Name: El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprende un método de glicómica de abajo hacia arriba para analizar glicanos en biofluidos mediante GC-MS, conservando la composición y la información de enlace de monosacáridos. Esta técnica facilita la detección temprana de cáncer al identificar alteraciones específicas en enfermedades.

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Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Artes Liberales y Ciencias de la Universidad Estatal de Arizona en forma de fondos de inicio de laboratorio para CRB. También contó con el apoyo de una subvención de la Fundación Flinn (Subvención Nº 1977) y del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R33CA191110. JA fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del Programa de Educación de Investigación Postbachillerato (PREP) de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número R25GM071798. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En general, la producción exitosa de acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexosas está cargada de menos dificultades y es más robusto que el éxito de la producción de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. El mecanismo exacto detrás de este fenómeno, ya que desempeña en cada paso de este procedimiento es desconocido, pero debe estar relacionada con la química única del grupo acetil N (en lugar de grupo hidroxilo) que es único para HexNAcs en relación con hexosas. El mecanismo det...

Los glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos constituyen las cuatro clases principales de carbohidratos complejos y heterogéneos conocidos colectivamente como glicanos. Como componentes ubicuas e integrales de la membrana plasmática, glycocalyx, y la matriz extracelular y los líquidos, los glicanos participan en diversos procesos tales bioquímicos como la endocitosis, el tráfico intracelular, la motilidad celular, la transducción de señales, reconocimiento molecular, la activación del receptor, la adhesión celular, la interacción huésped-patógeno , comunicación, inmunovigilancia, y la iniciación respuesta inmune intercelular. 1 presente en casi todos los ámbitos de la vida, las enzimas conocidas como glicosiltransferasas que se acumulan polímeros de glicano actuar en conjunto con glucósido hidrolasas (también conocidos como glicosidasas, que se descomponen glicanos) para construir, remodelar, y finalmente producir polímeros finalizado glicanos 2. Aunque cada glicosiltransferasa puede operar en diferentes glicoconjugados, una glicosiltransferasageneralmente forja una de ligamiento y de anómero específico de enlace glicosídico mediante la transferencia de la fracción de monosacáridos de un determinado nucleótido activado azúcar donante (por ejemplo, GDP-fucosa) a una determinada categoría de aceptores nucleófilos (por ejemplo, un lípido, polipéptido, ácido nucleico, o en crecimiento oligosacárido). Se ha estimado que más del 50% de proteínas (especialmente proteínas de membrana y de secreción) son después de la traducción modificado por glicosilación 3 cálculos combinatorios rudimentarios proporcionar una apreciación de la variabilidad considerable, versatilidad y especificidad concedido a glicoproteínas de glicosilación.; por ejemplo, si un sustrato polipéptido tiene sólo 10 sitios de glicosilación y cada sitio se puede formar un enlace glicosídico con 1 de extremos reductores solamente 3 de monosacáridos diferentes, entonces, teóricamente, la glicoproteína final puede asumir 3 10 = 59.049 identidades distintas. En glicoproteínas, enlaces glicosídicos forman comúnmente con la cadena lateral de nitrógeno oresiduos f asparagina en la secuencia Asn-X-Ser / Thr (X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina) para producir N -glycans 2 y de la cadena lateral hidroxilos de residuos de serina y treonina para dar O -glycans 4. La composición de glicoma de una célula (es decir, su complemento de los productos de glicosilación) es único y limitado, ya que, con pocas excepciones, las glicosiltransferasas exhiben estricta donante, aceptor, y la especificidad de ligamiento. 