Name: La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a generar cardiomiocitos auriculares homogéneos a partir de células madre embrionarias de ratón utilizando el factor Grem2. Este protocolo mejora el rendimiento y facilita el estudio de arritmias auriculares.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL083958 HL100398 (AKH) y 2T32HL007411-33 &quot;Programa de Mecanismos cardiovasculares: Formación en Investigación&quot; (JB).

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Los autores de este manuscrito no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo produce rutinariamente cultivos con un alto porcentaje de los CM que son característicos del linaje auricular. Al igual que con cualquier protocolo de diferenciación, la calidad de los mESCs antes de la diferenciación se debe prestar especial atención. mESCs deben ser controlados rutinariamente por la morfología adecuada (Figura 1A). Cualquier diferenciación espontánea que se produce antes de la formación de EB, limitar considerablemente la eficiencia de cardiogénesis y debe ser eliminado...

Las células madre pluripotentes son una herramienta poderosa para la generación y el estudio de células de una serie de tejidos difícil acceso para los estudios de investigación básica y pre-clínicos, especialmente en seres humanos 1-5. la modulación adecuada de las vías de señalización de desarrollo puede dirigir la diferenciación de células madre pluripotentes para el destino fenotípica deseada. Muchos protocolos se han desarrollado para generar cardiomiocitos (CMS) a partir de células madre pluripotentes 6-14. Estos protocolos implican generalmente la modulación de la superfamilia TFGβ (activina, BMP, y TGF) y las vías mediante la adición temporizada de factores de crecimiento exógenos y / o moléculas pequeñas 10,12-15 Wnt. Estos protocolos son generalmente eficaces en el aumento del porcentaje de células que se convierten en los CM, pero carecen de la especificidad, la generación de una población mixta de células que representan linajes auricular, ventricular y del sistema nodal / conducción. Con el fin de estudiar cardíaca específica subtipos A apro mayor diferenciación dirigidaSe requiere ACH. Gremlin2 (Grem2, también llamada proteína relacionada con Dan y Cerberus o CRP para abreviar) es un antagonista BMP secretada que es necesario para la diferenciación cardiaca adecuada y la formación de cámara auricular durante el desarrollo cardiaco en el pez cebra 16. El tratamiento de la diferenciación de células madre embrionarias con Grem2 en días de diferenciación 4, justo después de pico de expresión de marcadores mesodérmicas T-brachyury y Cerberus como 1, aumenta el rendimiento de los CM y genera un conjunto de células predominantemente del linaje atrial 14. Grem2 recombinante se utiliza para tratar las células que se diferencian y se puede hacer uso de las técnicas de producción de proteínas estándar de 17 o puede adquirirse comercialmente. Es muy soluble en soluciones acuosas y puede añadirse de forma exógena a los cultivos en el punto de tiempo deseado. La diferenciación se puede seguir utilizando RT-qPCR para cuantificar la expresión de marcadores representantede progenitores de células progenitoras cardiovasculares, cardiacas y comprometida CM. Inmunofluorescencia también se puede utilizar para identificar y visualizar la distribución espacial de los tipos de células cardíacas. Las aplicaciones que requieren poblaciones puras se llevan a cabo más fácilmente cuando se usa un sistema indicador para identificar y aislar los CM. Con este fin, hemos introducido la αMHC-DsRedNuc construcción en la línea celular de ratón CGR8 ES 14. CGR8 células crecen y mantienen su pluripotencia sin células alimentadoras, facilitando la expansión y diferenciación ensayos 18. La línea de células ES contiene una secuencia que codifica la proteína fluorescente DsRed con una señal de localización nuclear bajo la alfa-cardiaca específica de la miosina de cadena pesada (MHC alpha o MYH6) promotor del gen. El uso de estas células, los CM puede ser fácilmente identificado y aislado para la cuantificación, clasificación de células, electrofisiología, pruebas de drogas, y el estudio de los mecanismos de diferenciación de la aurícula.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultivo de tejidos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de Petri bacterianas</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr> 6 <tr><td>cm Placas de Petri bacterianas</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 proteína recombinante</td><td>R& amperio; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro estériles</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (de piel de cerdo)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Estéril</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA al 0,05%</td><td>Life Technologies 25300054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

la diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes uso del antagonista de bmp grem2

