Name: Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a diseccionar huesos largos de miembros posteriores en ratones y aislar médula ósea por centrifugación rápida. Este método estandarizado preserva la integridad tisular para análisis histológicos y cultivos celulares.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del NCI nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 y CA143055 a K.J.P. Los autores agradecen a los miembros actuales y pasados del laboratorio de Weilbaecher, especialmente a Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla y Hongju Deng, y a los miembros del Instituto Urológico Brady, especialmente a los miembros del laboratorio Pienta por la lectura crítica del manuscrito.

Todos los animales de trabajo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de acuerdo con las recomendaciones descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. La disección 1. extremidad posterior del hueso largo <ol><li> La eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Coloque el ratón en una posición supina y colocar fijando las cuatro patas a través de las almohadillas de las patas del ratón debajo de la articulación del tobillo. </li><li> Pulverizar el ratón con un 70% de etanol, rociar a fondo las piernas. </li><li> Hacer una pequeña incisión a la derecha de la línea media en el abdomen inferior, justo por encima de la cadera. </li><li> Extender la incisión en la pierna y más allá de la articulación del tobillo. </li><li> Tire hacia atrás la piel y cortar el músculo cuádriceps anclado al extremo proximal del fémur para exponer la cara anterior del fémur y el pasador hacia fuera de la pierna, colocando el pasador en un ángulo de 45 grados con respecto a la placa. </li><li> Con el blade de la tijera contra el lado posterior del fémur, cortar los tendones de la corva lejos de la articulación de la rodilla. </li><li> Tirar de la piel y los músculos isquiotibiales anclados al extremo proximal del fémur para exponer el lado posterior del fémur y el pasador hacia fuera de la pierna, colocando el pasador en un ángulo de 45 grados con respecto a la placa. </li><li> Con las pinzas, mantenga el extremo distal del fémur, justo por encima de la articulación de la rodilla. Guía de las cuchillas de las tijeras a cada lado del eje femoral hacia la articulación de la cadera, teniendo cuidado de no cortar en la propia fémur. </li><li> Después de alcanzar la cabeza del fémur, indicado por las tijeras se abren ligeramente, torcer la tijera con la hoja superior de la tijera se mueven directamente sobre la cabeza del fémur para dislocar el fémur, con cuidado de no romper el hueso debajo de la cabeza del fémur. </li><li> Agarre la parte superior del eje femoral con el fórceps, cortar el tejido blando lejos de la cabeza femoral para liberarla de acetábulo. </li><li> Tire todo el hueso de la pierna, incluyendofémur, la rodilla, y la tibia, arriba y lejos del cuerpo, cuidadosamente cortar el tejido conectivo y muscular que conecta la pierna a la piel. </li><li> Extender demasiado la articulación del tobillo y otra vez utilizar las tijeras en un movimiento giratorio para dislocar la tibia. </li><li> Agarrando el extremo distal de la tibia, teniendo cuidado de no cortar los tendones, tire de la tibia hacia arriba y lejos del cuerpo y el tablón de anuncios. </li><li> Cortar cualquier tejido conectivo restante fijar el hueso largo para el ratón en la rodilla. </li><li> Eliminar cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido al fémur y la tibia. </li><li> Para las aplicaciones que requieren que el hueso se mantienen intactos (histología, la histología, las pruebas biomecánicas, etc.), Proceder con protocolos estándar en la casa (como en el 4-7). Para aislar la médula ósea, pase a la sección 2. </li></ol> 2. Preparación de hueso largo de médula ósea Aislamiento <ol><li> Usando las pinzas, agarre el fémur con la rótula de espaldas a unand el extremo proximal (cabeza femoral) hacia abajo. </li><li> Extender demasiado la articulación de la rodilla y el uso de las tijeras en un movimiento giratorio para dislocar la tibia y el fémur. </li><li> Cortar cualquier tejido conectivo que sostiene el fémur y la tibia juntos. </li><li> El uso de las pinzas, sujete el fémur con el lado anterior de espaldas y el extremo proximal (extremo de la cabeza femoral) hacia abajo. </li><li> Guiar la tijera hasta la diáfisis femoral a los cóndilos. </li><li> gire suavemente las tijeras de ida y vuelta para eliminar los cóndilos, la rótula y la epífisis para exponer la metáfisis. </li><li> Retire cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido al fémur usando fórceps, tijeras y Kimwipes. </li><li> El uso de las pinzas, sujete la tibia con el lado anterior de espaldas y el extremo distal (extremo de tobillo) hacia abajo. </li><li> Si la epífisis tibial está intacto, guiar a las tijeras de la diáfisis de la tibia de los cóndilos. </li><li> gire suavemente las tijeras de ida y vuelta para eliminar los cóndilos y la epífisis para exponer el metaphanalysis. </li><li> Retire cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido a la tibia utilizando fórceps, tijeras y Kimwipes. </li></ol> Aislamiento 3. médula ósea <ol><li> Empuje una aguja de 18 G a través de la parte inferior de un tubo de 0,5 ml de microcentrífuga. </li><li> Coloque los huesos largos (máximo de 2 fémures y tibias 2) en el tubo, hasta la rodilla extremo hacia abajo termina hacia abajo y cierre la tapa. </li><li> Nido del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar los tubos anidados en ≥10,000 xg en una microcentrífuga durante 15 segundos. </li><li> Compruebe que la médula ósea se ha hecho girar hacia fuera de los huesos mediante inspección visual. Los huesos deben aparecen de color blanco y no debe haber una gran pastilla visual en el tubo más grande. </li><li> Desechar el tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con los huesos. </li><li> Suspender la médula ósea en solución apropiada (por ejemplo, PBS, medios de cultivo, tampón FACS) y proceder con el protocolo experimental (DNA, RNA, o el aislamiento de proteínas,análisis FACS, o cultivo de células primarias). </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
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<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos un método simple y eficiente para la eliminación de los huesos largos posteriores del ratón y el posterior aislamiento de la médula ósea. Este método mantiene la alta integridad estructural y celular de los huesos y la médula ósea y tiene un bajo tiempo de manejo, lo que minimiza la probabilidad de fractura inducida por el usuario o puntuación ósea que puede influir en los análisis posteriores. Además, el método de centrifugación para aislar la médula ósea no requiere cortar el hueso para exponer el espacio de la médula ósea o el líquido para enjuagar la médula ósea, lo que reduce los posibles puntos de contaminación. Además, la técnica de centrífuga tiene un rendimiento relativamente alto con un tiempo de manipulación más bajo que otros métodos, lo que reduce el tiempo de procesamiento.
La alta variación es inherente a los estudios in vivo con ratones debido a la alta variación fenotípica de ratón a ratón. Para maximizar el impacto en la investigación de los estudios con ratones, costosos y laboriosos, es fundamental minimizar el error experimental técnico9,10. El tiempo desde el sacrificio de animales hasta el análisis posterior o la fijación de tejidos introduce variaciones experimentales que pueden superar cambios sutiles y reducir grandes diferencias entre grupos. Por lo tanto, el procesamiento rápido de las muestras es esencial para un análisis preciso de los datos. Las técnicas de disección de huesos largos y aislamiento de médula ósea descritas aquí están optimizadas para el procesamiento rápido de animales y muestras para reducir la variación técnica.
Este protocolo se puede aplicar ampliamente a muchos campos de investigación, incluida la investigación del tejido óseo en sí o el interrogatorio de las células de la médula ósea. Además, este enfoque sencillo de la disección de huesos largos permitirá a los investigadores en campos relacionados interrogar directamente las contribuciones óseas para ampliar nuestro conocimiento de la disfunción de la médula ósea en patologías poco estudiadas.

