de la enzima de digestión. Agite y golpee brevemente los tubos cada 15 minutos para asegurar que los ganglios estén cubiertos por la solución de digestión.

Mientras las células nerviosas están siendo digeridas, agregue lenta y cuidadosamente 400 microlitros de solución recién preparada al 12 % de densidad sobre 400 microlitros de solución al 28 % de densidad en un tubo de 1,5 mililitros por muestra. Deben ser visibles dos capas distintas, una más oscura que la otra. A continuación, etiquete tubos de recolección de 1,5 mililitros para el ordenamiento, incluyendo un tubo positivo para Fast Blue y un tubo negativo para Fast Blue por muestra de clasificación.

Al final del período de digestión, deseche la enzima de digestión y lave los ganglios dos veces con un mililitro de PBS, como se acaba de demostrar. Después del segundo lavado, añada 200 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios a cada tubo. Luego, utilizando una pipeta de 200 microlitros ajustada a un volumen de 100 microlitros, aspire y expulse los ganglios varias veces para disociar las células en una suspensión individual, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas.

Cuando no sean visibles fragmentos de tejido intactos, sosteniendo firmemente un colador celular de 70 micrones en una mano, pipetee la solución celular disociada hacia el centro del colador. Luego, lave el tubo de disociación con 100 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios para recoger cualquier célula adicional. Filtre el lavado a través del colador y use una nueva punta de pipeta para aspirar cualquier solución restante que contenga células en la parte inferior del colador, añadiéndola a la suspensión celular.

Ahora, coloque cuidadosamente los 300 microlitros de células sobre el gradiente de densidad previamente preparado. Y recolecte las células ganglionares mediante centrifugación. Mientras las células están centrifugándose, agregue 300 microlitros de tampón de lisis recién preparado al tubo de recolección Fast Blue positivo y 600 microlitros de tampón de lisis al tubo de recolección negativo para asegurar que el fluido de la boquilla de ordenación no diluya significativamente el tampón de lisis.

Al finalizar la centrifugación, retire cuidadosamente los 700 microlitros superiores de la solución que contienen la mayor parte de los restos celulares. Luego, mezcle 700 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios con las células restantes. Pelote las células mediante centrifugación y deseche cuidadosamente el sobrenadante.

Luego, re-suspenda las células en 200 a 300 microlitros de solución de disociación para clasificación de ganglios utilizando una pipeta de 1,000 microlitros ajustada a 200 microlitros. Coloque las células en hielo hasta que estén listas para la clasificación. Después de purificar las células de los ganglios mediante FACS, homogenice las neuronas en tampón de lisis durante un minuto mediante vortex.

A continuación, mezcle las células varias veces con un volumen de etanol al 70 % y transfiera hasta 700 microlitros de la muestra a una columna de centrifugación. Centrifugue la columna durante 15 segundos a 8.000 × g en una microcentrífuga y deseche el filtrado. Una vez que toda la muestra haya pasado a través de la columna de centrifugación, extraiga el ARN según los protocolos estándar de purificación de ARN.

Luego, utilice un sistema de electroforesis microfluídico para evaluar la calidad del ARN según las especificaciones del fabricante. En estos gráficos, se muestran los controles negativo y positivo de Fast Blue utilizados para establecer las compuertas de clasificación. Las células del ganglio nodoso disociadas y marcadas con Fast Blue pueden entonces clasificarse en poblaciones positivas y negativas para Fast Blue.

La eficiencia de clasificación para este método es del 73 al 85 %, con aproximadamente 1.500 o menos células positivas para Fast Blue y casi 60.000 células negativas para Fast Blue recolectadas en promedio. Como se observó en esta muestra representativa, los picos 18S y 28S obtenidos mediante electroforesis microfluídica pueden utilizarse entonces para calcular el número de integridad del ARN y determinar la calidad del ARN extraído. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro horas y media si se realiza adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar avanzar rápidamente a través de los pasos y utilizar soluciones recién preparadas para la extracción de ARN. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el cultivo neuronal para responder preguntas adicionales, como qué propiedades funcionales son únicas de las neuronas que inervan las vías respiratorias. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Neurobiología Periférica exploraran las propiedades únicas de una población específica de neuronas que inervan las vías respiratorias en los ganglios nodosos del nervio vago.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y disociar neuronas específicas de los ganglios nodosos, las cuales pueden utilizarse luego para secuenciación de ARN o sembrarse para estudios funcionales. No olvide que trabajar con 2-mercaptoetanol puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar en una campana extractora de gases al manipular este compuesto.