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Los protocolos para la generación de poblaciones de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes se han desarrollado, pero estos generalmente producir células de fenotipos mixtos. Los investigadores interesados ​​en seguir estudios con miocitos subtipos específicos requieren un enfoque más dirigido diferenciación. Por el tratamiento de células madre embrionarias de ratón (ES) con Grem2, un antagonista de BMP secretada que es necesario para la formación de cámara auricular in vivo, un gran número de células cardiacas con un fenotipo auricular se pueden generar. El uso de la línea de células madre pluripotentes MYH6-DsRed-Nuc, permite la identificación, selección y purificación de los cardiomiocitos. En este protocolo cuerpos embrionarios se generan a partir de células MYH6-DsRed-Nuc utilizando el método de la gota que cuelga y se mantienen en suspensión hasta que la diferenciación día 4 (D4). En las celdas D4 son tratados con Grem2 y se sembraron en placas recubiertas de gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes se observan en las culturas y continúan expandiéndose ymATURALEZA través de d14. Molecular, análisis histológicos y electrophysiogical indican células en células tratadas con Grem2 adquieren características similares a auriculares proporcionan un modelo in vitro para estudiar la biología de los miocitos auriculares y su respuesta a diversos agentes farmacológicos.

Antes de la diferenciación, las células madre pluripotentes deben ser compactos y libres de diferenciación espontánea. Las células que se muestran en la Figura 1A están listas para ser singularizado y se utiliza para colgar gotas como se describe en 5.1 de la sección de protocolo. Las células que se muestran en la Figura 1B están diferenciando de forma espontánea y no deben ser utilizados para la preparación de gotas colgantes. <p class="jove_content...

La generación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes in vitro permite el acceso a grandes cantidades de tejido cardíaco in vitro para aplicaciones clínicas y de ciencia básica. Este protocolo utiliza el factor atrializante Grem2 tanto para aumentar el número de cardiomiocitos obtenidos como para generar cardiomiocitos con un fenotipo auricular.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

