La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

El objetivo general de este procedimiento experimental es demostrar el uso de un sistema biocatalítico de célula entera acoplado inmovilizado en perlas de alginato para mejorar el rendimiento de la producción y la reutilización. Este es mi tema, he respondido preguntas clave en el campo de la biocatálisis, como la inmovilización de biocatalizadores, la estabilidad, la regeneración de cofactores y los biocatalizadores de células completas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque simple pero flexible para mejorar la producción de muchas biomoléculas importantes por vías dependientes de cofactores.

En este protocolo se utilizan dos cepas recombinantes de E. coli. SpNOx E coli, que expresa NADH oxidasa, y HjLAD E coli, que expresa L-arabinitol deshidrogenasa. Dado que este procedimiento es el mismo para ambas cepas de E. coli, solo se demostrará para HjLAD E. coli.

Inocular una sola colonia de HjLAD E. coli en tres mililitros de medio LB, suplementado con 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar durante la noche en un agitador de incubadora. Al día siguiente, diluya el cultivo de uno a 100 en 200 mililitros de LB fresco que contenga 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incube a 37 grados Celsius a 250 RPM hasta que el OD 600 alcance aproximadamente 0,6. Inducir la expresión de la proteína HjLAD mediante la adición de 0,1 milimolar IPTG al medio de cultivo e incubación a 25 grados Celsius, 200 RPM, durante seis horas.

Recolectar las células inducidas por centrifugación a 3200 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y proceda con el procesamiento de la pastilla de celda como se muestra en el siguiente segmento. Para comenzar este procedimiento, suspendemos los gránulos celulares de HjLAD E coli y SpNox E coli por separado en 50 milimolares de tampón Tris-Hcl, a una densidad celular de cinco gramos de peso celular seco por litro.

En un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, mezcle 600 microlitros de cinco gramos de peso de celda seca por litro de HjLAD E coli, 600 microlitros de cinco gramos de peso de celda seca por litro de SpNOx E coli, 100 microlitros de 20 milimolares de NAD plus y 150 microlitros de L-aribinitol de dos molares. Lleve el volumen de reacción a dos mililitros agregando 550 microlitros de Tris-HCl de 50 milimolares. Incubar la mezcla de reacción a 30 grados centígrados y 200 RPM durante ocho horas.

Después de ocho horas, centrifugar la mezcla a 3200 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos y recoger el sobrenadante de reacción. Para cuantificar la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, se aspiran 100 microlitros del sobrenadante recogido en un tubo de 1,5 milímetros. Agregue 50 microlitros de cisteína al 1,5%, 900 microlitros de ácido sulfúrico al 70% y 50 microlitros de ácido sulfúrico al 0,1%Kar-Piz-All disueltos en etanol, y mezcle suavemente invirtiendo el tubo tres veces.

Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados y 200 RPM durante 20 minutos. Mida la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Comience el protocolo de inmovilización preparando una solución de alginato al 4%.

Agregue 0,8 gramos de alginato de sodio a 20 mililitros de agua destilada y caliente la mezcla para disolver el alginato de sodio. Agregue 600 microlitros de cinco gramos de peso de celda seca por litro de HjLAD E. coli, y 600 microlitros de cinco gramos de peso de celda seca por litro de SpNOx E coli a 1,2 mililitros de la solución de alginato al 4%. Mezcle las células y el alginato mediante un pipeteo suave para evitar la formación de burbujas.

Para asegurar la formación de perlas de alginato con tamaño, morfología y rigidez uniformes, es fundamental agregar la suspensión de alginato celular a una distancia óptima de manera lenta y gota a gota, en un volumen suficiente de solución de cloruro de calcio para cubrir todas las perlas. Aspire la suspensión de células de alginato en una jeringa con una aguja, luego agregue la mezcla gota a gota en una solución de cloruro de calcio 0.3 molar en un vaso de precipitados de 100 mililitros con agitación continua. Deje las perlas en la solución de cloruro de calcio durante dos o tres horas a temperatura ambiente sin agitar para permitir que se produzca la reticulación.

Decanta la solución de cloruro de calcio sin alterar las perlas vertiendo cuidadosamente la solución de cloruro de calcio en un tubo cónico de 15 mililitros. Transfiera las cuentas restantes a otro tubo cónico de 50 mililitros. Para eliminar el exceso de cloruro de calcio y las células no encapsuladas, lave las perlas con tampón Tris-HCl de 50 milimolares.

Agregue 10 mililitros de tampón a las cuentas y deje que la suspensión permanezca inalterada durante tres a cinco minutos. Una vez que las cuentas se asienten en el fondo, decanta el tampón en otro recipiente. De esta manera, lava las cuentas tres veces.

No centrifugue las cuentas en un paso dado o se romperán. No deseche el tampón de lavado Tris-HCl usado. Extraiga los 30 mililitros de tampón de lavado usado con la solución de cloruro de calcio usada recolectada anteriormente.

Granular las células de E. coli no inmovilizadas por centrifugación de la solución extraída de cloruro de calcio y Tris-HCl a 3200 veces G durante 20 minutos. Transfiera las cuentas lavadas a un tubo. Posteriormente, evalúe la biosíntesis de L-xilulosa siguiendo el procedimiento demostrado para los gránulos celulares, pero utilizando todas las perlas lavadas en lugar de gránulos celulares.

Para evaluar la estabilidad de los biocatalizadores inmovilizados para la producción de L-xilulosa, recoja las perlas después de que se formen. Y lavar dos veces con 10 mililitros de tampón Tris-HCl de 50 milimolares sin centrifugar como se muestra anteriormente. Utilice todas las perlas lavadas para realizar la reacción para la producción de L-xilulosa como se demostró anteriormente.

Cuantificar la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, también como se ha demostrado anteriormente. Repita la reacción de producción de L-xilulosa durante el número deseado de ciclos de producción y mida la cantidad de L-xilulosa producida en el sobrenadante de reacción en cada ciclo. La producción de L-xilulosa se ve reforzada por este sistema biocatalítico de célula entera acoplado.

A partir de una concentración inicial de 150 milimolares de L-aribinitol, el uso del biocatalizador HjLAD E coli solo produjo un rendimiento de 79% de L-xilulosa. En comparación, el uso de las células HjLAD E coli y SpNOx E coli en una proporción de uno a uno produjo un rendimiento de L-xilulosa del 96%. Una evaluación de los parámetros que influyen en la eficiencia de la inmovilización del biocatalizador reveló que la eficiencia aumenta con el aumento de la concentración de alginato de sodio en el rango del uno al tres por ciento.

Sin embargo, las concentraciones de alginato de sodio superiores al 2% dan lugar a una disminución del rendimiento de L-xilulosa. Utilizando una concentración de alginato de sodio del 2%, se determinó la concentración óptima de cloruro de calcio para la inmovilización y el rendimiento de L-xilulosa en 0,3 molar. Se evaluó la reutilización de los biocatalizadores.

En este gráfico, la producción de L-xilulosa durante siete ciclos sucesivos de reutilización de biocatalizadores de células enteras inmovilizados y acoplados libres se muestra en gris oscuro y claro, respectivamente. Aunque el rendimiento máximo de L-xilulosa por biocatalizadores de células enteras acoplados inmovilizados es menor que por un sistema de células enteras acopladas libres, la reutilización mejora por inmovilización. Al final de siete ciclos de reutilización sucesiva, los biocatalizadores inmovilizados mantuvieron su estabilidad y conservaron el 65% del rendimiento original de L-xilulosa.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biocatálisis exploraran los rendimientos de los biocatalizadores multicelulares completos y las principales reacciones que involucran cofactores.