El estudio de los huesos largos y las células de la médula ósea es fundamental para una miríada de disciplinas de investigación, que incluyen, entre otras, la biología ósea, la biología del cáncer, la inmunología, la hematología y la biomecánica. El hueso es un órgano altamente dinámico que, junto con el cartílago, forma el esqueleto para proporcionar soporte mecánico contra la carga y protección de los órganos internos. Además, los componentes minerales del hueso son un sumidero de almacenamiento para las moléculas de señalización críticas calcio y fósforo, así como para otros factores1. Por último, los huesos albergan la médula ósea y, junto con los osteoblastos formadores de hueso metabólicamente activos y los osteoclastos reabsorbentes de hueso, proporcionan el nicho de células madre necesario para el mantenimiento de las poblaciones de células hematopoyéticas y linfoides.
El hueso y la médula ósea se ven afectados en muchos trastornos, lo que a menudo conduce a la disfunción de la médula ósea, dolor óseo severo y fractura patológica. El hueso es un sitio común de metástasis en muchos tumores sólidos, sobre todo en el cáncer de mama y el cáncer de próstata, donde las células tumorales interactúan directamente con el nicho de la médula ósea para iniciar el círculo vicioso de la metástasis ósea y desplazar a las células madre hematopoyéticas2,3. Las neoplasias malignas hematopoyéticas, como el mieloma y la leucemia, se caracterizan por una disfunción de la médula ósea, así como por una desregulación del remodelado óseo sano1. Otros trastornos esqueléticos no malignos también son áreas activas de investigación, como la osteoartritis, la osteoporosis, la escoliosis y el raquitismo. Incluso en un individuo sano, la falla biomecánica en un hueso conduce a una fractura dolorosa. Todos estos trastornos representan áreas activas de investigación con el objetivo de identificar nuevas medidas preventivas y regímenes de tratamiento para reducir la morbilidad y la mortalidad.
Para investigar la plétora de funciones del hueso y la médula ósea, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, es fundamental que los investigadores dispongan de un método estandarizado simple y eficiente para la disección de los huesos largos del ratón para el procesamiento rápido de grandes experimentos in vivo. El protocolo de disección descrito aquí es adecuado para todos los análisis de huesos largos, incluidas las imágenes ex vivo, la histología, la histomorfometría y las pruebas de resistencia, entre otros. Del mismo modo, un método estandarizado de aislamiento de médula ósea con una alta recuperación de células de médula ósea y una baja variabilidad entre usuarios es importante para el análisis experimental, como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la PCR cuantitativa (qPCR), así como para aplicaciones posteriores, como el cultivo celular primario de células de médula ósea.

