Name: La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a aislar leucocitos hepáticos marginantes mediante perfusión forzada en roedores. Este método permite obtener células inmunes exclusivas de los sinusoides hepáticos sin contaminación para estudiar su función inmunológica única en enfermedades hepáticas.

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Los autores y este trabajo fueron apoyados por la subvención # R01CA172138 de los NIH/NCI (a SBE).

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv. Protocolo 1. Las ratas <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de solución salina tamponada con fosfato 1x solución (PBS). Calcula 35 ml por animal. </li><li> Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire. </li><li> Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)). </li></ol></li><li> Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos <ol><li> La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 50 ml que contiene un isofluranoalmohadilla -soaked alrededor de la cabeza de la rata hasta la apertura de su cavidad torácica. </li><li> Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente tras el cese de la respiración. Evitar el sangrado a través de este proceso. <ol><li> En concreto, iniciar la incisión en el punto de la línea media abdominal inferior, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica. </li></ol></li><li> Dentro de aproximadamente un minuto, recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 6 ml de un animal de 250 g) del ventrículo derecho en una jeringa. </li><li> Abrazadera de la vena cava caudal con una pinza hemostática lo más cerca posible al corazón, para permitir la recogida del líquido de perfusión. </li><li> Tire de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta. </li><li> Insertar un catéter 25 G IV, conectado a una bomba peristáltica, en la vena porta, como caudal como sea posible,pero rostral a la vena esplénica. </li><li> Inserte una aguja G 25 de la mariposa, conectada a una jeringa de 5 ml, en la vena cava inferior, caudal a la pinza hemostática. </li><li> Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente los primeros ml de perfundido que están contaminados con sangre en la jeringa. Continuar hasta que el color es perfundido se pone pálido rojo (aproximadamente 3-5 ml). Observe que el color del hígado está cambiando hacia marrón claro. </li><li> Sin detener la bomba peristáltica, sustituir la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml de cosecha y recoger al menos 20 ml de líquido de perfusión del hígado que emplean una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de líquido de perfusión a la jeringa de recogida, y evitar que el vacío es demasiado fuerte (que puede obstruir la aguja por el colapso de las paredes de la vena cava). </li><li> Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro. </li></ol></li><li> Extracción leucocitos <ol&gt; <li> Centrifugar el perfundido durante 10 min a 400 xg, 24 DO. </li><li> Aspirar el sobrenadante </li><li> Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 xg durante 10 min, y aspirar el sobrenadante. Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad). <ol><li> En concreto, la capa 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera. </li><li> Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protocolo de ratón <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de tampón fosfato salino (PBS) 1x solutionorte. Calcula 20 ml por animal. </li><li> Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire. </li><li> Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)). </li></ol></li><li> Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos <ol><li> La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 15 ml que contiene una almohadilla empapada isoflurano alrededor de la cabeza del ratón hasta la apertura de su cavidad torácica. </li><li> Fijar las extremidades del ratón a una cama. </li><li> Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente al cese de la respiración, manteniendo el aspecto inferior del diafragma intacto (para crear un grupo de drenaje cavidad torácica). Evitar el sangrado a través de este proceso. <ol><li> En concreto, iniciar la incisión en la parte inferiorpunto de la línea media abdominal, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica. </li></ol></li><li> Retirada de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta. </li><li> Inserte una aguja 30 g, conectado a una bomba peristáltica en el rostral de la vena porta a la vena esplénica. </li><li> Cortar la vena cava inferior por encima del diafragma para permitir el drenaje y recogida del líquido de perfusión de la cavidad torácica. </li><li> Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente el 3 primero ml de perfundido que están contaminados con sangre de la piscina cavidad torácica. </li><li> Desechar este líquido de perfusión. Repetir un lavado tal vez más si es necesario, mediante el uso de solución salina, y sólo entonces comenzar a recoger líquido de perfusión hepática. </li><li> Re-iniciar la perfusión a una velocidad de hasta 4 ml / min, y recoger 10 ml de perfundido de la cavidad torácica usandouna mariposa conectada a una jeringa. </li><li> Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro. </li></ol></li><li> Extracción leucocitos <ol><li> Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 g durante 10 min, y aspirar el sobrenadante Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad). <ol><li> En concreto, cada capa de 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera. </li><li> Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pit+cell%3A+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li>
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<li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells%3A+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li>
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<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+function+of+pit+cells%2C+the+liver-specific+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li>
<li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+granular+lymphocytes+or+%26%2334%3Bpit+cells%26%2334%3B+from+rat+liver%3A+isolation%2C+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Large granular lymphocytes or &#34;pit cells&#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li>
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<li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+%28pit+cell%29-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de perfusión hepática que aquí se presenta permite una recolección selectiva y el estudio de la población única de marginando leucocitos hepáticas. Células hepáticas NK, también llamadas células de pozo 3, constituyen una población de células NK distintivo que residen en los sinusoides hepáticos. Se encuentran en ratas, ratones y 17 en los seres humanos 18,19. En comparación con las células NK periféricas aisladas, células de pozo demostrado mayor citotoxicidad contra líneas de...

