Name: La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende a inmovilizar biocatalizadores de células completas en perlas de alginato para mejorar la regeneración de cofactores y la reutilización. Este método utiliza cepas de Escherichia coli para optimizar la producción de L-xilulosa.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (NRF-2013R1A1A2012159 y NRF-2013R1A1A2007561), Universidad de Konkuk, y el Departamento de Ingeniería Química y mCubed programa de la Universidad de Michigan.

1.-Preparación de células enteras biocatalizadores NOTA: La E. recombinante células de E. coli que albergan pET28a- SpNox 31 o 28 pET28a- HjLAD se denominarán en adelante como E. coli SpNox y E. coli HjLAD, respectivamente. <ol><li> Se inocula una sola colonia de E. coli HjLAD en 3 ml de medio Luria-Bertani (LB) complementado con kanamicina (50 mg / ml) y se incuba en un incubador agitador O / N a 37 ° C, 250 rpm. </li><li> Diluir el cultivo por 1: 100 en 200 ml de LB fresco que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba a 37 ° C, 250 rpm hasta que la DO 600 alcanza ~ 0,6. </li><li> Inducir la expresión de la proteína HjLAD añadiendo 0,1 mM isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de cultivo y se incuba a 16 ° C, 180 rpm durante 16 hr. <ol><li> Alternativamente, lleve a cabo la inducción a 25 ° C, 200 rpm durante 6 horas si la biosíntesis de L-xilulosa (Paso 2 a continuación) se lleva a cabo el mismo día. </li></ol></li><li> Se recoge el E. inducida coli HjLAD células por centrifugación a 3200 xg durante 20 min a 4 ° C Descartar el sobrenadante y proceder al paso 2 para procesar el sedimento celular. </li><li> En paralelo, realice los pasos 1.1 a 1.4 para E. coli SpNox. </li></ol> 2. Biosíntesis de L-xilulosa por acoplamiento E. coli HjLAD y E. coli SpNox para la regeneración del cofactor <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares de E. coli HjLAD y E. coli SpNox por separado en tampón 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a una densidad celular de 5,0 g de peso celular seco (gDCW) / L. Nota: Una correlación entre gDCW y la densidad óptica medida a 600 nm (OD 600) se puede establecer para facilitar el experimento. La fórmula utilizada eneste protocolo es 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 a 0,0965, que puede variar entre los diferentes espectrómetros. </li><li> Mezclar 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 l de 20 mM de NAD +, y 150 l de 2 M L-arabinitol en un 14 ml de tubo de fondo redondo y llevar el volumen de reacción a 2 ml mediante la adición de 550 l de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) . Nota: La relación de la cantidad biocatalizadores dos de célula completa se puede optimizar para mejorar la biosíntesis del producto. Para el sistema descrito, una proporción de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 se encontró que era óptima para la biosíntesis de L-xilulosa (Figura 1B). </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 30 ° C, 200 rpm durante 8 horas. </li><li> Recoger el sobrenadante después de centrifugación a 4 ° C, 3.200 × g durante 10 min unand proceder para cuantificar la producción de L-xilulosa como se describe en el Paso 3 a continuación. </li></ol> 3. ensayo colorimétrico para la cuantificación L-xilulosa <ol><li> Aspirar 100 l del sobrenadante de reacción recogida del paso 2.4 en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 50 l de 1,5% de cisteína, 900 l de ácido sulfúrico 70%, y 50 l de 0,1% carbazol disolvió en etanol y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo 3 veces. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C, 200 rpm durante 20 min. </li><li> Medir la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nm (A 560), utilizando un espectrofotómetro. <ol><li> Se diluye la mezcla de reacción si la lectura A 560 está por encima de 1. </li></ol></li></ol> 4. Inmovilización de recombinantes catalizadores de células enteras en perlas de alginato de calcio <ol><li> Disolver 4 g de alginato de sodio en 100 ml de agua destilada. Preparar la solución de alginato mediante la adición sodium alginato al agua para evitar la formación de grumos. Se calienta la mezcla si es necesario. </li><li> Añadir 600 l de 5.0 gDCW / L E. coli HjLAD y 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox en 1,2 ml 4% de alginato preparado en la etapa 4.1 y mezclar las células y alginato por pipeteo suave para evitar la formación de burbujas. </li><li> Aspirar la suspensión de alginato / células en una jeringa con una aguja y añadir la mezcla gota a gota en un cloruro de 0,3 M de calcio (CaCl 2) solución en un vaso de precipitados de 100 ml con agitación continua. Nota: El volumen de la solución de CaCl 2 utilizado para la formación de esferas de alginato debería ser suficiente para que las gotitas de alginato esté completamente sumergido. Además, la distancia entre la aguja de la jeringa y la superficie de la solución de cloruro de calcio debe mantenerse dentro de un intervalo óptimo para asegurar la formación de perlas uniformemente esféricas. El rango óptimo se puede determinar la distancia experimentoaliado y depende del diámetro interior de la aguja. Como una estimación, se encontró una distancia de ~ 15 ± 5 cm para ser óptima para una 0,6 cm (diámetro interior) de la aguja de la jeringa. </li><li> Deja las perlas en la solución de CaCl 2 por 2 - 3 horas a TA sin agitación para permitir la formación de reticulación y de gel de perlas. </li><li> Decantar la solución de CaCl 2 sin perturbar las perlas vertiendo cuidadosamente la solución de CaCl 2 en un tubo cónico de 50 ml, y la transferencia de las perlas restantes en solución de CaCl2 en otro tubo cónico de 50 ml. </li><li> Lavar las perlas con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Tampón de tres veces para eliminar las células excesivas CaCl 2 y un-encapsulado. NOTA: En cualquier paso dado, no centrifugar las perlas ya que al hacerlo se romperá ellos. Para separar las perlas de la solución, permite la suspensión repose durante 3 - 5 min. Las perlas se depositan en el fondo y el tampón de lavado se puede decantaren otro recipiente. <ol><li> No deseche el tampón de lavado utilizado. En común el tampón utilizado Tris-HCl de lavado (30 ml) con la solución utilizada CaCl 2 recogido de la etapa 4.5. </li></ol></li><li> E. sedimentar los no-inmovilizados coli células por centrifugación de la solución de CaCl 2 y Tris-HCl agrupado recogieron de la etapa 4.6 a 3.200 xg durante 20 min. Para determinar la eficacia de inmovilización, calcular la densidad de las células de un-encapsulado sedimentadas en gDCW / L como se ha descrito en el paso 2.1. </li><li> Transferir las perlas lavadas desde el paso 4.6 en un tubo. Siga los pasos 2.2 - 3.4 para evaluar la biosíntesis de L-xilulosa utilizando todas las perlas lavadas en lugar de gránulos de las células. </li></ol> 5. Ensayo de Estabilidad de Inmovilizados biocatalizadores para la producción de L-xilulosa <ol><li> Recoger las perlas de la etapa 4.8 y lavar dos veces con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tampón sin centrifugación (como se describe en el paso 4.6). </li><li> Use todode las perlas lavadas para llevar a cabo la reacción como se describe en los pasos 2.2 - 3.4. </li><li> Repetir los pasos 5.1 a 5.2 para el número deseado de ciclos de producción y medir la cantidad de L-xilulosa producido en el sobrenadante de reacción en cada ciclo. </li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia. El documento tiene por objeto informar metodología detallada para generar un sistema biocatalıtica de células enteras junto inmovilizada en perlas de alginato. Novedades científicas han sido reportados en un estudio previo 16.