5 glicoproteínas plasma sanguíneo importantes y abundantes sufren glicosilación aberrante como consecuencia de aguas abajo de expresión de glicosiltransferasa anormal y la actividad debido a muchas condiciones patológicas, especialmente cáncer y enfermedades inflamatorias. 6-24 Principalmente debido a factores epigenéticos, la glicoma es significativamente más diverso, dinámico y complejo que el proteoma y transcriptome 25,26. Mientras que aproximadamente 1% del genoma de mamíferos codifica la formación, modificación, ymontaje de glicanos, 27 procede de glicosilación de una manera-un marcado contraste impulsado la no-plantilla para la biosíntesis del polipéptido y ácido nucleico. La interacción entre la cantidad relativa y la actividad de las enzimas de glicosilación y los factores ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes y precursor en última instancia, determina la naturaleza, la velocidad y grado de glicosilación. 5,28 embriogénesis (por ejemplo, la determinación y diferenciación), la activación celular y la progresión a través la expresión del gen influencia del ciclo celular (es decir, transcripción y traducción) y alterar la identidad y cantidad de glicosiltransferasas disponibles, cuya actividad es el determinante aguas arriba inmediata de perfil de glicano de la célula. Debido a que (algunos de) la proliferativa, adhesivo, y las propiedades invasivas de las células cancerosas se parecen a los de las células embriogénicas ordinarias, cambios específicos en las rutas biosintéticas de glicano (por ejemplo, la acumulación de precursor, la expresión desregulada, aberranmodificación t, truncamiento estructural, o una novela formación) sirven biomarcadores de cáncer como universales que indican diversas etapas de la formación del tumor, progresión, migración y la invasión 29 Aunque la glicosilación es muy compleja, evidentemente, sólo unas pocas alteraciones en la glicosilación pueden permitir la carcinogénesis y la metástasis.; Al parecer, algunos productos de glicosilación &quot;aberrantes&quot; de hecho se benefician células cancerosas por lo que les permite evitar el reconocimiento inmune y sobrevivir a las exigencias de la migración en ambientes inhóspitos intravasculares y metastásicos. 28,30,31 Como era de esperar, los experimentos han revelado que la interrupción o la prevención de los patrones de alteración la expresión del gen y la formación de glicano aberrante puede detener la tumorigénesis. 29 no obstante, los glicanos aberrantes detectados en una muestra de biofluido (por ejemplo, orina, saliva, y el plasma sanguíneo o suero) pueden no ser indicadores directos de cáncer (u otra enfermedad), pero en lugar de aguas abajo resultados de sutil pero significativacambios en el sistema inmune o ramificaciones cuantificables de una condición perniciosa en un órgano impredecible. 32 A pesar de que proporcionan información acerca de la glicoma universales, muchas técnicas basadas en glicómica de interacción molecular (por ejemplo, lectina arrays de anticuerpos y / metabólica / marcaje covalente) dependerá de la detección de estructuras de glicano enteros y no proporcionan información estructural detallada sobre glicanos individuales. En marcado contraste, la espectrometría de masas (MS) puede ayudar a identificar y cuantificar las estructuras de glicano individuales y revelar información estructural como los sitios de unión a núcleos de polipéptidos. expresión o actividad de sólo una glicosiltransferasa Desregulado pueden iniciar una cascada de eventos moleculares perjudiciales en múltiples vías de glicosilación. Debido a que cada glicosiltransferasa puede operar en más de un sustrato glicoconjugado ya través de diferentes polímeros de glicanos en crecimiento, cascadas biosintéticas desreguladas dió desproporcionalmente mayores cantidades de un solo producto de glicano, sino varias clases heterogéneas de glicanos aberrantes en los fluidos intra o extracelulares. 