<table><tbody>Pines <tr><td>de tablero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td></tr> alfileres <tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinza</td><td></td><td></td><td></td>de disección</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr>Aguja <td></td><td></td><td></td>de<td>16 G 1,5</td></tr><tr><td>ml Tubo</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>0,5 ml Tubo</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murino hind limb largo bone la disección y el aislamiento de médula ósea

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

La investigación del hueso y la médula ósea es crítica en muchos campos de investigación, incluyendo la biología ósea básica, la inmunología, la hematología, la metástasis del cáncer, la biomecánica y la biología de las células madre. Sin embargo, a pesar de la importancia del hueso en estados sanos y patológicos, es un órgano poco investigado debido a la falta de conocimientos especializados sobre la disección ósea y el aislamiento de la médula ósea. Los ratones son un organismo modelo común para estudiar los efectos sobre el hueso y la médula ósea, lo que requiere un método estandarizado y eficiente para la disección de huesos largos y el aislamiento de la médula ósea para el procesamiento de grandes cohortes experimentales. Describimos un procedimiento de disección sencillo para la extirpación del fémur y la tibia que es adecuado para aplicaciones posteriores, que incluyen, entre otras, el análisis histomorfológico y las pruebas de fuerza. Además, describimos un procedimiento rápido para el aislamiento de la médula ósea de los huesos largos mediante centrifugación con un tiempo de manipulación limitado, ideal para la clasificación de células, el cultivo primario de células o la extracción de ADN, ARN y proteínas. El protocolo está optimizado para el procesamiento rápido de muestras para limitar el error experimental y está estandarizado para minimizar la variabilidad de usuario a usuario.