Los recientes avances tecnológicos han permitido un aumento en la comercialización de productos bioterapéuticos recombinantes, lo que resulta en un aumento gradual de su valor de mercado en la industria de la biotecnología. Uno de estos avances es la llegada de la ingeniería metabólica de microorganismos recombinantes, que ha mostrado una gran promesa en el establecimiento de sistemas industriales escalables 38. Al igual que con la mayoría de los procesos, la comercialización exitosa de biomoléculas recombina...

Biotransformación reductiva de células enteras utilizando microorganismos se ha convertido en un método generalizado para la síntesis quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente y terapéuticamente importantes 1 - 3. Presenta varias ventajas sobre el uso de enzimas aisladas, especialmente la eliminación de los procesos de purificación de aguas abajo de alto coste y la demostración de un tiempo de vida prolongado 4-7. Para vías biocatalıticas donde se requieren cofactores para la formación de productos, los sistemas de células enteras tienen el potencial para proporcionar in situ regeneración cofactor mediante la adición de bajo costo donantes de electrones co-sustratos 5,8,9. Sin embargo, esta capacidad se reduce para las reacciones que requieren una concentración estequiométrica de co-sustratos raros o caros 10 - 13. Junto con pobre capacidad de reutilización de células enteras, esto impide el establecimiento de un produ escalable y continuosistema cción. se requieren modificaciones estratégica de los sistemas de células completas para estas biotransformaciones dependiente del cofactor para superar las limitaciones antes mencionadas. Específicamente, la combinación de los biocatalizadores de células completas que funcionan en conjunto se han mostrado para mejorar de manera significativa la productividad y la estabilidad de las enzimas albergaron 14. Estos factores, que son a menudo críticos para permitir la producción a gran escala de productos comercialmente viables, se pueden optimizar aún más por microbios biocatalıticas co-inmovilización 15. Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple y reutilizable que permite tanto la regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para la producción de L-xilulosa 16. En este estudio, este sistema se utiliza como un ejemplo para ilustrar los procedimientos experimentales de la aplicación de estas dos estrategias para mejorar el rendimiento de producción de biotransformación y la reutilización biocatalizador. L-xilulosa pertenece a una class de moléculas biológicamente útiles nombrado azúcares raros. Azúcares monosacáridos son raros o únicos derivados de azúcares que se producen muy raramente en la naturaleza, sino que desempeñan un papel crucial como elementos de reconocimiento en las moléculas bioactivas 17,18. Tienen una gran variedad de aplicaciones que van desde los edulcorantes, alimentos funcionales para terapéuticos potenciales 19. L-xilulosa se ​​puede utilizar como un inhibidor potencial de múltiples alfa-glucosidasas, y también puede ser utilizado como un indicador de la hepatitis o cirrosis hepática 17,20. Alta eficiencia de conversión de xilitol a L-xilulosa en los sistemas de células enteras se ha informado anteriormente en Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pálido Y25 24,25 y 26 de Escherichia coli. En E. coli, sin embargo, sólo se alcanzó usando (&lt;67 mM) concentraciones bajas de xilitol 26 debido a los posibles efectos inhibidores de una concentración inicial de xilitol superior a 100 mM sobre la actividad xilitol deshidrogenasa-4-21,26. El equilibrio termodinámico entre xilulosa y xilitol se ha demostrado que favorecen fuertemente la formación de xilitol 25,27. Además, el rendimiento de xilulosa está limitada por la cantidad de cofactores caros que tienen que ser suministrado en la ausencia de un sistema de regeneración de cofactor en situ. En conjunto, estos factores limitan el potencial de ampliación en los sistemas sostenibles para la biosíntesis de L-xilulosa. Para superar estas limitaciones y mejorar el rendimiento de biotransformación-L xilulosa, se empleó la estrategia de regeneración cofactor primero mediante el establecimiento de un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado. Específicamente, L-arabinitol 4-deshidrogenasa (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), una enzima en la vía catabólica-L arabinosa de hongos, fue seleccionado para catalizar la conversión de L-arabinitol en L-xilulosa 28,29 . Al igual que muchas enzimas biosintéticas, un limitatio importanten de HjLAD es que requiere una cantidad estequiométrica de la cara dinucleótido de nicotinamida adenina cofactor (NAD +, la forma oxidada de NADH) para llevar a cabo esta conversión. NADH oxidasa se ​​encuentra en Streptococcus pyogenes (SpNox) se ha demostrado que mostrar una alta actividad de cofactor de regeneración 30,31. Aprovechando este atributo de SpNox, E. células de E. coli que expresan HjLAD para la producción de L-xilulosa se ​​acoplaron con E. células de E. coli que expresan SpNox para la regeneración de NAD + para aumentar la producción de L-xilulosa representado por la reacción de acoplamiento se muestra en la Figura 1A. En condiciones óptimas y usando una concentración inicial de 150 mM de L-arabinitol, el rendimiento máximo de L-xilulosa alcanzó el 96%, por lo que este sistema mucho más eficiente que los reportados en la literatura. La estrategia de inmovilización de células enteras se empleó junto a mejorar aún más la capacidad de reutilización de la biocatalyt acopladoEl sistema de CI. Métodos utilizados comúnmente para la inmovilización de células enteras incluyen la adsorción / unión covalente a las matrices sólidas, la reticulación / atrapamiento y encapsulación en redes poliméricas 32. Entre estos enfoques, el método más adecuado para la inmovilización de células es la encapsulación en perlas de alginato de calcio. Sus propiedades de gelificación leves, matriz acuosa inerte y de alta porosidad ayudan a preservar las propiedades fisiológicas y la funcionalidad de los productos biológicos encapsulados 33. Por lo tanto, el sistema de biocatalizador acoplado que contiene tanto E. células de E. coli que albergan HjLAD o SpNox se inmovilizó en perlas de alginato de calcio para permitir múltiples ciclos de producción de L-xilulosa (Figura 2) .El sistema biocatalizador inmovilizado demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% del rendimiento de conversión del primer ciclo después de 7 ciclos de sucesiva reutilización, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo su actividad catalítica.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>B-Nicotinamida adenina dinucleótido hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma Aldrich 168149</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Excella E24 incubadora incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendrof</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Pioneer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza de pesaje analítica y de precisión</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la inmovilización de multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de regeneración y reutilización mejorada