33 Sin embargo, tales glicanos aberrantes únicos a veces se consideran poco práctico como biomarcadores para el cáncer u otras patologías de glicano-afectivo, ya que, en comparación con la gran piscina de glicanos bien regulada, estos glicanos aberrantes representan una fracción muy pequeña que a menudo pueden permanecer indetectable incluso por tales técnicas altamente sensibles como la espectrometría de masas. Por ejemplo, en los fluidos corporales intra y extracelulares, el amplio espectro de proteínas de concentración (que abarca ocho órdenes de magnitud) puede impedir la detección de glicoproteínas escasos que están enmascarados por las especies más abundantes. 32 Por otra parte, determinar la actividad de glicosiltransferasa sigue habiendo una considerable práctica y el desafío teórico porque muchas glicosiltransferasas están ausentes en fluidos biológicos o clínicos vuelven inactivas ex vivo. A pesar de la dificultad del consistently detección y cuantificación de cantidades diminutas de ultra-glicanos enteros únicos, los profesionales de la espectrometría de masas han dado grandes pasos hacia el empleo de glucanos intactos como marcadores clínicos. Hemos desarrollado recientemente un enfoque complementario para el análisis de glucanos intactos que, empleando GC-MS, facilita la detección de todos los constituyente punto de ramificación y monosacáridos-vinculación específica ( &quot;nodos de glicano&quot;) que juntos confieren singularidad a cada glicano y en muchos casos sirven directamente como sustitutos moleculares que cuantifican la actividad relativa de la glicosiltransferasa (s) culpable. Desde su primera informó de aplicación directa en el análisis de glicanos en 1958, cromatografía de gases (GC) ha demostrado ser una técnica poderosa para analizar mono- y disacáridos per-metilado, 34 determinar su anomericity y configuración absoluta, y separarlos para el análisis de espectrometría de masas posterior. 35 entre 1984 y 2007, y sus colegas Ciucanuintrodujo y refinó una técnica permetilación glicanos en fase sólida que emplea hidróxido de sodio y yodometano, seguido de extracción líquido / líquido de glicanos permetilados con agua y. cloroformo 35,36 Entre 2005 y 2008, Kang y compañeros de trabajo integrados un giro de ahorro de tiempo -column enfoque en el paso permetilación 37,38. En 2008, el grupo de investigación Goetz ideó una fase sólida cuantitativa permetilación método de glicano de perfiles utilizando láser de desorción-ionización asistida por matriz (MALDI) espectrometría de masas para comparar y diferenciar potencialmente invasivas y no las células de cáncer de mama no invasiva; 39 entonces, en 2009, el equipo de técnicas de liberación químicos Goetz enzimática y combinado para escindir O -glycans de glicoproteínas intactas en un esquema permetilación en fase sólida altamente alcalina 40 Aunque el procedimiento Goetz facilitó permetilación simultánea y las emisiones químicas. de -glycans O, se aplica sólo a pre-aislado glicoproteínas. Hemos modificado esta técnica en 2013 y lo adaptó para fluidos biológicos no fraccionadas enteros y muestras de tejido homogeneizadas mediante la incorporación de ácido trifluoroacético (TFA) hidrólisis, reducción y acetilación pasos. 33 Estos pasos adicionales también la liberación de los glicanos de glicolípidos y N -vinculada glicanos de glicoproteínas y convertir ellos en acetatos parcialmente metilados de alditol (PMAAs, Figura 1), cuyos patrones de metilación y acetilación distintivo facilitar el análisis por GC-MS y únicamente caracterizar los nodos de glicano constituyentes en el original polímero glicano intactas 41 (Figura 2). 33 en última instancia, este procedimiento produce un retrato compuesto de todos los glicanos en un biofluido complejo basado en la cuantificación directa, en relación de características únicas, tales como glicanos &quot;fucosilación núcleo&quot;, &quot;6-sialilación&quot;, &quot;bisectriz GlcNAc&quot;, y &quot;beta 1-6 de ramificación&quot; - cada una derivada de una sola chromatograp GC-MSpico de HIC. Este artículo presenta una mayor optimización de la permetilación, acetilación, el aislamiento, y las etapas de limpieza, junto con mejoras en el modo de cuantificación relativa.

