Name: Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a etiquetar y aislar neuronas nodosas que inervan vías aéreas en ratones mediante trazado con Fast Blue y disociación de ganglios. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Apoyado por el NIH subvención R01HL105635 de la SEJ. Los autores desean agradecer a Diego V. Bohórquez para el asesoramiento técnico. También agradecemos a R. Ian Cumming para la asistencia técnica y la realización de la citometría de flujo en el Centro de Vacunas Humanas Duke Instituto de Investigación de citometría de flujo de recursos compartidos (Durham, Carolina del Norte). La citometría de flujo se realizó en el Laboratorio Regional de Biocontención en Duke, que recibió un apoyo parcial a la construcción de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (UC6-AI058607).

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Duke. 1. Administración intranasal de Fast Blue Para Fast Blue, administrar el tinte al menos 2 días antes de la eutanasia el ratón. El tinte se mantendrá durante un máximo de ocho semanas. <ol><li> Anestesiar al ratón con anestesia por inhalación de luz (2,5% sevoflurano) hasta que comience a disminuir la respiración. </li><li> Usar una pipeta de 200 l con puntas filtrados para infundir lentamente 40 l de solución de colorante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solución salina DMSO, en tampón fosfato, PBS) en la fosa nasal, haciendo una pausa de vez en cuando para asegurar que el ratón está aspirando la solución (Figura 1A). </li><li> Mantenga pulsado el ratón verticalmente, cabeza en alto, y masajear suavemente el pecho para asegurar que el tinte se propaga a través de los pulmones. </li></ol> 2. Preparativos en la disección y el Día Análisis <ol><li> Preparar 10 ml0; Ganglios solución de disociación (GADS) mediante la combinación de los ingredientes como se especifica en la Tabla 1. </li><li> Realizar la extracción de ARN en un área del laboratorio dedicado. Antes de comenzar el experimento, las superficies limpias con 70% de etanol, 10% de lejía, y el reactivo de descontaminación RNasa. Esto incluye la centrífuga ARN, los bastidores de tubos y pipetas. Garantizar la existencia de cajas de puntas con filtro dedicado para el uso de ARN. No utilice este equipo y el área de preparación de ADN, ya que esto va a contaminar las muestras. </li><li> Mezcla fresca 70%, y 80% de etanol con agua libre de RNasa. Preparar 1 ml por muestra a ser utilizada en la extracción de RNA. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Avanzada DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamina </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> N2 suplemento </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> B27 (sin vitamina A) </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> NGF (50 g / ml) </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. mezcla de reactivos para Ganglios solución de disociación (GADS). 3. Procedimiento de disección <ol><li> Llenar tubos de 1,5 ml con 500 l gads, uno para cada muestra experimental, una para un control positivo de clasificación, y uno para un control de clasificación negativa. tubos de las tiendas en el hielo a lo largo de la disección. </li><li> Diseccionar el ganglio nodoso y hacer dos cortes parciales para facilitar la disociación, a continuación, poner en el tubo de muestra experimental. Por favor refiérase a la siguiente protocolo JoVe para la disección de los ganglios nudosos 16 y 17 DRG. </li><li> Diseccionar y cortar parcialmente ganglios no marcado, como el ganglios de la raíz dorsal (DRG), para los controles de clasificación. Use dos ganglios para el control positivo y dos Gangliuna para el control negativo. </li><li> Para obtener suficientes neuronas nodose para la clasificación exitosa, se combinan los ganglios de 5 ratones en gads que contienen un tubo de la muestra experimental. </li></ol> 