El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

El objetivo general de este procedimiento es descomponer todos los glicanos en una muestra biológica mientras se conserva la composición de los monosacáridos y la información de enlace. Facilitar la destilación de características de glicanos interesantes, como la cialalación enferma y la bisección de N-acetilglucosamina en señales analíticas únicas. Este método puede ayudar a responder directamente a preguntas clave en el campo de los glicomías, como qué características únicas de los glicanos se alteran en estados de enfermedad particulares.

La principal ventaja de esta técnica es que las características de los glicanos que tienden a alterarse en la enfermedad, como la ramificación beta 1-6 y la corfulcosulado, se destilan en señales analíticas individuales en lugar de dispersarse en múltiples glicanos intactos. En general, las personas que necesitan hacer este método realmente luchan con bajos niveles de N-acetilcisteínas debido al procesamiento inadecuado de glicanos permetilados frescos. Prepare las muestras, transfiriendo primero nueve microlitros de cada analito biológico a tubos de ensayo separados de 1,5 mililitros.

A cada muestra, agregue un microlitro de agua desionizada y 270 microlitros de DMSO de alta pureza. Y mezclar vigorosamente por vórtice. Después de la preparación de la muestra, ensamble las columnas de centrifugación cargadas con hidróxido de sodio como se describe en el protocolo de texto.

Con una jeringa analítica, agregue 105 microlitros de yodometano a cada analito e inmediatamente tape los tubos. Vórtice completamente las muestras. Desenchufe las columnas de centrifugación preparadas anteriormente y centrifuérrelas durante 15 segundos a 2, 400 Gs. Después de desechar los tubos del depósito y el afluente, vuelva a tapar las columnas y colóquelas dentro de un nuevo juego de tubos, etiquetados para cada analito.

Utilice un cabezal de tubo de 1000 microlitros para transferir cada solución de analito a la columna de centrifugación correspondiente. Una vez que se agrega la solución de analito, engarce unos dos mililitros desde el extremo de la punta de la cabeza de una tubería de 200 microlitros y deje la punta en la columna para usarla como agitador. Use las puntas de la cabeza de la pipa para remover suavemente las columnas una vez cada dos o tres minutos.

Después de 11 minutos, desconecte las columnas y centrifuérrelas durante 15 segundos a 2, 400 Gs. Retire inmediatamente las columnas de centrifugado y colóquelas en nuevos tubos de depósito, ahorrando la solución de flujo pero desechando los tapones. A las columnas, agregue 300 microlitros de acetonenitrilo y centrifuérrelas durante 30 segundos a 9, 600 Gs. Ahora transfiera las primeras soluciones de flujo permetilado a tubos de ensayo de vidrio silanizado que contengan 3,5 mililitros de tampón de fosfato de sodio. Asegúrese de que el supernanado transferido sea transparente y que no se transfiera material sólido.

Se habrá formado una pequeña bolita blanca en la parte inferior de los tubos de plástico. Evite transferir cualquier material sólido obvio. De lo contrario, se obtendrán bajos rendimientos de notas de N-acetilcisteína-glicanos de glucosamina.

Realice un vórtice inmediato de cada muestra en el lote una vez que se hayan transferido todas las muestras. A continuación, combine las soluciones de acetonenitrilo con el resto del líquido en los tubos de ensayo respectivos. Nuevamente, evite transferir cualquier residuo sólido y blanco durante este paso.

Tapar, agitar y agitar las soluciones combinadas inmediatamente antes de pasar a la siguiente muestra. Después de la permetilación, agregue 1,2 mililitros de cloroformo a cada tubo de ensayo dentro de una campana extractora. A continuación, tape los tubos y mezcle el contenido vigorosamente.

Para separar las capas, centrifugar brevemente las soluciones a 3, 000 Gs. Use un cabezal de tubería de pasto para extraer y desechar la mayor parte de la capa acuosa superior, dejando unos tres mililitros de la capa. Agregue 3,5 mililitros del tampón de fosfato de sodio 0,2 molar y luego tape, mezcle y centrifugue el tubo de ensayo. Ejecute este paso de extracción líquido/líquido un total de tres veces.

Dejando alrededor de un mililitro de la capa acuosa en la extracción final. Ahora use un cabezal de tubería de pasto silanizado limpio para transferir cuidadosamente la capa de cloroformo a un tubo de ensayo de vidrio silanizado limpio y etiquetado como se describe en el protocolo de texto. En un colector de evaporación precalentado, ajustado a 75 grados centígrados, seque las muestras bajo un suave chorro de gas nitrógeno.