Los sinusoides hepáticos contienen numerosos subtipos de leucocitos de diversas actividades inmunes críticos para el organismo. Por ejemplo, las células marginando hepática (MH) asesinas naturales (NK), también conocidas como células de pozo, se caracterizan morfológicamente como linfocitos granulares grandes (LGLs) y funcionalmente como leucocitos con capacidad citotóxica espontánea, lo que permite hepática resistencia contra el establecimiento de sangre metástasis tumorales Borne. El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de leucocitos MH, con el fin de estudiar esta población celular importante y única (y el compartimento inmune), y para dilucidar el impacto de diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas. A pesar del fracaso de la inmunidad para eliminar un tumor primario en desarrollo, la evidencia en pacientes con cáncer y en modelos animales indican que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual throu circulantela inmunidad mediada por células GH (CMI). Sin embargo, existe una inconsistencia aparente entre estos en capacidades in vivo y en estudios in vitro en seres humanos y en animales, que demuestran que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación o leucocitos esplénicos 1,2. Esta inconsistencia se puede atribuir, al menos en parte, a la existencia in vivo de una subpoblación de leucocitos distinto, a saber, los (sinusoides) leucocitos marginando-hepática y su subpoblación de células NK activadas, es decir, células de pozo 3. De hecho, datos no publicados de nuestro laboratorio indican que en las ratas F344 células tumorales singénicas (MADB106), que se encontró resistente a circulantes y esplénicas leucocitos, fueron lisadas por células NK MH-4. Así, las células tumorales que son supuestamente &quot;NK-resistente&quot; a los leucocitos circulantes pueden ser controlados por las células MH-NK. Digno de mención, en ratones la actividad mejorada de MH-NK es evidente sólo después in vivo inmuneestimulación (por ejemplo, mediante el uso de Poly I: C o CpG-C) 5. Las células NK específicos del hígado (MH-NK) están situados dentro de la luz sinusoidales, la adhesión a las células endoteliales y células de Kupffer. Células MH-NK se caracterizan exclusivamente por gránulos densos esféricas y vesículas de varilla de núcleo 6, que contienen fosfatasa ácida como enzimas lisosomales y perforina y granzimas como sustancias bioactivas 7,8. En comparación con las células NK circulantes, las células MH-NK exhiben un mayor número y tamaño de los gránulos y vesículas 9-11. Bajo condiciones inflamatorias, se demostró que las células MH-NK a exhibir una mayor expresión de LFA-1 12, en comparación con las células NK circulantes. Esta expresión potenciada puede constituir un mecanismo por el cual las células MH-NK son más citotóxicos contra ciertas células tumorales que las células NK 13,14 circulante. nterestingly, después de la incubación in vitro con interleuquina (IL) -2, las células MH-NK se agrandan, ysu número y tamaño de los gránulos aumentan, todos los cuales son consistentes con una células pro fi l de killer activadas por linfoquinas (LAK) 15. leucocitos MH activos no se pueden obtener exclusivamente a través de los métodos de cosecha de leucocitos hígado estándar, que se basan en la molienda y la degradación biológica de los tejidos. Nuestro enfoque de perfusión descrito en este documento tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques estándar. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente leucocitos MH, la prevención de la contaminación por otros leucocitos de otros compartimentos del hígado. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor preserva la integridad, la actividad, y el medio fisiológico de los leucocitos MH, a diferencia del procesamiento de tejido se aproxima que dañan las células o alterar su morfología, y debido a daños en los tejidos, inducir la liberación de diversos factores que marcadamente modular inmune actividad. El hígado es el principal órgano diana para la metástasis del cáncer dend para diversas infecciones 16. A medida que las células MH poseen características singulares que es importante estudiar esta población específica en diversas condiciones con respecto a estas patologías. Por ejemplo, es digno de destacar que la activación inmune sistémica por varios BRM (por ejemplo, poli I: C o C-CpG) se han demostrado para activar MH-leucocitos más de 5 leucocitos circulantes.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Bomba</td><td></td><td></td><td></td>peristáltica</tr><tr><td>Aguja de mariposa</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Aguja de mariposa</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr> <tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Pic solución</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de borde romo<td>Tijeras</td></tr><tr><td>hemostático</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td>de tejido</tr><tr><td>22 W Lámpara</td><td></td><td></td><td></td> de lupa fluorescente de luz diurna</tr></tbody></table>

la recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Los leucocitos hepáticos marginadores (MH) (leucocitos que se adhieren a los sinusoides del hígado) mostraron una composición y características únicas en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunes. Específicamente, la evidencia sugiere un perfil proinflamatorio y antiinflamatorio distinto de la población de leucocitos MH y una mayor citotoxicidad de las células NK específicas del hígado (es decir, células pit) en comparación con los inmunocitos circulantes o esplénicos tanto en ratones como en ratas. El método presentado en este trabajo permite la recolección selectiva de leucocitos MH por perfusión forzada del hígado en ratones y ratas. A diferencia de otros métodos utilizados para extraer leucocitos hepáticos, como la molienda de tejidos y la degradación biológica, este método produce exclusivamente leucocitos de los sinusoides hepáticos, no contaminados por células de otros compartimentos hepáticos. Además, la técnica de perfusión preserva mejor la integridad y el entorno fisiológico de los leucocitos MH, evitando las respuestas fisiológicas conocidas al procesamiento tisular. Dado que muchas células malignas circulantes e infectadas se detienen mientras pasan a través de los sinusoides hepáticos, interactuando físicamente con las células endoteliales y los leucocitos residentes, la población única de leucocitos MH está estratégicamente ubicada para interactuar, identificar y reaccionar hacia las células circulantes aberrantes. Por lo tanto, la recolección selectiva de leucocitos MH y su estudio en diversas condiciones puede avanzar en nuestra comprensión de la importancia biológica y clínica de los leucocitos MH, específicamente con respecto a las células aberrantes circulantes y las enfermedades relacionadas con el hígado y las metástasis cancerosas.

En las ratas F344 se comparó la citotoxicidad de células NK-MH (recogido de los sinusoides hepáticos por perfusión del hígado forzado) a la citotoxicidad de la totalidad de la población de células de hígado después de trituración mecánica del tejido del hígado, y a la citotoxicidad de los leucocitos circulantes. Todas las preparaciones celulares se lavaron al menos 3 veces, como rutina en ensayos inmunológicos, y como líneas de células diana que utilizan las líneas de la célula diana sin...

Los leucocitos hepáticos marginadores exhiben características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. En este trabajo describimos un método para la recolección selectiva de esta población específica de células hepáticas, mediante perfusión forzada del hígado de ratas o ratones. Los leucocitos hepáticos marginadores parecen ser fundamentales para determinar la susceptibilidad a las enfermedades y metástasis relacionadas con el hígado.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