<table><tbody><tr><td>Perlas de hidróxido de sodio&nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Malla 20-40, grado de reactivo 97%</td></tr><tr><td>0,9 ml Columna de centrifugado</td><td>69705</td><td>División Pierce de ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Incluye&nbsp; tapones y fritas de polietileno&nbsp;</td></tr><tr><td>Vial de muestreador automático GC-MS (silanizado)*</td><td>C4000-9</td><td>Vial</td> de <td>alta recuperación ThermoFisher Scientific Target DP, 1,5&nbsp; ml, 12&nbsp; mm x 32 y nbsp; mm, incluye tapones perforables revestidos de teflón</td></tr><tr><td>tubos de ensayo de polipropileno de 1,5 ml</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Tapa con tapón a presión</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de polipropileno de 2 ml</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Tapa con tapón a presión</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Biorreactivo para biología molecular, grado de reactivo >99.0%</td></tr><tr><td>Yodometano&nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Contiene cobre como estabilizador, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>75002436: Centrífuga Sorvall Legend Micro 17</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Rotor de 24 x 1,5/2,0 con tapa de biocontención ClickSeal. Número de catálogo del rotor: 75003424</td></tr><tr><td>Tubo de ensayo de vidrio de 13 x 100 (silanizado)*</td><td>53283-800 Tubos de</td><td>ensayo de vidrio de borosilicato de 13 mm x 100 mm VWR con acabado de tapón de rosca</td><td></td></tr><tr><td>Tapones para tubos de ensayo de vidrio</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Kimble&comercio; tapones de rosca fenólicos negros; 13&nbsp; Rosca GPI mm-415; Revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>>99,5% de pureza</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>4440-08</td><td>Macron Química Fina&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético&nbsp;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99% purificado por redestilación para la secuenciación de proteínas&nbsp;</td></tr><tr><td>borohidruro de sodio</td><td>71321</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de amonio&nbsp;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Contenido 3: 28.0-30.0%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & Ácido</td> acético <td>de grado HPLC</td></tr><tr><td>Jackson &nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99.70%</td></tr><tr><td>Desecador de vacío de plástico&nbsp;</td><td>Cualquier modelo de tamaño adecuado</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético&nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>Diclorometano&nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Grado de HPLC estabilizado</td></tr><tr><td>Acetona &nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker analizado&nbsp;</td></tr><tr><td>Colector de evaporación calentado (unidad principal)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>módulo de calentamiento y agitación Thermo Scientific* Reacti-Therm*; Modelo de triple bloque con función de calentamiento y agitación</td></tr><tr><td>Colector de evaporación calentado (evaporador aéreo)</td><td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Evaporador ThermoScientific* Reacti-Vap, 27 puertos; Para uso con módulo calefactor Reacti-Therm de triple bloque</td></tr><tr><td>Bloques portamuestras de aluminio para colector de evaporación</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Bloque, aluminio, Reacti-Block S-1, tiene capacidad para 13&nbsp; Tubos de ensayo de mm de diámetro, 13 orificios (14&nbsp; mm de diámetro x 45 mm; mm de profundidad)</td></tr><tr><td>Cromatógrafo de gases</td><td>Modelo A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Equipado con muestreador automático CTC PAL</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas&nbsp;</td><td>GCT Premier (Tiempo de vuelo)Aguas</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Liner de modo dividido (desactivado / silanizado)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Contiene un pequeño tapón de lana de vidrio silanizada</td></tr><tr><td>DB-5ms GC columna</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0,25 mm ID x 0,25 micras de espesor de película</td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío de vidrio (para silanización de cristalería)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer de</td><td>12" de ancho; tamaño</td></tr><tr> de placa de 230 mm<td colspan="4">*La silanización de vidrio se lleva a cabo internamente, durante la noche utilizando vapor de clorotrimetilsilano en un desecador de vacío de vidrio grande.</td></tr></tbody></table>