El objetivo general de este protocolo de diferenciación es generar poblaciones homogéneas de cardiomiocitos auriculares en cultivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades cardíacas como la arritmia auricular. Las principales ventajas de esta técnica son que produce cultivos homogéneos de cardiomiocitos auriculares in vitro y que se puede realizar con un entrenamiento mínimo.Hasta cuatro días antes de configurar las células madre embrionarias de ratón, o cultivos de mESC, codifique placas de tejido de 10 centímetros con 5 mililitros de solución de gelatina al 0,2% cada una, en placas de seis pocillos con 1 mililitro de gelatina por pocillo en una campana de cultivo de tejidos esterilizada. El día del cultivo, retire la solución de gelatina adicional y agregue 10 mililitros de medio a uno de los platos de 10 centímetros cubiertos de gelatina. Luego, use criotongs para agitar suavemente un vial de 1 por 10 a los 6 mESC en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo en el centro del vial.Seque el vial con una toallita desechable sin pelusa y esterilícelo con etanol al 70%. A continuación, coloque el vial en la campana de cultivo de tejidos y utilice una pipeta P1000 para añadir los ESC a la placa. Coloque las células en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y mueva suavemente la placa de adelante hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente las células.Al final de la incubación, utilice un microscopio de campo claro para confirmar la unión de las células. Se observarán algunos escombros y células muertas. Reemplace el medio con 10 mililitros de medio mESC fresco y devuelva las células a la incubadora.Cuando el cultivo sea 60 a 70% confluente, enjuague la placa con 5 mililitros de DPBS estéril sin magnesio ni calcio, e incube las células en 2 mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Mientras las células se incuban, aspire el exceso de solución de gelatina de un nuevo plato de 10 centímetros por cultivo pasado y agregue 10 mililitros de medio a cada placa. A continuación, recoja las células desprendidas por centrifugación en un tubo de 15 mililitros y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio mESC.Dependiendo de la relación de división deseada, agregue de 0,5 a 1 mililitro de suspensión celular a cada plato de 10 centímetros y devuelva las celdas a la incubadora, distribuyendo suavemente las celdas en cada plato como se acaba de demostrar. Cuando las células transitadas sean confluentes en un 70%, sepárelas con tripsina EDTA como se acaba de demostrar, luego vuelva a suspender la suspensión de una sola célula en 5 mililitros de cuerpo embrioide o medio EB. Cuente los mESC y luego dilúyalos en el volumen apropiado de medio EB hasta una concentración final de 2.5 veces 10 a la 3ª celdas por mililitro.A continuación, agregue 2 mililitros de PBS al fondo de una placa de Petri bacteriana estéril de 10 centímetros por cultivo de gota colgante y transfiera la suspensión de EB a un recipiente de solución estéril. Ahora, retire la tapa de uno de los platos preparados y utilice una pipeta multicanal, equipada con seis puntas, para depositar cuidadosamente 60 gotas de 20 microlitros de suspensión EB en la superficie interior. Vuelva a colocar suavemente la tapa en la placa, teniendo cuidado de no desalojar las gotas colgantes y coloque las placas en la incubadora de cultivos celulares durante dos días.Para lavar el EB, retire con cuidado la tapa del cultivo de gotas colgantes e inclínela en un ángulo de 45 grados. A continuación, con una pipeta serológica de 5 mililitros que contenga medio EB a temperatura ambiente, lave suavemente los EB en un charco situado en la parte inferior de la tapa. Inspeccione cuidadosamente la tapa en busca de EB que estén pegados a la superficie, luego transfiera los EB a una placa de Petri de 6 centímetros sin recubrimiento.Regrese los EB a la incubadora de cultivo de tejidos durante otros dos días, revisando las placas diariamente para ver si hay agregación y adhesión de EB. Antes de enchapar los EB, reemplace el exceso de solución de recubrimiento de gelatina en cada pocillo de la placa de seis pocillos preparada, con 2 mililitros de medio de tratamiento Grem2 recién preparado a temperatura ambiente. A continuación, utilice una pipeta P1000 ajustada a 100 microlitros para transferir 30 EB a cada pocillo, y luego devuelva la placa a la incubadora durante la noche, dispersando uniformemente las células con un movimiento suave como se demuestra.Después de que los EB se hayan adherido al fondo de los pozos, reemplace el medio Grem2 cada dos días hasta el día 10. Luego, alimente las células con medio EB fresco cada dos días para mantener un cultivo celular saludable. Antes de su cultivo en gota colgante, las células madre pluripotentes deben ser compactas y estar libres de diferenciación espontánea.Si se observa una diferenciación espontánea, las células no deben utilizarse en los cultivos de gotas colgantes. La calidad EB generalmente se forma mejor dentro de gotas colgantes bien redondeadas y espaciadas uniformemente. En el segundo día de diferenciación, las EB deben ser visibles a simple vista, como arreglos esféricos de células madre diferenciadas en las puntas de las gotas colgantes.Al cuarto día, los EB bien formados deben flotar libremente y ser homogéneos en tamaño y forma. Una vez plateadas, las EB se aplanarán a medida que las células migren desde la EB a la superficie de la placa de cultivo de tejidos, como se observa aquí en los días de diferenciación ocho y 10. En los pozos de control no tratados, se observan pequeños parches que se contraen lentamente desde el sexto día y hasta el día nueve.Mientras que en los pozos tratados con Grem2, son comunes los parches grandes con una tasa de contracción relativamente rápida. El análisis RT-QPCR de la expresión génica en las células diferenciadas suele revelar altos niveles de genes estructurales y reguladores cardíacos en los cultivos tratados con Grem2. Si se utiliza la línea celular nuclear alfa-MHC DsRed, el aumento del rendimiento de cardiomiocitos se observa como un mayor número de núcleos marcados con DsRed en los pocillos tratados con Grem2.El tratamiento con Grem2 también sesga la diferenciación hacia un fenotipo similar al auricular, como lo confirman las mediciones de RT-QPCR y patch clamp de la duración del potencial de acción celular. Una vez dominadas, las células madre diferenciadoras se pueden tratar con Grem2 en tan solo 60 minutos y las células de perlas generalmente se observan ya al séptimo día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar constantemente Grem2 al cuarto día después de la máxima expresión de marcadores de gastrulación como brachyury.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electrofisiología y la QPCR para comprender las características funcionales y moleculares de las células que se han generado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cardiomiocitos auriculares a partir de ESC de ratón, utilizando Grem2.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

En este protocolo, se ilustrará la derivación de células progenitoras cardíacas a partir de células madre embrionarias de ratón y humanas. Una estrategia importante en este protocolo es enriquecer las células progenitoras cardíacas con citometría de flujo utilizando reporteros fluorescentes diseñados en las líneas de células madre embrionarias.

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Aquí, presentamos un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos robusto, rápido y escalable para células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Los cardiomiocitos obtenidos mediante este método a gran escala pueden proporcionar un número de células suficiente para su uso eficaz en el modelado de enfermedades cardiovasculares humanas, el cribado de fármacos de alto rendimiento y las posibles aplicaciones clínicas.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

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Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.

In Vitro Generación de Células Progenitoras Cardíacas específicas de Mouse Field

Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.

Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

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Aprende a generar cardiomiocitos auriculares homogéneos a partir de células madre embrionarias de ratón utilizando el factor Grem2. Este protocolo mejora el rendimiento y facilita el estudio de arritmias auriculares.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

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