Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

El objetivo general de este procedimiento de disección de huesos largos y aislamiento de médula ósea es extirpar rápida y sistemáticamente los huesos largos y recolectar la médula ósea para su posterior análisis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biología de la médula ósea, la metástasis del cáncer y la inmunología. La principal ventaja de esta técnica es que el proceso de disección es rápido y estandarizado, el procedimiento de aislamiento de la médula ósea es bastante estéril, comience colocando el ratón en posición supina.

A continuación, sujete las cuatro almohadillas de las patas por debajo de la articulación del tobillo y rocíe el ratón con etanol al 70%, mojando bien las patas. A continuación, haga una pequeña incisión a la derecha de la línea media en la parte inferior del abdomen, justo por encima de la cadera, y extienda la incisión por la pierna y más allá de la articulación del tobillo. Retira la piel.

A continuación, corte el músculo cuádriceps anclado al extremo proximal del fémur para exponer la cara anterior del fémur, y sujete el músculo desde la pierna con el alfiler en un ángulo de 45 grados con respecto a la tabla. Con las tijeras contra la parte posterior del fémur, corte los isquiotibiales de la articulación de la rodilla. A continuación, tire hacia atrás de la piel y los músculos isquiotibiales anclados al extremo proximal del fémur para exponer la parte posterior del hueso y sujete los músculos isquiotibiales de la pierna, colocando el clavo en un ángulo de 45 grados.

Con las pinzas, agarre el extremo distal del fémur justo por encima de la articulación de la rodilla. A continuación, guíe las hojas de las tijeras a ambos lados de la diáfisis femoral hacia la articulación de la cadera. Después de llegar a la cabeza femoral, gire las tijeras, moviendo la hoja superior directamente sobre la cabeza femoral para dislocar el fémur.

Ahora agarre la parte superior de la diáfisis femoral con las pinzas y corte el tejido blando de la cabeza femoral para liberar el fémur del acetábulo. A continuación, tire de todo el hueso de la pierna, incluidos el fémur, la rodilla y la tibia, hacia arriba y lejos del cuerpo, y corte con cuidado el tejido conectivo y el músculo que une la pierna a la piel. Cuando se haya extirpado todo el tejido conectivo, extienda demasiado la articulación del tobillo y gire las tijeras como se acaba de demostrar para dislocar la tibia.

Agarrando el extremo distal de la tibia y teniendo cuidado de no cortar los tendones, tire de la tibia hacia arriba y lejos del cuerpo y del tablero de alfileres. A continuación, extirpe cualquier tejido conectivo restante unido al hueso largo de la rodilla y cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido al fémur y la tibia. Para preparar el hueso largo para el aislamiento de la médula, agarre el fémur con la rótula hacia atrás y la cabeza femoral hacia abajo.

Extiende demasiado la articulación de la rodilla y gira las tijeras para dislocar la tibia del fémur. A continuación, extirpa cualquier tejido conectivo que mantenga unidos el fémur y la tibia. A continuación, agarre el fémur con la cara anterior hacia afuera y la cabeza femoral hacia abajo, y guíe las tijeras por la diáfisis femoral hasta los cóndilos.

Gire suavemente las tijeras hacia adelante y hacia atrás para quitar los cóndilos, la rótula y la epífisis, exponiendo la metáfisis. Luego, use las pinzas, las tijeras y las toallitas Kimwipes para eliminar cualquier músculo o tejido conectivo adicional adherido al fémur. A continuación, agarre la tibia con la cara anterior hacia afuera y el extremo del tobillo hacia abajo.

Si la epífisis tibial está intacta, guíe las tijeras por la diáfisis de la tibia hasta los cóndilos y gire suavemente las tijeras hacia adelante y hacia atrás para eliminar los cóndilos y la epífisis, exponiendo la metáfisis tibial. A continuación, retire cualquier músculo o tejido conectivo adicional unido a la tibia, como se acaba de demostrar. Para recolectar la médula ósea, primero empuje una aguja de calibre 18 a través de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

A continuación, coloque los huesos largos en el tubo, con el extremo de la rodilla hacia abajo, y cierre la tapa. Anide el tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifuga los tubos a una potencia mayor o igual a 10.000 veces g en una microcentrífuga durante 15 segundos. Verifique que la médula ósea se haya extraído de los huesos mediante inspección visual.

Los huesos deben aparecer blancos y una bolita grande debe ser visible en el tubo más grande. A continuación, deseche los huesos en el tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros y suspenda la médula ósea en la solución adecuada para el análisis posterior deseado. Esta técnica de disección rápida es adecuada para una serie de análisis posteriores, como la histomorfometría y la histología.

De hecho, como lo demuestra esta reconstrucción histomorfométrica representativa en micro-CT 3D, tanto el hueso esponjoso como la capa cortical se mantienen, lo que permite una cuantificación precisa de los parámetros estructurales estandarizados para la histomorfometría ósea. En esta sección histológica representativa de una tibia formal teñida con H y E y fija y descalcificada, se puede observar el mantenimiento de la integridad tanto del hueso calcificado como de la médula ósea celular para el análisis histológico. Además, la médula ósea aislada por este procedimiento es adecuada para muchas aplicaciones posteriores, incluido el cultivo celular primario de osteoclastos u osteoblastos.

Una vez dominada, la técnica puede completarse en unos siete minutos, desde la disección de huesos largos hasta el aislamiento de la médula ósea, si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante recordar colocar el ratón para facilitar la disección. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como FACS u otros procesos de células individuales para responder preguntas adicionales sobre las alteraciones en las poblaciones de células de la médula ósea.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar rápidamente los huesos largos de ratones y aislar la médula ósea por centrifugación.