Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

El objetivo general de este procedimiento es aislar ADN y ARN de alta calidad de los hisopos y luego determinar su composición bacteriana mediante la secuenciación del gen 16S rRNA. Este método puede ayudar a un investigador a identificar qué bacterias están contenidas en una muestra humana dada y determinar asociaciones entre bacterias particulares y las características del huésped o el estado de la enfermedad. Aunque este método fue diseñado para proporcionar información sobre las comunidades bacterianas vaginales humanas, el método también se puede aplicar para estudiar las comunidades bacterianas de otros sitios del cuerpo, como las narinas, la boca, la piel y el recto, y de otros organismos.

Tenga en cuenta que este video destaca las partes más complicadas del protocolo y no cubre la parte de secuenciación ni el análisis de secuenciación. Brittany Bowman, una técnica de mi laboratorio, hará una demostración. Comience este procedimiento con hisopos ectocervicales recolectados y almacenados en hielo húmedo como se describe en el documento adjunto.

En preparación para la extracción de ácido nucleico, limpie todas las superficies de la campana y todos los artículos que se traigan a la campana con lejía seguida de un descontaminante que elimine las ARNasas, las DNasas y el ADN. En la campana, coloque un tubo de abalorios por muestra. A cada tubo, agregue 500 microlitros de tampón NaCl-Tris-EDTA, 210 microlitros de SDS al 20% y 500 microlitros de alcohol fenol cloroformo isoamílico.

El manejo cuidadoso de los hisopos es fundamental para obtener resultados claros con este protocolo. Se necesita un poco de práctica para transferir el hisopo sin que se caiga y es más fácil si usa un hisopo de eje hueco como este. Con pinzas estériles, transfiera el hisopo del vial de transporte al tubo de abalorio.

Frote bien la cabeza del hisopo contra las paredes internas del tubo durante al menos 30 segundos. Coloque el tubo sobre hielo. A continuación, cambie los guantes y repita el procedimiento de hisopado con la siguiente muestra.

Una vez que todas las muestras se hayan frotado vigorosamente, permita que se enfríen en hielo durante al menos 10 minutos. Una vez transcurridos 10 minutos para retirar el hisopo, sujete el mango con unas pinzas estériles y, con una punta P200 limpia, presione la cabeza contra el interior de la pared del tubo. Este proceso libera líquido del hisopo, aumentando la recuperación de ácido nucleico.

Coloque el tubo de abalorio en el rebordeador de perlas y homogeneice la muestra durante dos minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar el tubo de abalorios a 6.000 g y cuatro grados centígrados durante tres minutos para pellet los residuos y separar las fases acuosa y fenólica. Después del giro, generalmente se pueden ver tres fases.

La capa superior es la fase acuosa, que contiene el ADN y el ARN. La capa inferior es la fase orgánica, que contiene lípidos y restos de las células y los hisopos. La fina capa intermedia blanca, llamada interfase, contiene proteínas.

Transfiera la fase acuosa, de unos 500 a 600 microlitros, a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Añadir un volumen igual de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico. Mezcla por inversión y vórtice breve.

Centrifuga el tubo durante cinco minutos. Después del centrifugado, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo estéril de 1,5 mililitros. Tenga cuidado de no transferir material de la interfase o de la fase fenol subyacente.

Anote el volumen transferido y guarde la fase fenol para el futuro aislamiento de proteínas. A continuación, agregue 0,8 volumen de isopropanol y 0,1 volumen de acetato de sodio de tres molares. Mezclar bien por inversión y vórtice brevemente.

Precipite el ácido nucleico enfriando el tubo a 20 grados centígrados durante al menos dos horas y hasta toda la noche. Después de la precipitación, centrifugar el tubo durante 30 minutos. Después del centrifugado, use con cuidado una pipeta para eliminar el sobrenadante, dejando el pellet intacto.

Agregue 500 microlitros de etanol 100%. Desaloje el pellet con un suave vórtice o pipeteo sin tocar el pellet. Centrifugar durante cinco minutos.

Con una pipeta P10, retire y deseche la mayor cantidad de etanol posible sin alterar el pellet. Seque el pellet al aire a temperatura ambiente durante 15 minutos. Vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de tampón UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

Deje que la muestra se enfríe en hielo durante 10 minutos y pipetee repetidamente para garantizar una resuspensión completa. Mida la concentración de ácido nucleico con un espectrofotómetro. Si lo desea, separe el ADN del ARN utilizando un kit de limpieza de columna siguiendo el protocolo del fabricante.

La configuración de PCR es un paso crítico en este procedimiento. Es muy importante minimizar la contaminación garantizando la esterilidad de los reactivos, la campana de PCR y los guantes. Trabaje rápido pero con cuidado y use la técnica adecuada al mover artículos dentro y fuera del capó.