4. Los ganglios sensoriales disociación <ol><li> Pipetear a cabo 500 gads l, dejando ganglios en el tubo. Lavar los ganglios de una vez mediante la adición de 1 ml de PBS, esperar a que los ganglios que se depositan en el fondo del tubo, luego de la pipeta a cabo PBS. </li><li> Añadir 1 ml gads y 22 l de enzima de digestión (colagenasa I / II y la mezcla de proteasa, 2,5 mg / ml en H 2 O) a cada tubo. </li><li> Añadir 20 l Fast Blue (5.26 mm) en el tubo de control positivo. </li><li> Poner los tubos en un baño de agua o bloque de calefacción ya regulado a 37 ° C. Nota: El tiempo de digestión ganglios depende de la edad de la enzima de digestión. El plazo de 1 mes de la disolución de la enzima de digestión, digestión durante 30 minutos, dentro de 2 - 6 meses digieren durante 45 minutos. Si la enzima es más de 6 meses de edad, digerir los ganglios fo 60 min. </li><li> Cada tubos de agitación 15 min brevemente y la película de ellos para asegurar ganglios están cubiertas por la solución. </li><li> Mientras ganglios están siendo digeridos, preparar los gradientes de densidad utilizando una solución de partículas (partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona). <ol><li> Mezclar solución al 12% de las partículas en gads, 500 l por muestra. </li><li> Mezclar solución al 28% de las partículas en gads, 500 l por muestra. </li><li> Poco a poco y con cuidado añadir 400 l solución densidad de 12% en la parte superior de la solución de densidad de 400 l de 28% en un nuevo tubo de 1,5 ml para cada muestra. No permita que las dos capas se mezclen. Dos capas distintas deben ser visibles en el tubo; una más oscura que la otra. </li></ol></li><li> Mientras ganglios están siendo digeridos, etiquetar nuevos tubos de 1,5 ml de recolección para la clasificación (un tubo de Fast Blue positivo y uno negativo Fast Blue por muestra de clasificación). Dependiendo de los requisitos de las instalaciones de clasificación, estos tubos deben tener tapas desmontables de manera que no interferE con el separador de células. </li><li> Después de que el tiempo de digestión apropiada, retire gads con enzima de digestión y lavar dos veces con ganglios 1 ml de PBS. Añadir 200 l de gads frescos a cada tubo. </li><li> Utilice una pipeta de 200 l, ajustado a un volumen de 100 l, y los ganglios de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las celdas. Repetir hasta que no se observa una pieza de tejido intacto. Evitar la creación de burbujas en la solución. </li><li> Pase células disociadas a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Añadir otros 100 gads l al tubo original de disociación para recoger todas las células restantes que quedan sueltos y pasar la solución adicional a través del filtro de células. Usando una nueva punta de pipeta, recoger el líquido que contiene células restante que ha pasado por el colador y aferrado a la malla. El volumen final de células suspendidas en gads es de 300 microlitros. </li><li> capa con cuidado los 300 l de células en la parte superior de la gradiente de densidad hecha previamente. Evitar las burbujas y mezcla de cells con las capas de densidad. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg a TA. </li><li> Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de tampón de lisis (1 ml por muestra experimental) como sigue: 10 l 2-mercaptoetanol en 1 ml de tampón RLT (del kit de extracción de ARN). <ol><li> Añadir 300 l de tampón de lisis para tubo de recogida positivo Fast Blue y 600 l a tubos de Fast Blue negativo recolección (tubos etiquetados desde el paso 4.7). Este volumen depende del número de células que se espera sean recogidos. Para &lt;2.000 células, añadir 300 l, para&gt; 7.000 células añaden 600 l. Esto asegurará que el fluido de revestimiento de clasificación no diluye significativamente el tampón de lisis. </li></ol></li><li> Una vez que se completa la centrifugación, retirar