el análisis de glicanos nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para glicómica

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Sintetizados en un proceso no impulsado por plantillas por enzimas llamadas glicosiltransferasas, los glicanos son actores clave en varios eventos intra y extracelulares significativos. Muchas condiciones patológicas, en particular el cáncer, afectan la expresión génica, que a su vez puede desregular la abundancia relativa y los niveles de actividad de las enzimas glucósido hidrolasa y glicosiltransferasa. Los glicanos enteros aberrantes únicos que resultan de glicosiltransferasas desreguladas a menudo están presentes en cantidades mínimas dentro de biofluidos complejos, lo que dificulta su detección y, a veces, estocástica. Sin embargo, con una preparación adecuada de la muestra, una de las formas más antiguas de espectrometría de masas (cromatografía de gases-espectrometría de masas, GC-MS) puede detectar de forma rutinaria la colección de monosacáridos específicos de punto de ramificación y enlace ("nodos de glicanos") presentes en biofluidos complejos. Complementario a las técnicas tradicionales de glicoma de arriba hacia abajo, el enfoque discutido en este documento implica la recolección y condensación de cada nodo de glicano constituyente en una muestra en una sola señal analítica independiente, que proporciona información estructural y cuantitativa detallada sobre los cambios en el glicoma en su conjunto y revela glicosiltransferasas potencialmente desreguladas. Las mejoras en la permetilación y las posteriores etapas de extracción líquido/líquido proporcionadas en este documento mejoran la reproducibilidad y el rendimiento general al facilitar la exposición mínima de los glicanos permetilados a condiciones acuosas alcalinas. Las modificaciones en la etapa de acetilación aumentan aún más el grado de reacción y el rendimiento general. A pesar de su reproducibilidad, se ha demostrado que los rendimientos generales de acetatos de alditol parcialmente permetilados (PMAA) de N-acetilhexosamina (HexNAc) son inherentemente más bajos que su valor teórico esperado en relación con los PMAA de hexosa. El cálculo de la relación entre el área bajo el cromatograma iónico extraído (XIC) para cada PMAA de hexosa individual (o PMAA HexNAc) y la suma de dichas áreas XIC para todas las hexosas (o HexNAcs) proporciona un nuevo método de normalización que facilita la cuantificación relativa de los nodos de glicanos individuales en una muestra. Aunque actualmente está limitado en términos de sus límites absolutos de detección, este método acelera el análisis de biofluidos clínicos y se muestra considerablemente prometedor como un enfoque complementario a la glucómica tradicional de arriba hacia abajo.

Un cromatograma de la corriente de iones total (TIC) que muestra permetilación éxito, hidrólisis, reducción, y la acetilación de las muestras de plasma sanguíneo humano con respecto a los casos en los que se ejecutan incorrectamente dos pasos críticos permetilación se muestra en la Figura 3. Absoluta Rendimiento de HexNAcs relativa a hexosas: <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

El objetivo general de este procedimiento es descomponer todos los glicanos en una muestra biológica conservando la información sobre la composición de monosacáridos y los enlaces. Esto facilita la identificación de características interesantes de los glicanos, como la sialilación patológica y la N-acetilglucosamina bisectriz, en señales analíticas individuales. Este método puede ayudar a responder directamente preguntas clave en el campo de los glicómicos, como cuáles características únicas de los glicanos se alteran en estados patológicos específicos.La principal ventaja de esta técnica es que las características de los glicanos que tienden a alterarse en enfermedades, como la ramificación beta 1-6 y la corefucosilación, se condensan en señales analíticas individuales en lugar de distribuirse entre múltiples glicanos intactos. Por lo general, las personas que necesitan realizar este método experimentan