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple, reutilizable y junto con la capacidad de regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para el rendimiento de producción mejorada y síntesis sostenida. La presente se describe el procedimiento experimental para el desarrollo de un sistema de este tipo que consta de dos E. cepas de E. coli que expresan enzimas funcionalmente complementarios. Juntas, estas dos enzimas pueden funcionar cooperativamente para mediar en la regeneración de cofactores caros para mejorar el rendimiento del producto de la biorreacción. Además, se informa del método de síntesis de una forma inmovilizada del sistema biocatalıtica acoplado por la encapsulación de células enteras en perlas de alginato de calcio. A modo de ejemplo, presentamos la biosíntesis mejorada de L-xilulosa a partir de L-arabinitol acoplando E. células de E. coli que expresan las enzimas L-arabinitol deshidrogenasa o NADH oxidasa. En condiciones óptimas y el uso de una concentración inicial de 150mM L-arabinitol, el rendimiento máximo L-xilulosa alcanzó 96%, que es superior a los reportados en la literatura. La forma inmovilizada de los biocatalizadores de células completas, junto demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% de los rendimientos obtenidos en el primer ciclo después de 7 ciclos de re-uso sucesivo, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo la actividad catalítica. Por lo tanto, los métodos que aquí se ofrece dos estrategias que podrían ayudar a mejorar la producción industrial de L-xilulosa, así como otros compuestos de valor añadido que requieren el uso de cofactores en general.

Para activar la regeneración de cofactor, la síntesis de L-xilulosa se ​​llevó a cabo en un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado que contiene E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox. Después de la optimización de varios parámetros, la reutilización de este sistema se ha mejorado mediante la inmovilización en perlas de alginato de calcio (Figura 2). <p class="jove_content" fo:keep-t...

Se presenta el protocolo para biocatalizadores de células completas co-inmovilización para la regeneración de cofactor y la mejora de la reutilización, usando la producción de L-xilulosa como un ejemplo. La regeneración del cofactor se consigue mediante el acoplamiento de dos cepas de Escherichia coli que expresa las enzimas funcionalmente complementarios; la inmovilización biocatalizador de célula completa se consigue mediante encapsulación de células en perlas de alginato de calcio.