con cuidado y desechar la capa superior de 700 l. Esta capa contiene la mayoría de los residuos celulares que de otro modo interferir con la clasificación de células. </li><li> Añadir 700 l gads frescas a la célula restante solución y pipeta que contienete hacia arriba y abajo varias veces para mezclar. </li><li> Se centrifuga durante 15 minutos a 2.900 xg para sedimentar las células. </li><li> Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de clasificación gads (500 l por muestra) mediante la adición de 5 l de ADNasa (10 mg / ml) a 1 ml gads. </li><li> Una vez que se realiza la centrifugación, retirar con cuidado y desechar el sobrenadante, dejando el sedimento celular. </li><li> Vuelva a suspender sedimento celular en 200 - 300 l de clasificación gads la pipeta hacia arriba y abajo con una pipeta 1.000 l ajustado a 200 l varias veces. Poner las muestras en hielo. Las células están listas para ser resuelto. </li></ol> 5. La fluorescencia de células activadas (FAC) Clasificación Nota: En esta sección se requiere conocimiento operativo de un clasificador FACS o la ayuda de personal especializado. <ol><li> Añadir 1 l de yoduro de propidio (PI) solución madre (50 mg / ml) a cada muestra para la prueba de viabilidad celular. Dividir control negativo en 2 tubos, uno con PI y otro sin él. PI se une al ADN sólo en las células muertas. Sidespués de las primeras clases que no hay células muertas de la etiqueta, no es necesario el uso de IP. </li><li> Células de transporte para citometría de flujo instrumento, por ejemplo., BD FACS AriaII que ejecuta el software de la diva 8, en el hielo. </li><li> Dado que el tamaño de la celda es variable en esta población, utilizar una gran boquilla (100 micras) para la clasificación. Para disminuir la cantidad de estrés de la experiencia de las células y aumentar la viabilidad de las células usar baja presión (20 psi). </li><li> Utilice el software clasificador FACS para establecer las parcelas de análisis, dispersión frontal, dispersión lateral (SSC), Fast Blue, y PI, si es necesario. </li><li> Para volver a suspender las células, vórtice suavemente la muestra brevemente antes de cargarlo en el clasificador. </li><li> Comience con el control negativo, sin Fast Blue o PI, para establecer el umbral de la puerta (Figura 2A). Esto determinará la cantidad de autofluorescencia en la población celular. Opcional: Ejecutar el ejemplo negativo con PI para identificar si existe una población de células muertas. </li><li> Ordenar la muestra de control positivo (incubated con Fast Blue), para establecer los parámetros de compensación. </li><li> Una vez que se establecen las puertas y los parámetros, comenzar a clasificar las muestras experimentales. Las muestras se clasifican en los tubos de recogida de preparados que contienen tampón de lisis de ARN. </li><li> Mantener las muestras clasificadas en hielo hasta que la clasificación de células se ha completado. </li><li> Comience etapa de extracción de ARN inmediatamente después se clasifican las células. </li></ol> 6. La extracción de RNA <ol><li> células clasificadas Vortex en tampón de lisis durante 1 minuto para homogeneizar. </li><li> Añadir 1 volumen de 70% de etanol y la mezcla pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Transferencia de hasta 700 l de la muestra a una columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g. Desechar el flujo continuo. <ol><li> Repetir hasta que el volumen total de la muestra se hace pasar a través de la columna de centrifugación. </li></ol></li><li> Añadir 350 l de tampón RW1 y continuar el proceso de purificación de ARN, incluyendo la etapa de tratamiento de DNasa, de acuerdo con protoco del fabricantel para las células. </li><li> Una vez que se ha extraído el ARN, comprobar la calidad de ARN usando un sistema de electroforesis microfluídico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. </li></ol>

