La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

El objetivo general de este procedimiento experimental es demostrar el uso de un sistema biocatalítico acoplado de células completas inmovilizadas en perlas de alginato para mejorar el rendimiento de producción y la reutilización. Este es mi tema de estudio, en el que he respondido preguntas clave en el campo de la biocatálisis, como la inmovilización de biocatalizadores, estabilidad, regeneración de cofactores y biocatalizadores de células completas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque sencillo pero flexible para mejorar la producción de muchas biomoléculas importantes mediante vías dependientes de cofactores.

Se utilizan dos cepas recombinantes de E coli en este protocolo. SpNOx E coli, que expresa NADH oxidasa, y HjLAD E coli, que expresa L-arabinitol deshidrogenasa. Dado que este procedimiento es el mismo para ambas cepas de E coli, solo se demostrará con HjLAD E coli.

Inocular una colonia individual de E. coli HjLAD en tres mililitros de medio LB, suplementado con 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar durante la noche en un agitador-incubadora. Al día siguiente, diluir el cultivo uno a 100 en 200 mililitros de LB fresco que contenga 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar a 37 grados Celsius a 250 RPM hasta que la DO 600 alcance aproximadamente 0,6. Inducir la expresión de la proteína HjLAD añadiendo IPTG 0,1 milimolar al medio de cultivo e incubar a 25 grados Celsius, 200 RPM, durante seis horas.

Recolecte las células inducidas mediante centrifugación a 3200 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y continúe con el procesamiento del botón celular como se muestra en el siguiente segmento. Para comenzar este procedimiento, suspendemos los botones celulares de HjLAD E coli y SpNox E coli por separado en tampón Tris-HCl 50 milimolar, a una densidad celular de cinco gramos de peso seco de células por litro.

En un tubo redondo de fondo plano de 14 mililitros, mezcle 600 microlitros de E. coli HjLAD al cinco gramos de peso seco de células por litro, 600 microlitros de E. coli SpNOx al cinco gramos de peso seco de células por litro, 100 microlitros de NAD⁺ 20 milimolar y 150 microlitros de L-arabinitol 2 molar. Ajuste el volumen de la reacción a 2 mililitros añadiendo 550 microlitros de Tris-HCl 50 milimolar. Incube la mezcla de reacción a 30 grados Celsius y 200 RPM durante ocho horas.

Después de ocho horas, centrifugue la mezcla a 3200 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos, y recoja el sobrenadante de la reacción. Para cuantificar la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, aspire 100 microlitros del sobrenadante recolectado hacia un tubo de 1,5 mililitros. Añada 50 microlitros de cisteína al 1,5 %, 900 microlitros de ácido sulfúrico al 70 % y 50 microlitros de Kar-Piz-All al 0,1 % disuelto en etanol, y mezcle suavemente invirtiendo el tubo tres veces.

Incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 20 minutos. Mida la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Comience el protocolo de inmovilización preparando una solución de alginato al 4%.

Añada 0,8 gramos de alginato de sodio a 20 mililitros de agua destilada y caliente la mezcla para disolver el alginato de sodio. Añada 600 microlitros de E. coli HjLAD a cinco gramos de peso seco de célula por litro y 600 microlitros de E. coli SpNOx a cinco gramos de peso seco de célula por litro a 1,2 mililitros de la solución de alginato al 4%. Mezcle las células y el alginato mediante pipeteo suave para evitar la formación de burbujas.

Para garantizar la formación de perlas de alginato con tamaño, morfología y rigidez uniformes, es fundamental agregar la suspensión de células en alginato desde una distancia óptima y de forma lenta, gota a gota, dentro de un volumen suficiente de solución de cloruro de calcio para cubrir todas las perlas. Aspire la suspensión de células en alginato hacia una jeringa utilizando una aguja, luego agregue la mezcla gota a gota en una solución de cloruro de calcio 0,3 molar contenida en un vaso de precipitados de 100 mililitros con agitación continua. Deje las perlas en la solución de cloruro de calcio durante dos a tres horas a temperatura ambiente sin agitación, para permitir que ocurra el entrecruzamiento.

