La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

El objetivo general de este protocolo de diferenciación es generar poblaciones homogéneas de cardiomiocitos auriculares en cultivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades cardíacas como la arritmia auricular. Las principales ventajas de esta técnica son que produce cultivos homogéneos de cardiomiocitos auriculares in vitro y que se puede realizar con un entrenamiento mínimo.

Hasta cuatro días antes de configurar las células madre embrionarias de ratón, o cultivos de mESC, codifique placas de tejido de 10 centímetros con 5 mililitros de solución de gelatina al 0,2% cada una, en placas de seis pocillos con 1 mililitro de gelatina por pocillo en una campana de cultivo de tejidos esterilizada. El día del cultivo, retire la solución de gelatina adicional y agregue 10 mililitros de medio a uno de los platos de 10 centímetros cubiertos de gelatina. Luego, use criotongs para agitar suavemente un vial de 1 por 10 a los 6 mESC en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo en el centro del vial.

Seque el vial con una toallita desechable sin pelusa y esterilícelo con etanol al 70%. A continuación, coloque el vial en la campana de cultivo de tejidos y utilice una pipeta P1000 para añadir los ESC a la placa. Coloque las células en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y mueva suavemente la placa de adelante hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente las células.

Al final de la incubación, utilice un microscopio de campo claro para confirmar la unión de las células. Se observarán algunos escombros y células muertas. Reemplace el medio con 10 mililitros de medio mESC fresco y devuelva las células a la incubadora.

Cuando el cultivo sea 60 a 70% confluente, enjuague la placa con 5 mililitros de DPBS estéril sin magnesio ni calcio, e incube las células en 2 mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Mientras las células se incuban, aspire el exceso de solución de gelatina de un nuevo plato de 10 centímetros por cultivo pasado y agregue 10 mililitros de medio a cada placa. A continuación, recoja las células desprendidas por centrifugación en un tubo de 15 mililitros y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio mESC.

Dependiendo de la relación de división deseada, agregue de 0,5 a 1 mililitro de suspensión celular a cada plato de 10 centímetros y devuelva las celdas a la incubadora, distribuyendo suavemente las celdas en cada plato como se acaba de demostrar. Cuando las células transitadas sean confluentes en un 70%, sepárelas con tripsina EDTA como se acaba de demostrar, luego vuelva a suspender la suspensión de una sola célula en 5 mililitros de cuerpo embrioide o medio EB. Cuente los mESC y luego dilúyalos en el volumen apropiado de medio EB hasta una concentración final de 2.5 veces 10 a la 3ª celdas por mililitro.

A continuación, agregue 2 mililitros de PBS al fondo de una placa de Petri bacteriana estéril de 10 centímetros por cultivo de gota colgante y transfiera la suspensión de EB a un recipiente de solución estéril. Ahora, retire la tapa de uno de los platos preparados y utilice una pipeta multicanal, equipada con seis puntas, para depositar cuidadosamente 60 gotas de 20 microlitros de suspensión EB en la superficie interior. Vuelva a colocar suavemente la tapa en la placa, teniendo cuidado de no desalojar las gotas colgantes y coloque las placas en la incubadora de cultivos celulares durante dos días.

Para lavar el EB, retire con cuidado la tapa del cultivo de gotas colgantes e inclínela en un ángulo de 45 grados. A continuación, con una pipeta serológica de 5 mililitros que contenga medio EB a temperatura ambiente, lave suavemente los EB en un charco situado en la parte inferior de la tapa. Inspeccione cuidadosamente la tapa en busca de EB que estén pegados a la superficie, luego transfiera los EB a una placa de Petri de 6 centímetros sin recubrimiento.

Regrese los EB a la incubadora de cultivo de tejidos durante otros dos días, revisando las placas diariamente para ver si hay agregación y adhesión de EB. Antes de enchapar los EB, reemplace el exceso de solución de recubrimiento de gelatina en cada pocillo de la placa de seis pocillos preparada, con 2 mililitros de medio de tratamiento Grem2 recién preparado a temperatura ambiente. A continuación, utilice una pipeta P1000 ajustada a 100 microlitros para transferir 30 EB a cada pocillo, y luego devuelva la placa a la incubadora durante la noche, dispersando uniformemente las células con un movimiento suave como se demuestra.

Después de que los EB se hayan adherido al fondo de los pozos, reemplace el medio Grem2 cada dos días hasta el día 10. Luego, alimente las células con medio EB fresco cada dos días para mantener un cultivo celular saludable. Antes de su cultivo en gota colgante, las células madre pluripotentes deben ser compactas y estar libres de diferenciación espontánea.

Si se observa una diferenciación espontánea, las células no deben utilizarse en los cultivos de gotas colgantes. La calidad EB generalmente se forma mejor dentro de gotas colgantes bien redondeadas y espaciadas uniformemente. En el segundo día de diferenciación, las EB deben ser visibles a simple vista, como arreglos esféricos de células madre diferenciadas en las puntas de las gotas colgantes.

Al cuarto día, los EB bien formados deben flotar libremente y ser homogéneos en tamaño y forma. Una vez plateadas, las EB se aplanarán a medida que las células migren desde la EB a la superficie de la placa de cultivo de tejidos, como se observa aquí en los días de diferenciación ocho y 10. En los pozos de control no tratados, se observan pequeños parches que se contraen lentamente desde el sexto día y hasta el día nueve.

Mientras que en los pozos tratados con Grem2, son comunes los parches grandes con una tasa de contracción relativamente rápida. El análisis RT-QPCR de la expresión génica en las células diferenciadas suele revelar altos niveles de genes estructurales y reguladores cardíacos en los cultivos tratados con Grem2. Si se utiliza la línea celular nuclear alfa-MHC DsRed, el aumento del rendimiento de cardiomiocitos se observa como un mayor número de núcleos marcados con DsRed en los pocillos tratados con Grem2.

El tratamiento con Grem2 también sesga la diferenciación hacia un fenotipo similar al auricular, como lo confirman las mediciones de RT-QPCR y patch clamp de la duración del potencial de acción celular. Una vez dominadas, las células madre diferenciadoras se pueden tratar con Grem2 en tan solo 60 minutos y las células de perlas generalmente se observan ya al séptimo día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar constantemente Grem2 al cuarto día después de la máxima expresión de marcadores de gastrulación como brachyury.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electrofisiología y la QPCR para comprender las características funcionales y moleculares de las células que se han generado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cardiomiocitos auriculares a partir de ESC de ratón, utilizando Grem2.