<ol><li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li>
<li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).</li>
<li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li>
<li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li>
<li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li>
<li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li>
<li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li>
<li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li>
<li>Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li>
<li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li>
<li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li>
<li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li>
<li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+of+cold+receptors+%28TRPM8+and+TRPA1%29+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li>
<li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li>
<li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus%3A+A+comparison+of+Fast+Blue%2C+Fluoro-ruby%2C+Fluoro-emerald%2C+Fluoro-Gold+and+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li>
<li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782(2013).</li>
<li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li>
<li>Kwong, K., Lee, L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE%282%29+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li>
<li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2%2F3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li>
<li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para dirigirse a las neuronas de la vía aérea-inervación en los ganglios nudosos del nervio vago. Una vez marcado, los ganglios se disocian suavemente para preservar de manera óptima el número de células y la viabilidad. Estas neuronas son entonces FAC ordenadas directamente en tampón de lisis y se extrae el ARN. La importancia de este protocolo es la posibilidad de dirigir, aislar y preservar la calidad de una población específica de células sensoriales. La expresión génica se describe...

nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estos nervios aferentes se encuentran en los ganglios sensoriales, tales como la raíz dorsal, trigeminal, o ganglios nudosos. Cada ganglio sensorial inerva regiones específicas del cuerpo y contiene células que inervan los órganos y tejidos separados dentro de esa región. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades, mientras que los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo, que contiene neuronas que inervan la cara, ojos, meninges o superiores vías respiratorias 1, 2. Los ganglios nodosos del nervio vago se encuentra en el cuello por debajo del cráneo y contiene cuerpos celulares que se extienden las fibras nerviosas en todo el tracto gastrointestinal, el corazón y las vías respiratorias inferiores y los pulmones 3. En los seres humanos el ganglio nodoso se encuentra solo, sin embargo, en el ratón se fusionacon el ganglio yugular, que también inerva los pulmones 4. Este ganglio fusionado a menudo se llama la yugular / nodose complejo, ganglio vagal, o simplemente ganglio nudoso 5. En este caso, se conoce como el ganglio nudoso. Las fibras aferentes de la nodose pasan la información de las vísceras al núcleo del tracto solitario (NTS) en el tronco cerebral. De entrada sensorial a este ganglio único controla una diversa gama de funciones, tales como la motilidad intestinal 6, la frecuencia cardíaca 7, la respiración 8,9, y las respuestas respiratorias irritantes activadas 10,11. Con esta diversidad de funciones y órganos inervados, es fundamental para dirigir y aislar subpoblaciones específicas de órgano del ganglio nudoso el fin de estudiar las vías neuronales individuales. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la nodose y el número limitado de neuronas que contiene esta no es una tarea trivial. Cada ratón ganglio nodoso contiene aproximadamente 5.000 neuronas 12Además de una extensa población de células de soporte satélite. De los 5.000 neuronas nodose, sólo un 3 - 5% de inervan las vías respiratorias. Por lo tanto, cualquier cambio funcionales, morfológicos o moleculares dentro de las neuronas que inervan las vías respiratorias, debido a la estimulación respiratoria o patologías, se perderán en el ganglio nodoso densamente poblado. Para resolver este problema, se desarrolló un método para identificar y aislar las neuronas que inervan las vías respiratorias. Las vías respiratorias se expusieron a un colorante indicador fluorescente para identificar a los posteriores neuronas que inervan nodose. Fast Blue fue recogido por las neuronas y se desplaza rápidamente a sus cuerpos celulares en los que se deberá conservarse durante un máximo de ocho semanas 13 - 15. Una vez identificado, un protocolo de disociación suave, pero eficaz se utiliza para conservar tinte de etiquetado y la viabilidad celular de células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación. Las células clasificadas se utilizan para extraer el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) para determinar la expresión de genes o fu otro análisis molecular de aguas abajo. Este protocolo proporciona una técnica útil y robusto para el aislamiento de las neuronas sensoriales que inervan un tejido de interés.

<table><tbody><tr><td>Policiencias Azules Rápidas</td><td>, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml en agua</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 tinción roja de Nissle</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) Libre de Ca y Mg</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamina ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (sin vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento nervioso (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &micro; g/ml en PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>enzima digestiva, Liberase DH Grado de investigación</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2,5 mg/ml en</td></tr><tr>solución de partículas de agua<td>(Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células</td><td>m Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto (200 pruebas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de RNasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de descontaminación de RNasa, RNasa AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNasa, Set de DNasa sin RNasa</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml en 0,15 M</td></tr><tr><td>NaCl Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 y micro; g/ml en</td></tr><tr><td>el sistema de electroforesis microfluídica PBS (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estas neuronas aferentes se encuentran dentro de los ganglios sensoriales. Los ganglios sensoriales inervan un órgano específico o porción del cuerpo. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades. Los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo y inervan la cara, y las vías respiratorias superiores. las vías aferentes vagales de los ganglios nodose se extienden por todo el intestino, el corazón y los pulmones. Las neuronas nodose controlan una gran variedad de funciones, tales como: frecuencia respiratoria, irritación de las vías respiratorias, tos y los reflejos. Por lo tanto, para entender y manipular su función, es crítico para identificar y aislar las vías respiratorias específicas subpoblaciones neuronales. En el ratón, las vías respiratorias están expuestos a un colorante indicador fluorescente, Fast Blue, para el rastreo retrógrado de las neuronas de la vía aérea específica nodoses. Los ganglios nodose se disocian y células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación se utiliza para recoger las células positivas de tinte. A continuación, el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) se extrae de las células positivas de tinte para la secuenciación de próxima generación. El uso de este método de la vía aérea se determina la expresión génica neuronal específico.

Usando este método, las neuronas que inervan las vías respiratorias se etiquetan mediante la instilación intranasal Fast Blue (Figura 1A). Después de dos días, las células Fast azul nombres aparecer en los ganglios nudosos (Figura 1C). Estas células constituyen 3-5% de la población neuronal total de los ganglios nudosos. Otros colorantes retrógradas que se han utilizado para este propósito incluyen DiI (1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametil...

Las neuronas sensoriales específicas de órganos son difíciles de identificar. El trazado rápido de azul se utiliza para identificar las neuronas nodosas que inervan las vías respiratorias para la clasificación de células. Las neuronas nodosas clasificadas se utilizan para extraer ácido ribonucleico (ARN) de alta calidad para la secuenciación. Utilizando este protocolo, se determina la expresión génica de neuronas específicas de la vía aérea.

Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

El objetivo general de este experimento es etiquetar y aislar las neuronas nodosas que inervan las vías respiratorias del nervio vago. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Neurobiología Periférica. Por ejemplo, ¿qué propiedades identificatorias poseen las neuronas que inervan las vías respiratorias?La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método robusto y de alto rendimiento para dirigirse a poblaciones neuronales específicas y aislarlas. Después de recolectar los ganglios sensoriales, aspire 500 microlitros de solución de disociación de ganglios de cada tubo, sin perturbar los ganglios. A continuación, agregue un mililitro de PBS a cada muestra y espere a que los ganglios sedimenten en el fondo de los tubos.Luego, retire el PBS y agregue un mililitro de solución de disociación de ganglios suplementada con enzima de digestión a las neuronas, seguido por la adición de 20 microlitros de Azul Rápido al tubo de control positivo. Incube los tubos a 37 grados Celsius durante el tiempo adecuado según la edad de la enzima de digestión. Agite y golpee brevemente los tubos cada 15 minutos para asegurar que los ganglios estén cubiertos por la solución de digestión.Mientras las células nerviosas están siendo digeridas, agregue lenta y cuidadosamente 400 microlitros de solución recién preparada al 12 % de densidad sobre 400 microlitros de solución al 28 % de densidad en un tubo de 1,5 mililitros por muestra. Deben ser visibles dos capas distintas, una más oscura que la otra. A continuación, etiquete tubos de recolección de 1,5 mililitros para el ordenamiento, incluyendo un tubo positivo para Fast Blue y un tubo negativo para Fast Blue por muestra de clasificación.Al final del período de digestión, deseche la enzima de digestión y lave los ganglios dos veces con un mililitro de PBS, como se acaba de demostrar. Después del segundo lavado, añada 200 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios a cada tubo. Luego, utilizando una pipeta de 200 microlitros ajustada a un volumen de 100 microlitros, aspire y expulse los ganglios varias veces para disociar las células en una suspensión individual, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas.Cuando no sean visibles fragmentos de tejido intactos, sosteniendo firmemente un colador celular de 70 micrones en una mano, pipetee la solución celular disociada hacia el centro del colador. Luego, lave el tubo de disociación con 100 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios para recoger cualquier célula adicional. Filtre el lavado a través del colador y use una nueva punta de pipeta para aspirar cualquier solución restante que contenga células en la parte inferior del colador, añadiéndola a la suspensión celular.Ahora, coloque cuidadosamente los 300 microlitros de células sobre el gradiente de densidad previamente preparado. Y recolecte las células ganglionares mediante centrifugación. Mientras las células están centrifugándose, agregue 300 microlitros de tampón de lisis recién preparado al tubo de recolección Fast Blue positivo y 600 microlitros de tampón de lisis al tubo de recolección negativo para asegurar que el fluido de la boquilla de ordenación no diluya significativamente el tampón de lisis.Al finalizar la centrifugación, retire cuidadosamente los 700 microlitros superiores de la solución que contienen la mayor parte de los restos celulares. Luego, mezcle 700 microlitros de solución fresca de disociación de ganglios con las células restantes. Pelote las células mediante centrifugación y deseche cuidadosamente el sobrenadante.Luego, re-suspenda las células en 200 a 300 microlitros de solución de disociación para clasificación de ganglios utilizando una pipeta de 1,000 microlitros ajustada a 200 microlitros. Coloque las células en hielo hasta que estén listas para la clasificación. Después de purificar las células de los ganglios mediante FACS, homogenice las neuronas en tampón de lisis durante un minuto mediante vortex.A continuación, mezcle las células varias veces con un volumen de etanol al 70 % y transfiera hasta 700 microlitros de la muestra a una columna de centrifugación. Centrifugue la columna durante 15 segundos a 8.000 × g en una microcentrífuga y deseche el filtrado. Una vez que toda la muestra haya pasado a través de la columna de centrifugación, extraiga el ARN según los protocolos estándar de purificación de ARN.Luego, utilice un sistema de electroforesis microfluídico para evaluar la calidad del ARN según las especificaciones del fabricante. En estos gráficos, se muestran los controles negativo y positivo de Fast Blue utilizados para establecer las compuertas de clasificación. Las células del ganglio nodoso disociadas y marcadas con Fast Blue pueden entonces clasificarse en poblaciones positivas y negativas para Fast Blue.La eficiencia de clasificación para este método es del 73 al 85 %, con aproximadamente 1.500 o menos células positivas para Fast Blue y casi 60.000 células negativas para Fast Blue recolectadas en promedio. Como se observó en esta muestra representativa, los picos 18S y 28S obtenidos mediante electroforesis microfluídica pueden utilizarse entonces para calcular el número de integridad del ARN y determinar la calidad del ARN extraído. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro horas y media si se realiza adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar avanzar rápidamente a través de los pasos y utilizar soluciones recién preparadas para la extracción de ARN. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el cultivo neuronal para responder preguntas adicionales, como qué propiedades funcionales son únicas de las neuronas que inervan las vías respiratorias. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Neurobiología Periférica exploraran las propiedades únicas de una población específica de neuronas que inervan las vías respiratorias en los ganglios nodosos del nervio vago.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y disociar neuronas específicas de los ganglios nodosos, las cuales pueden utilizarse luego para secuenciación de ARN o sembrarse para estudios funcionales. No olvide que trabajar con 2-mercaptoetanol puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar en una campana extractora de gases al manipular este compuesto.