dificultades debido a bajos rendimientos de N-acetilcisteínas causados por un procesamiento inadecuado de los glicanos recién permetilados. Prepare las muestras transfiriendo primero nueve microlitros de cada analito biológico a tubos de ensayo separados de 1,5 mililitros.A cada muestra, añada un microlitro de agua desionizada y 270 microlitros de DMSO de alta pureza. Y mezcle vigorosamente mediante vortex. Después de la preparación de las muestras, ensamble las columnas giratorias cargadas con hidróxido de sodio según se describe en el protocolo del texto.Utilizando una jeringa analítica, agregue 105 micro-litros de yodometano a cada analito y tape inmediatamente los tubos. Vortexe las muestras completamente. Desconecte las columnas giratorias previamente preparadas y centrifúgelas durante 15 segundos a 2,400 Gs. Después de desechar los tubos recolectores y el afluente, vuelva a conectar las columnas y colóquelas dentro de un nuevo conjunto de tubos, etiquetados para cada analito.Utilice una punta de pipeta de 1000 microlitros para transferir cada solución de analito a la columna de centrifugación correspondiente. Una vez añadida la solución de analito, doble aproximadamente dos mililitros desde el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros y deje la punta dentro de la columna para usarla como agitador. Utilice las puntas de pipeta para agitar suavemente las columnas una vez cada dos o tres minutos.Después de 11 minutos, desenchufe las columnas y centrifúgelas durante 15 segundos a 2.400 G. Retire inmediatamente las columnas de centrifugación y colóquelas en nuevos tubos recolectores, guardando la solución del filtrado pero descartando los tapones. A las columnas, añada 300 microlitros de acetonitrilo y centrifúgelas durante 30 segundos a 9.600 G. Ahora transfiera las primeras soluciones del filtrado permetiladas a tubos de ensayo de vidrio silanizados que contengan 3,5 mililitros de tampón de fosfato sódico. Asegúrese de que el sobrenadante transferido esté claro y de que no se transfiera material sólido.Se habrá formado un pequeño pellet blanco en el fondo de los tubos de plástico. Evite transferir cualquier material sólido evidente. El incumplimiento provocará rendimientos pobres de los notas de glicanos de N-acetilcisteína-glucosamina.Vortex inmediatamente cada muestra del lote una vez que se hayan transferido todas las muestras. Luego, combine las soluciones del flujo de acetonitrilo con el resto del líquido en los tubos de ensayo respectivos. Nuevamente, evite transferir cualquier residuo sólido blanco durante este paso.Cierre, agite y vortexee las soluciones combinadas inmediatamente antes de pasar a la siguiente muestra. Después de la permetilación, añada 1.2 mililitros de cloroformo a cada tubo de ensayo dentro de una campana extractora. Luego cierre los tubos y mezcle los contenidos vigorosamente.Para separar las capas, centrifugue brevemente las soluciones a 3.000 G. Utilice una pipeta Pasteur para extraer y desechar la mayor parte de la capa acuosa superior, dejando aproximadamente tres mililitros de la capa restante. Añada 3,5 mililitros del tampón de fosfato de sodio 0,2 molar y luego tape, mezcle y centrifugue el tubo de ensayo. Realice este paso de extracción líquido/líquido un total de tres veces.Dejando aproximadamente un mililitro de la capa acuosa en la extracción final. Ahora use una pipeta pasteur limpia y silanizada para transferir cuidadosamente la capa de cloroformo a un tubo de ensayo de vidrio limpio y etiquetado, también silanizado, como se describe en el protocolo del texto. En un sistema de evaporación precalentado a 75 grados celsius, seque las muestras bajo un flujo suave de gas nitrógeno.Asegúrese de que el flujo de gas perturbe la superficie del líquido sin salpicarla. Una vez que las muestras estén secas, estarán listas para la hidrólisis. Añada 325 micro-litros de ácido trifluoroacético 2 Molar o TFA a cada muestra y mezcle bien.Cierre herméticamente cada tubo de muestra inmediatamente después de añadirlo a todas las muestras para evitar la evaporación de TFA y la pérdida de muestra durante el siguiente paso de calentamiento. Incube las muestras a 121 grados celsius durante dos horas para hidrolizar los glicanos. Mientras las muestras están incubando, prepare nuevamente el sistema de evaporación a 75 grados celsius.Después de la incubación, seque las muestras bajo una corriente