El objetivo general de este procedimiento es cosechar selectivamente leucocitos hepáticos marginales, células inmunitarias que se adhieren a los sinusoides del hígado, mediante perfusión forzada a partir de hígados de ratón o rata. Este método permite el estudio de los leucocitos hepáticos, que presentan características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona leucocitos exclusivamente provenientes del sinusoidal hepático sin contaminación por células de otros compartimentos hepáticos, como el parénquima.El procedimiento será demostrado por Liat Sorski y Lee Shaashua, dos estudiantes de posgrado excelentes de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento de perfusión hepática, pase PBS heparinizado a través de las líneas de la bomba peristáltica y de las agujas tipo mariposa para eliminar cualquier burbuja de aire. Luego, inmediatamente después de la cesación de la respiración, use tijeras estériles y pinzas dentadas para hacer una incisión abdominal media que comience en la parte inferior del abdomen de la rata sacrificada y llegue hasta el proceso xifoides, teniendo cuidado de no dañar los órganos internos.A continuación, use la pinza para levantar el esternón y corte cuidadosamente el diafragma y la caja torácica en ambos lados. Coloque una pinza hemostática en el esternón y doble la caja torácica en dirección rostral para exponer el complejo cardiorrespiratorio. Luego, prepare una aguja tipo mariposa de calibre 21 conectada a una jeringa de 10 mililitros e insértela en el ventrículo derecho del corazón.A continuación, utilice la jeringa de 10 mililitros para recolectar la mayor cantidad posible de sangre. Una vez recolectada toda la sangre, use un hemostato para ocluir la vena cava caudal lo más cerca posible del corazón. Luego, mueva los intestinos fuera de la cavidad abdominal hacia el lado izquierdo del animal para exponer la vena porta.A continuación, prepare una cánula IV de calibre 25 conectada al tubo de salida de la bomba peristáltica e insértela en la vena porta lo más caudal posible, manteniéndose craneal a la vena esplénica. Luego, prepare una aguja tipo mariposa de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros e insértela en la vena cava inferior caudal al hemostato. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente tres mililitros por minuto y recoja los primeros mililitros del perfusado contaminados con sangre en la jeringa.Coloque la jeringa de recolección de cinco mililitros junto con la jeringa de recolección de 20 mililitros sin detener la bomba cuando el perfusado adquiera un color rojo pálido. Luego, recoja al menos 20 mililitros de perfusado hepático a siete mililitros por minuto. Cuando todo el hígado esté de color marrón claro, finalice la perfusión.Luego, centrifugar el perfusado y aspirar el sobrenadante. Para recoger los leucocitos hepáticos marginales de ratón, inmediatamente después de la cesación de la respiración, utilizar tijeras estériles y pinzas de tejido dentadas para realizar una incisión abdominal media hasta el proceso xifoides. A continuación, usar las pinzas para levantar el esternón y cortar cuidadosamente el diafragma y la caja torácica en ambos lados.Sujete con un hemostato el esternón y doble la caja torácica en dirección rostral para exponer el complejo cardiopulmonar. Mueva los intestinos fuera de la cavidad abdominal hacia el lado izquierdo del animal para exponer la vena porta. A continuación, conecte una aguja de calibre 30 a una bomba peristáltica e insértela en la vena porta por delante de la vena esplénica.Corte la vena cava inferior por encima del diafragma para permitir el drenaje y la recolección del perfusado desde la cavidad torácica. Luego, encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente tres mililitros por minuto y recoja los primeros mililitros de perfusado contaminados con sangre provenientes del depósito en la cavidad torácica. Cuando se hayan recolectado tres mililitros, apague la bomba.Luego, después de insertar una aguja tipo mariposa de calibre 21 conectada a una jeringa de 10 mililitros, reinicie la perfusión a una velocidad de hasta cuatro mililitros por minuto hasta recolectar 10 mililitros de perfusado de la cavidad torácica. Cuando el hígado adquiera un color marrón claro, detenga la perfusión. A continuación, transfiera el perfusado a un tubo de 15 mililitros.Centrifúguelo. Luego aspire el sobrenadante. Mientras que las células NK hepáticas marginales exhiben una citotoxicidad profunda frente a líneas celulares diana alogénicas, toda la población celular hepática y los leucocitos circulantes muestran niveles marcadamente más bajos de citotoxicidad y casi ningún efecto citolítico frente a una línea celular diana singénica.Se observan niveles relativamente más bajos similares de citotoxicidad cuando los hígados procesados mecánicamente pasan por lavado y separación en gradiente de densidad. El análisis de poblaciones específicas de leucocitos revela diferencias profundas en la composición de las poblaciones de células inmunitarias de los compartimentos circulantes y hepáticos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en unos minutos si se realiza adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, la célula puede utilizarse para citometría de flujo, PCR o cualquier otro método para caracterizar esta importante población de leucocitos. Esta técnica permite la recolección selectiva de leucocitos hepáticos marginales para avanzar en el entendimiento de su significado biológico y clínico. Específicamente, esperamos controlar las células aberrantes circulantes y las enfermedades relacionadas con el hígado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar leucocitos hepáticos marginales.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Este video describe un método para la separación espacial de tres subpoblaciones de células leucémicas: las células leucémicas suspendidas que flotan libremente en el medio, las células leucémicas brillantes en fase adheridas a la superficie de la monocapa de células estromales mesenquimales, y las células leucémicas en fase diminutas que han migrado debajo de la monocapa de células estromales mesenquimales desde el cocultivo 2D.

Recolección de subpoblaciones leucémicas: un método para la separación espacial de subpoblaciones de células leucémicas a partir del cocultivo 2D

En este video, demostramos el aislamiento de leucocitos hepáticos marginados del hígado de ratón por perfusión forzada.

Aislamiento de leucocitos hepáticos marginantes de un hígado de ratón

Este video muestra el aislamiento de linfocitos, incluidas las células asesinas naturales o células NK, del tejido hepático humano para su expansión selectiva. La digestión enzimática y mecánica, seguida de la separación por gradiente de densidad, promueve el aislamiento de linfocitos, incluidas las células NK. Los linfocitos recolectados se pueden utilizar posteriormente para la expansión selectiva de las células NK.

Aislamiento de células asesinas naturales del tejido hepático para la expansión selectiva

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Los leucocitos pulmonares marginadores exhiben características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. En este trabajo describimos la recolección selectiva de esta subpoblación de leucocitos pulmonares, mediante perfusión forzada de los pulmones en ratas y ratones. Los leucocitos pulmonares marginadores parecen ser fundamentales para determinar la susceptibilidad a las enfermedades transmitidas por la sangre y relacionadas con los pulmones.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.

El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.

Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas

Aprende a aislar leucocitos hepáticos marginantes mediante perfusión forzada en roedores. Este método permite obtener células inmunes exclusivas de los sinusoides hepáticos sin contaminación para estudiar su función inmunológica única en enfermedades hepáticas.

La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

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