Vierta la solución de cloruro de calcio sin perturbar las perlas, vertiendo cuidadosamente la solución de cloruro de calcio en un tubo cónico de 15 mililitros. Transfiera las perlas restantes a otro tubo cónico de 50 mililitros. Para eliminar el exceso de cloruro de calcio y las células no encapsuladas, lave las perlas con tampón Tris-HCl 50 milimolar.

Añada 10 mililitros de tampón a las perlas y deje que la suspensión repose sin perturbar durante tres a cinco minutos. Una vez que las perlas se sedimenten en el fondo, deseche el tampón en otro recipiente. De esta manera, lave las perlas tres veces.

No centrifugue las perlas en ninguna etapa, ya que podrían romperse. No deseche el tampón de lavado Tris-HCl usado. Recupere los 30 mililitros de tampón de lavado usado junto con la solución de cloruro de calcio usada recolectada previamente.

Al hacer girar la solución de cloruro de calcio y Tris-HCl a 3200 veces G durante 20 minutos, se forma un sedimento con las células de E. coli no inmovilizadas. Transfiera las perlas lavadas a un tubo. Posteriormente, evalúe la biosíntesis de L-xilulosa siguiendo el procedimiento descrito para los sedimentos celulares, pero utilizando todas las perlas lavadas en lugar de los sedimentos celulares.

Para evaluar la estabilidad de los biocatalizadores inmovilizados para la producción de L-xilulosa, recolecte las perlas después de que se hayan formado. Lávelas dos veces con 10 mililitros de tampón Tris-HCl 50 milimolar sin centrifugación, como se mostró anteriormente. Utilice todas las perlas lavadas para realizar la reacción de producción de L-xilulosa, tal como se demostró antes.

Cuantifique la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, tal como se demostró anteriormente. Repita la reacción de producción de L-xilulosa durante el número deseado de ciclos de producción y mida la cantidad de L-xilulosa producida en el sobrenadante de la reacción en cada ciclo. La producción de L-xilulosa se ve potenciada por este sistema biocatalítico acoplado de células completas.

Partiendo de una concentración inicial de 150 milimolares de L-arabinitol, el uso del biocatalizador HjLAD E coli por sí solo produjo un rendimiento de 79 % de L-xilulosa. En comparación, el uso de las células HjLAD E coli y SpNOx E coli en una proporción de uno a uno produjo un rendimiento de 96 % de L-xilulosa. Una evaluación de los parámetros que influyen en la eficiencia de inmovilización del biocatalizador reveló que la eficiencia aumenta con el incremento de la concentración de alginato de sodio en el rango del uno al tres por ciento.

Sin embargo, concentraciones de alginato de sodio superiores al 2 % provocan una disminución del rendimiento de L-xilulosa. Utilizando una concentración de alginato de sodio del 2 %, se determinó que la concentración óptima de cloruro de calcio para la inmovilización y el rendimiento de L-xilulosa era de 0,3 molar. Se evaluó la reutilización del biocatalizador.

En este gráfico, la producción de L-xilulosa durante siete ciclos sucesivos de reutilización de biocatalizadores celulares acoplados inmovilizados y libres se muestra en gris oscuro y gris claro, respectivamente. Aunque el rendimiento máximo de L-xilulosa mediante biocatalizadores celulares acoplados inmovilizados es menor que el de un sistema celular acoplado libre, la reutilización mejora mediante la inmovilización. Al final de siete ciclos de reutilización sucesiva, los biocatalizadores inmovilizados mantuvieron su estabilidad y conservaron el 65 % del rendimiento original de L-xilulosa.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biocatálisis exploraran los rendimientos de biocatalizadores completos de múltiples células y las principales reacciones que involucran cofactores.