constante de nitrógeno en el manifold de evaporación. Revise frecuentemente las muestras para asegurarse de que se sequen utilizando el tiempo mínimo de secado posible. A cada muestra, añada 475 micro-litros de borohidruro de sodio al 10 gramos por litro.Luego, mezcle las muestras completamente para disolver cualquier residuo. Tape las tubos de ensayo y deje que la reacción de reducción continúe durante una hora. A continuación, agregue 63 micro-litros de metanol a cada muestra.Mezcle y luego seque las muestras a 75 grados Celsius bajo nitrógeno. Añada 125 micro-litros de solución de metanol a ácido acético a cada muestra. Mezcle y luego seque nuevamente las muestras a 75 grados Celsius bajo nitrógeno.Asegúrese de que las muestras estén completamente secas colocándolas bajo vacío durante 20 minutos. Después del secado, agregue 18 micro-litros de agua desionizada a cada muestra. Luego, centrifugue brevemente las muestras y mézclelas bien para disolver cualquier precipitado.A continuación, agregue 250 micro-litros de anhídrido acético a cada tubo. Tape los tubos, vortexee completamente y someta las muestras a sonicación en un baño de agua durante dos minutos para asegurar la disolución completa de cualquier residuo. Luego, incube las muestras a 50 grados celsius durante 10 minutos.Ahora agregue 230 micro-litros de TFA concentrado a cada muestra. Después de tapar y mezclar las muestras, incúbelas durante 10 minutos a una temperatura interna de 50 grados celsius. Agregue 1.8 mililitros de diclorometano a cada muestra y mezcle bien.A continuación, agregue dos mililitros de agua desionizada al tubo y realice una extracción líquido/líquido dos veces. Recupere la capa de diclorometano con una pipeta Pasteur silanizada. Transfiera a un vial para auto-muestreador y luego seque la muestra bajo nitrógeno a 74 grados Celsius.Antes de la GC-MS, reconstituya cada muestra con 120 micro-litros de acetona, tapándolas y mezclándolas completamente. En modo dividido, utilice un muestreador automático para inyectar un micro-litro de cada muestra en el inserto del GC en modo dividido. Para espectrómetros de masas de tiempo de vuelo, se recomienda una relación de división de cuarenta y gas helio en modo de flujo constante a 0,8 mililitros por minuto.Analice la muestra utilizando un gradiente de dos pasos que alcance 325 grados celsius. Somete los componentes de la muestra eluidos a ionización por electrones. Para un analizador de masas por tiempo de vuelo, analice los fragmentos M sobre Z de 40 a 800 con una tasa de sumación de pulsos de 0,1 segundos.Para demostrar la sensibilidad de este protocolo, se procesó cuidadosamente una muestra biológica. El cromatograma resultante proporciona una intensidad adecuada entre los picos del producto deseado para facilitar la comparación y el análisis. Luego, se procesó la misma muestra biológica inicial con el mismo procedimiento.Pero el residuo blanco en la solución de permetilación que se centrifugó a través de la columna de NaOH se llevó a la mezcla subsiguiente para la extracción líquido/líquido. El cromatograma muestra una proporción diferente de intensidad de picos de los mismos productos clave de la muestra. Cuando se comparan directamente, la diferencia es evidente.La marcada disminución del pico de la N-acetilglucosamina en la posición 4 en el segundo cromatograma es un rasgo reconocible de una permetilación y extracción fallidas. Para apreciar la utilidad de este enfoque en la detección de diferencias en la composición de glicanos en estados patológicos, se normalizan y superponen los cromatogramas de iones extraídos de una muestra de plasma sanguíneo normal y de una muestra de plasma sanguíneo de un paciente con cáncer, respecto a los manosas 2-enlazados. Las diferencias cuantitativas en características únicas de los glicanos, como la ramificación beta 1-6, así como la sialilación deficiente, son claramente evidentes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de nodos de glicanos en glicómica de abajo hacia arriba. Esto facilita la distinción de características interesantes de los glicanos, como la corfulcosilación, la sick cialilación y el glicanito bisectante, en señales analíticas individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

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Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

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