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Mediciones repetidas de la fisiología respiratoria y el muestreo de roedores de las células de las vías respiratorias inflamatorias son deseables, pero en general no es factible. A continuación se describe un método reproducible para la intubación por vía oral ratones que permite mediciones repetidas de la hiperreactividad de las vías respiratorias y el muestreo de las células de las vías respiratorias inflamatorias.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para...

La administración subcutánea de antagonistas muscarínicos y Triple-inmunotinción del músculo largo del elevador del Auris en ratones

Este video muestra el aislamiento de las células de los ganglios sensoriales de ratones. Los ganglios se someten a digestión enzimática para disolver la matriz extracelular. A continuación, las células individuales se recogen mediante filtrado a través de un filtro de células seguido de una centrifugación en gradiente de densidad para la eliminación de residuos. Finalmente, se realiza el lavado y la centrifugación para recoger las células aisladas para su posterior análisis.

Aislamiento de células de los ganglios sensoriales

Este video muestra el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en ratones utilizando una técnica de patch-clamp perforada. El epitelio olfativo, que contiene OSN con receptores de olor marcados con fluoróforos, se aísla de un ratón y se asegura en una cámara de registro. Una pipeta de registro se sujeta a la perilla dendrítica de un OSN, y la nistatina dentro de la pipeta perfora la membrana para formar una conectividad eléctrica con la célula. Por último, se...

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

Hemos desarrollado un método simple, fiable, y relativamente barato para la intubación endotraqueal en ratones a través de la laringoscopia directa utilizando un otoscopio con un espéculo 2,0 mm. Esta técnica es atraumática y se puede utilizar para mediciones repetidas en experimentos crónicos. Nos resulta superior a la traqueotomía o previamente informó técnicas no quirúrgicas.

Intubación endotraqueal en ratones<em&gt; Vía</em&gt; La laringoscopia directa utilizando un otoscopio

Presentamos un protocolo quirúrgico que detalla cómo realizar una axotomía cortada o aplastada en el nervio facial en el ratón. La axotomía del nervio facial se puede emplear para estudiar la respuesta fisiológica a la lesión nerviosa y probar técnicas terapéuticas.

Axotomía nervio facial en ratones: un modelo para estudiar las motoneuronas respuesta a la lesión

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

El objetivo de este artículo es describir un método refinado de intubación del ratón de laboratorio. El método no es invasivo y, por lo tanto, ideal para estudios que requieren monitorización en serie de la función respiratoria y/o inscripción de tratamientos en el pulmón.

Intubación orotraqueal repetida en ratones

Este manuscrito presenta un protocolo para la extirpación quirúrgica de las neuronas simpáticas lumbares postganglionares de un ratón. Este procedimiento facilitará multitud de estudios dirigidos a investigar el papel de la inervación simpática en dianas tisulares distales.

Simpatectomía lumbar quirúrgica en ratones

Este estudio presenta una manipulación quirúrgica para exponer el T-DRG en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo , junto con registros sincrónicos de ECG. Este método representa una herramienta de vanguardia para estudiar la estimulación de los nervios eléctricos periféricos y las entradas de los órganos viscerales torácicos, así como sus interacciones a nivel sensorial primario.

Imágenes de calcio y registro de ECG de los ganglios de la raíz dorsal torácica (DRG) in vivo para el estudio de la estimulación de los nervios periféricos

Este estudio estableció modelos de tos y estornudos en ratones mediante la aplicación de estímulos específicos a la tráquea y la cavidad nasal, y desarrolló un método basado en audio para distinguir entre la tos y los estornudos de ratones mediante el análisis de las diferencias en sus señales acústicas.<br...

Inducción de precisión y distinción de los reflejos de tos y estornudo en ratones

Aprende a etiquetar y aislar neuronas nodosas que inervan vías aéreas en ratones mediante trazado con Fast Blue y disociación de ganglios. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica.

Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

Explorar más videos