Asegúrese de que el flujo de gas perturbe la superficie del líquido pero sin salpicarlo. Una vez que las muestras están secas, están listas para la hidrólisis. Agregue 325 microlitros de ácido trifluoroacético 2 molar o TFA a cada muestra y mezcle bien.

Tape herméticamente cada tubo de muestra inmediatamente después de agregarlo a todas las muestras para evitar la evaporación de TFA y la pérdida de muestra durante el paso de calentamiento posterior. Incubar las muestras a 121 grados centígrados durante dos horas para hidrolizar los glicanos. Mientras se incuban las muestras, nuevamente, prepare el colector de evaporación a 75 grados centígrados.

Después de la incubación, seque las muestras bajo un flujo constante de nitrógeno en el colector de evaporación. Revise con frecuencia las muestras para asegurarse de que se hayan secado utilizando la mínima cantidad de tiempo de secado posible. A cada muestra, agregue 475 microlitros de 10 gramos por litro de borohidruro de sodio.

Y luego mezcle bien las muestras para disolver cualquier residuo. Tape los tubos de ensayo y deje que la reacción de reducción continúe durante una hora. A continuación, añada 63 microlitros de metanol a cada muestra.

Mezclar y luego secar las muestras a 75 grados centígrados bajo nitrógeno. Agregue 125 microlitros de metanol a la solución de ácido acético a cada muestra. Mezclar y volver a secar las muestras a 75 grados centígrados bajo nitrógeno.

Asegúrese de que las muestras estén completamente secas colocándolas al vacío durante 20 minutos. Después del secado, agregue 18 microlitros de agua desionizada a cada muestra. A continuación, centrifugar las muestras brevemente y mezclarlas bien para disolver un precipitado.

A continuación, agregue 250 microlitros de anhídrido acético a cada tubo. Tape los tubos, haga un vórtice completo y sonique las muestras en un baño de agua durante dos minutos para garantizar la disolución completa de cualquier residuo. A continuación, incubar las muestras a 50 grados centígrados durante 10 minutos.

Ahora agregue 230 microlitros de TFA concentrado a cada muestra. Después de tapar y mezclar las muestras, incubarlas durante 10 minutos a una temperatura interna de 50 grados centígrados. Agregue 1,8 mililitros de diclorometano a cada muestra y mezcle bien.

A continuación, agregue dos mililitros de agua dionizada al tubo y realice la extracción líquido/líquido dos veces. Recupere la capa de diclorometano con una cabeza de tubería de pasto silanizada. Transfiera a un vial de muestreador automático y luego seque la muestra bajo nitrógeno a 74 grados centígrados.

Antes de la GC-MS, reconstituya las muestras con 120 microlitros de acetona cada una, tapándolas y mezclándolas completamente. En el modo dividido, utilice un muestreador automático para inyectar un microlitro de cada muestra en el revestimiento de modo dividido GC. Para los espectrómetros de masas de tiempo de vuelo, se recomienda una relación dividida de cuarenta y gas helio en modo de flujo constante a 0,8 mililitros por minuto.

Analice la muestra utilizando un gradiente de dos pasos que alcance los 325 grados centígrados. Someta los componentes de la muestra eludidora a la ionización de electrones. Para un analizador de masas de tiempo de vuelo, analice fragmentos M sobre Z 40 a 800 con una tasa de suma de pulsos de 0,1 segundos.

Para demostrar la sensibilidad de este protocolo, se procesó cuidadosamente una muestra biológica. El cromatograma resultante proporciona una intensidad adecuada entre los picos de producto deseados para facilitar la comparación y el análisis. A continuación, se procesó la misma muestra biológica inicial con el mismo procedimiento.

Pero el residuo blanco en la solución de permetilación que se hizo girar a través de la columna de NAOH se llevó a la mezcla posterior para la extracción líquido/líquido. El cromatograma proporciona una relación diferente de la intensidad máxima de los mismos productos de muestra clave. Cuando se compara directamente, la diferencia es marcada.

La clara depresión del pico de N-acetilglucosamina enlazado en 4 posiciones en el segundo cromatograma es un rasgo reconocible de una permetilación y extracción fallidas. Para apreciar la utilidad de este enfoque en la detección de diferencias en la composición de glicanos en estados de enfermedad, los cromatogramas iónicos extraídos de una muestra de plasma sanguíneo normal y una muestra de plasma sanguíneo de un paciente con cáncer, se normalizan para manos 2 unidas y se superponen. Las diferencias cuantitativas en las características únicas de los glicanos, como la ramificación beta 1-6, así como la cialación enferma, son evidentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo el análisis de ganglios glicanos glucómicos de abajo hacia arriba. Facilita la destilación de características interesantes de glicanos, como la corfulcosuración, la cialalación enferma y la bisección de la glicanita en señales analíticas únicas.