El protocolo descrito aquí está optimizado para una rápida disección del fémur y la tibia de ratón con un mínimo de daños en el tejido óseo. Esta técnica es adecuado para un número de análisis aguas abajo, incluyendo estudios de biomecánica, histomorfometría (Figura 1A - B), y la histología (Figura 1C) de 4,7. El representante histomophometric reconstrucción micoCT 3D (Figura 1A - B) demuestra que tanto el hueso esponjoso y cortical shell se mantienen que permite la cuantificación exacta de los parámetros estructurales normalizados para la histomorfometría de hueso, incluyendo el número trabecular, el grosor, y el espaciamiento; volumen de hueso; y el grosor cortical, entre otras medidas 8. El corte histológico muestra un representante fijado en formalina y descalcificadas tibia H &amp; E manchadas (Figura 1C). La imagen demuestra la integridad tanto de la b calcificadouno y la médula ósea celular para el análisis histológico. El procedimiento de aislamiento de la médula ósea conserva la esterilidad del espacio de la médula ósea, tiene baja manejo para reducir la contaminación, y no requiere el corte del hueso largo, reduciendo así la pérdida de rendimiento de la médula ósea. Esta médula ósea es conveniente para muchas aplicaciones posteriores, incluyendo citometría de flujo 5 y los análisis de PCR. Además, este procedimiento se puede utilizar para aislar de la médula ósea para el cultivo celular primario de células de médula ósea, incluyendo los osteoclastos y los osteoblastos (Figura 2A - B) 4,6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> Figura 1. histomorfológico y análisis histológicos de ratón hueso largo. MicroCT la reconstrucción tridimensional de una tibia de ratón que muestra (A) la concha cortical externa y (B </s<html> trong&gt;) hueso trabecular (barra de escala = 0,5 mm). (C) histológico tinción con HE de una tibia descalcificada y seccionada (4x). Imágenes cortesía de Katherine Weilbaecher, Facultad de Medicina, Universidad de Washington, EE.UU.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> Figura 2. Primaria de Médula Ósea cultivo celular para la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos. Tinción (A) para los osteoclastos multinucleadas TRAP después de 7 días en los medios de comunicación osteoclastogénicos (4x). (B) La fosfatasa alcalina (color púrpura) de los osteoblastos y rojo de alizarina (color rojo) para la mineralización de manchas después de 21 días en los medios de comunicación osteogénico. Imágenes cortesía de Katherine Weilbaecher, Facultad de Medicina, Universidad de Washington, EE.UU..iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí presentamos un protocolo para la disección de huesos largos de extremidades traseras (fémures y tibias) del ratón de laboratorio. Describimos además una técnica rápida para el aislamiento de la médula ósea de estos huesos que utiliza la centrifugación para la extracción de la médula ósea del espacio de la médula ósea.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