Coloque un estante de enfriamiento de sobremesa limpio para tubos de microcentrífuga y un enfriador de placas PCR en la campana. Etiquete los tubos de tiras de 8 pocillos con tapas individuales y colóquelos en el enfriador de PCR. La amplificación debe realizarse por triplicado y se debe incluir un control de agua sin plantilla para cada par de cebadores.

Coloque un tubo de microcentrífuga en el enfriador para la mezcla maestra. Luego, para cada muestra, combine agua UltraPure, tampón HF 5X, DNTP, cebador directo 515F y 3% DMSO como se describe en el documento adjunto. A continuación, añada la polimerasa a la mezcla maestra y mezcle pipeteando.

Al primer pocillo, agregue 90 microlitros de la mezcla maestra y dos microlitros de la imprimación inversa, mezcle bien. Luego, al cuarto pozo, que sirve como control sin plantilla, agregue 23 microlitros del maestro y dos microlitros de agua y mezcle. A continuación, añada seis microlitros de la muestra adecuada al primer pocillo.

Mezcle bien y transfiera 25 microlitros al segundo pocillo. Cambie las puntas, luego transfiera otros 25 microlitros del primer pozo al tercer pozo. Tape firmemente todos los pozos.

Tenga cuidado de no tocar el interior de los pozos o la tapa. A continuación, repita este proceso para cada muestra. Una vez que todas las muestras estén preparadas, gire rápidamente los tubos de tira, transfiéralos a un termociclador y ejecute el programa.

Una vez completada la carrera, gire rápidamente los tubos para recoger el líquido de las paredes. A continuación, en una mesa de laboratorio limpia, combine las reacciones de PCR triplicadas de cada muestra en un tubo de microcentrífuga estéril etiquetado. Transfiera 25 microlitros de cada control sin plantilla a un tubo estéril separado.

No combine amplicones de diferentes muestras todavía. Para validar el éxito de la amplificación por PCR, cargue cinco microlitros de cada muestra en un gel de agarosa al 1,5% y realice la electroforesis a 120 voltios durante 30 a 60 minutos. Vea el gel bajo luz ultravioleta.

Verifique la amplificación exitosa de cada muestra observando una sola banda fuerte alrededor de 380 pares de bases. Si hay una banda doble, vuelva a amplificar la muestra con un código de barras inverso diferente. Si no hay ninguna banda, vuelva a amplificar la muestra utilizando el mismo código de barras inverso o un cebador con un nuevo código de barras inverso.

Si la reamplificación no tiene éxito, es posible que haya inhibidores de PCR en la muestra, en cuyo caso, realice una limpieza de ADN basada en columna para eliminar los inhibidores de PCR. Almacene los 70 microlitros restantes de amplicón a 20 grados centígrados. Deseche los 20 microlitros restantes del control sin plantilla, suponiendo que no produjo una banda.

Para crear la piscina de amplicones, combine de dos a cinco microlitros de cada amplicón en un solo tubo estéril. Si la banda de una muestra es débil, agregue el doble del volumen en relación con el resto de las muestras. A continuación, retire los cebadores de PCR con un kit.

Si corresponde, combine los grupos de amplicones sin cebadores para crear la biblioteca final. Determine la concentración de ADN de la biblioteca utilizando un espectrofotómetro o un sistema fluorométrico. Finalmente, diluir las muestras a dos nanomolares y enviarlas para su secuenciación.

En el documento adjunto se proporciona información detallada sobre el análisis de secuencias. Se aisló ADN y ARN de alta calidad y el ADN se utilizó como molde para la amplificación por PCR de la región V4 del gen 16S rRNA, como se describe en este video. Se utilizó electroforesis en gel para confirmar la presencia de una sola banda de alrededor de 380 pares de bases en cada muestra que se amplificó con plantilla.

Los controles sin plantilla que se ejecutan en paralelo con el mismo par de cebadores no tenían una banda presente. A continuación, los amplicones de PCR se combinaron en un solo tubo, se cuantificaron y se diluyeron antes de la secuenciación. Aquí se muestra un gráfico de barras representativo de las puntuaciones de calidad de la secuencia en cada posición de la lectura.

Es normal que la calidad de la secuencia disminuya después de 200 pares de bases. Pero la puntuación media de calidad debe mantenerse por encima de 30. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el ADN y el ARN de los hisopos mediante una extracción basada en cloroformo de fenol, amplificar la región V4 del gen de ARN ribosómico 16SR y preparar una biblioteca para la secuenciación de alto rendimiento.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener mucho cuidado para evitar la contaminación durante la recolección de muestras, la extracción de ácidos nucleicos y la amplificación por PCR. No olvide que trabajar con cloroformo de fenol puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar con una capucha ventilada y usar guantes impermeables, gafas de seguridad con protectores laterales y una bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.