La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es demostrar el uso de un sistema biocatalítico acoplado de células completas inmovilizadas en perlas de alginato para mejorar el rendimiento de producción y la reutilización. Este es mi tema de estudio, en el que he respondido preguntas clave en el campo de la biocatálisis, como la inmovilización de biocatalizadores, estabilidad, regeneración de cofactores y biocatalizadores de células completas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque sencillo pero flexible para mejorar la producción de muchas biomoléculas importantes mediante vías dependientes de cofactores.Se utilizan dos cepas recombinantes de E coli en este protocolo. SpNOx E coli, que expresa NADH oxidasa, y HjLAD E coli, que expresa L-arabinitol deshidrogenasa. Dado que este procedimiento es el mismo para ambas cepas de E coli, solo se demostrará con HjLAD E coli.Inocular una colonia individual de E. coli HjLAD en tres mililitros de medio LB, suplementado con 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar durante la noche en un agitador-incubadora. Al día siguiente, diluir el cultivo uno a 100 en 200 mililitros de LB fresco que contenga 15 microgramos por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar a 37 grados Celsius a 250 RPM hasta que la DO 600 alcance aproximadamente 0,6. Inducir la expresión de la proteína HjLAD añadiendo IPTG 0,1 milimolar al medio de cultivo e incubar a 25 grados Celsius, 200 RPM, durante seis horas.Recolecte las células inducidas mediante centrifugación a 3200 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y continúe con el procesamiento del botón celular como se muestra en el siguiente segmento. Para comenzar este procedimiento, suspendemos los botones celulares de HjLAD E coli y SpNox E coli por separado en tampón Tris-HCl 50 milimolar, a una densidad celular de cinco gramos de peso seco de células por litro.En un tubo redondo de fondo plano de 14 mililitros, mezcle 600 microlitros de E. coli HjLAD al cinco gramos de peso seco de células por litro, 600 microlitros de E. coli SpNOx al cinco gramos de peso seco de células por litro, 100 microlitros de NAD⁺ 20 milimolar y 150 microlitros de L-arabinitol 2 molar. Ajuste el volumen de la reacción a 2 mililitros añadiendo 550 microlitros de Tris-HCl 50 milimolar. Incube la mezcla de reacción a 30 grados Celsius y 200 RPM durante ocho horas.Después de ocho horas, centrifugue la mezcla a 3200 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos, y recoja el sobrenadante de la reacción. Para cuantificar la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, aspire 100 microlitros del sobrenadante recolectado hacia un tubo de 1,5 mililitros. Añada 50 microlitros de cisteína al 1,5 %, 900 microlitros de ácido sulfúrico al 70 % y 50 microlitros de Kar-Piz-All al 0,1 % disuelto en etanol, y mezcle suavemente invirtiendo el tubo tres veces.Incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 20 minutos. Mida la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Comience el protocolo de inmovilización preparando una solución de alginato al 4%.Añada 0,8 gramos de alginato de sodio a 20 mililitros de agua destilada y caliente la mezcla para disolver el alginato de sodio. Añada 600 microlitros de E. coli HjLAD a cinco gramos de peso seco de célula por litro y 600 microlitros de E. coli SpNOx a cinco gramos de peso seco de célula por litro a 1,2 mililitros de la solución de alginato al 4%. Mezcle las células y el alginato mediante pipeteo suave para evitar la formación de burbujas.Para garantizar la formación de perlas de alginato con tamaño, morfología y rigidez uniformes, es fundamental agregar la suspensión de células en alginato desde una distancia óptima y de forma lenta, gota a gota, dentro de un volumen suficiente de solución de cloruro de calcio para cubrir todas las perlas. Aspire la suspensión de células en alginato hacia una jeringa utilizando una aguja, luego agregue la mezcla gota a gota en una solución de cloruro de calcio 0,3 molar contenida en un vaso de precipitados de 100 mililitros con agitación continua. Deje las perlas en la solución de cloruro de calcio durante dos a tres horas a temperatura ambiente sin agitación, para permitir que ocurra el entrecruzamiento.Vierta la solución de cloruro de calcio sin perturbar las perlas, vertiendo cuidadosamente la solución de cloruro de calcio en un tubo cónico de 15 mililitros. Transfiera las perlas restantes a otro tubo cónico de 50 mililitros. Para eliminar el exceso de cloruro de calcio y las células no encapsuladas, lave las perlas con tampón Tris-HCl 50 milimolar.Añada 10 mililitros de tampón a las perlas y deje que la suspensión repose sin perturbar durante tres a cinco minutos. Una