El objetivo general de este procedimiento de disección de huesos largos y aislamiento de médula ósea consiste en extraer de forma rápida y sistemática los huesos largos y recolectar la médula ósea para su posterior análisis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biología de la médula ósea, la metástasis del cáncer y la inmunología. La principal ventaja de esta técnica radica en que el proceso de disección es rápido y estandarizado, y el procedimiento de aislamiento de la médula ósea es bastante estéril. Comience colocando al ratón en posición supina.Luego sujete con alfileres las cuatro almohadillas de las patas por debajo de la articulación del tobillo y rocíe al ratón con etanol al 70%, empapando completamente las patas. A continuación, realice una pequeña incisión a la derecha de la línea media en la parte inferior del abdomen, justo por encima de la cadera, y extienda la incisión hacia abajo por la pata y más allá de la articulación del tobillo. Retrase la piel.Luego, corte el músculo cuádriceps anclado al extremo proximal del fémur para exponer la cara anterior del hueso del muslo, y sujete el músculo alejado de la pierna con una aguja en un ángulo de 45 grados respecto al tablero. Con las tijeras apoyadas en la cara posterior del fémur, corte los músculos isquiotibiales separándolos de la articulación de la rodilla. A continuación, retire la piel y los músculos isquiotibiales anclados al extremo proximal del fémur para exponer la cara posterior del hueso, y sujete los músculos isquiotibiales alejados de la pierna, colocando la aguja en un ángulo de 45 grados.Con la pinza, sujete el extremo distal del fémur justo por encima de la articulación de la rodilla. Luego, guíe las hojas de la tijera hacia ambos lados del eje femoral en dirección a la articulación de la cadera. Al llegar a la cabeza femoral, gire la tijera, moviendo la hoja superior directamente sobre la cabeza femoral para luxar el fémur.Ahora sujete la parte superior del eje femoral con la pinza y corte el tejido blando que rodea la cabeza del fémur para liberar el fémur del acetábulo. Luego, tire del hueso de la pierna completo, incluyendo el fémur, la rodilla y la tibia, hacia arriba y alejándolo del cuerpo, y corte cuidadosamente el tejido conectivo y el músculo que une la pierna a la piel. Cuando todo el tejido conectivo haya sido eliminado, hiperextienda la articulación del tobillo y gire las tijeras tal como se acaba de demostrar para luxar la tibia.Sujetando el extremo distal de la tibia y teniendo cuidado de no cortar los tendones, tire de la tibia hacia arriba y alejándola del cuerpo y de la tabla de alfileres. Luego, elimine cualquier tejido conectivo restante unido al hueso largo en la rodilla, así como cualquier músculo o tejido conectivo adicional adherido al fémur y a la tibia. Para preparar el hueso largo para el aislamiento de la médula, sostenga el fémur con la rótula orientada hacia afuera y la cabeza femoral orientada hacia abajo.Extienda excesivamente la articulación de la rodilla y gire las tijeras para luxar la tibia del fémur. Luego, elimine cualquier tejido conectivo que mantenga unidos el fémur y la tibia. A continuación, sujete el fémur con la cara anterior orientada hacia afuera y la cabeza femoral hacia abajo, y dirija las tijeras hacia arriba por el eje femoral hasta los cóndilos.Gire suavemente las tijeras de un lado a otro para retirar los cóndilos, la rótula y la epífisis, exponiendo así la metáfisis. A continuación, utilice la pinza, las tijeras y toallitas Kimwipes para eliminar cualquier músculo o tejido conectivo adicional adherido al fémur. Después, sujete la tibia con la cara anterior orientada hacia afuera y el extremo del tobillo hacia abajo.Si la epífisis tibial está intacta, guíe las tijeras hacia arriba por el eje de la tibia hasta los códilos y gire suavemente las tijeras de un lado a otro para retirar los códilos y la epífisis, exponiendo así la metáfisis tibial. A continuación, retire cualquier músculo adicional o tejido conectivo adherido a la tibia, como se acaba de demostrar. Para extraer la médula ósea, primero inserte una aguja de calibre 18 a través del fondo de un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros.Luego coloque los huesos largos en el tubo con el extremo de la rodilla hacia abajo y cierre la tapa. Encaje un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros dentro de un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue los tubos a mayor o igual que 10.000 ×g en una microcentrífuga durante 15 segundos. Verifique mediante inspección visual que la médula ósea haya sido separada de los huesos.Los huesos deben aparecer blancos, y debe ser visible un pellet grande en el tubo más grande. A continuación, deseche los huesos en el tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros y suspenda la médula ósea en la solución adecuada para el análisis posterior deseado. Esta técnica rápida de disección es adecuada para varios análisis posteriores, incluyendo histomorfometría e histología.De hecho, como se demuestra mediante esta reconstrucción tridimensional representativa de micro-TC histomorfométrica, se mantiene tanto el hueso esponjoso como el compartimento cortical, lo que permite una cuantificación precisa de los parámetros estructurales estandarizados para la histomorfometría ósea. En esta sección histológica representativa de una tibia fijada en formaldehído, decalcificada y teñida con H y E, puede observarse el mantenimiento de la integridad tanto del hueso calcificado como de la médula ósea celular para el análisis histológico. Además, la médula ósea aislada mediante este procedimiento es adecuada para múltiples aplicaciones posteriores, incluyendo el cultivo primario de osteoclastos u osteoblastos.Una vez dominada, la técnica puede completarse en aproximadamente siete minutos, desde la disección del hueso largo hasta el aislamiento de la médula ósea, si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante recordar posicionar al ratón para facilitar la disección. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo (FACS) u otros procesos a nivel de célula individual, para responder preguntas adicionales sobre alteraciones en las poblaciones celulares de la médula ósea.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar rápidamente los huesos largos de ratones y aislar la médula ósea mediante centrifugación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video describe un protocolo detallado para aislar médula ósea entera fresca de las extremidades traseras del ratón para investigar defectos completos de la MO en pacientes con trastornos sanguíneos como la leucemia.

Cosecha de médula ósea de la extremidad trasera del ratón

En este video, demostramos el aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea a partir de huesos largos de ratones. Las BMSC adherentes aisladas se pueden utilizar para un análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea de una tibia de ratón

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

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