vez que las perlas se sedimenten en el fondo, deseche el tampón en otro recipiente. De esta manera, lave las perlas tres veces.No centrifugue las perlas en ninguna etapa, ya que podrían romperse. No deseche el tampón de lavado Tris-HCl usado. Recupere los 30 mililitros de tampón de lavado usado junto con la solución de cloruro de calcio usada recolectada previamente.Al hacer girar la solución de cloruro de calcio y Tris-HCl a 3200 veces G durante 20 minutos, se forma un sedimento con las células de E. coli no inmovilizadas. Transfiera las perlas lavadas a un tubo. Posteriormente, evalúe la biosíntesis de L-xilulosa siguiendo el procedimiento descrito para los sedimentos celulares, pero utilizando todas las perlas lavadas en lugar de los sedimentos celulares.Para evaluar la estabilidad de los biocatalizadores inmovilizados para la producción de L-xilulosa, recolecte las perlas después de que se hayan formado. Lávelas dos veces con 10 mililitros de tampón Tris-HCl 50 milimolar sin centrifugación, como se mostró anteriormente. Utilice todas las perlas lavadas para realizar la reacción de producción de L-xilulosa, tal como se demostró antes.Cuantifique la producción de L-xilulosa mediante un ensayo colorimétrico, tal como se demostró anteriormente. Repita la reacción de producción de L-xilulosa durante el número deseado de ciclos de producción y mida la cantidad de L-xilulosa producida en el sobrenadante de la reacción en cada ciclo. La producción de L-xilulosa se ve potenciada por este sistema biocatalítico acoplado de células completas.Partiendo de una concentración inicial de 150 milimolares de L-arabinitol, el uso del biocatalizador HjLAD E coli por sí solo produjo un rendimiento de 79 % de L-xilulosa. En comparación, el uso de las células HjLAD E coli y SpNOx E coli en una proporción de uno a uno produjo un rendimiento de 96 % de L-xilulosa. Una evaluación de los parámetros que influyen en la eficiencia de inmovilización del biocatalizador reveló que la eficiencia aumenta con el incremento de la concentración de alginato de sodio en el rango del uno al tres por ciento.Sin embargo, concentraciones de alginato de sodio superiores al 2 % provocan una disminución del rendimiento de L-xilulosa. Utilizando una concentración de alginato de sodio del 2 %, se determinó que la concentración óptima de cloruro de calcio para la inmovilización y el rendimiento de L-xilulosa era de 0,3 molar. Se evaluó la reutilización del biocatalizador.En este gráfico, la producción de L-xilulosa durante siete ciclos sucesivos de reutilización de biocatalizadores celulares acoplados inmovilizados y libres se muestra en gris oscuro y gris claro, respectivamente. Aunque el rendimiento máximo de L-xilulosa mediante biocatalizadores celulares acoplados inmovilizados es menor que el de un sistema celular acoplado libre, la reutilización mejora mediante la inmovilización. Al final de siete ciclos de reutilización sucesiva, los biocatalizadores inmovilizados mantuvieron su estabilidad y conservaron el 65 % del rendimiento original de L-xilulosa.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biocatálisis exploraran los rendimientos de biocatalizadores completos de múltiples células y las principales reacciones que involucran cofactores.

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Investigación

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Chemistry

Química

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Este video y el manuscrito describen un método basado en emulsión para encapsular células de mamífero en perlas de alginato al 0,5% al ​​10% que se pueden producir en grandes lotes usando un simple recipiente agitado. Las células encapsuladas pueden cultivarse in vitro o trasplantarse para aplicaciones de terapia celular.

Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

Este protocolo ilustra un método de encapsulación celular mediante la gelación física rápida de alginato para inmovilizar las células. Los microperlas obtenidos permiten la secreción controlada y sostenida de amiloide a lo largo del tiempo y se pueden utilizar para estudiar los efectos de los amiloides secretos en modelos in vitro e in vivo.

Fabricación de Microperlas de Alginato Secreto de Amiloide para su uso en el modelado de la enfermedad de Alzheimer

Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.

Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

Aprende a inmovilizar biocatalizadores de células completas en perlas de alginato para mejorar la regeneración de cofactores y la reutilización. Este método utiliza cepas de Escherichia coli para optimizar la producción de L-xilulosa.

La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

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