Name: A todo el montaje In Situ Método de hibridación para el molusco gasterópodo Lymnaea stagnalis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda la hibridación in situ en montaje completo para visualizar patrones de expresión génica en embriones y larvas de Lymnaea stagnalis. Este método optimiza la biología del desarrollo y la investigación evo-devo.

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Este trabajo fue apoyado por fondos a través de DJJ proyecto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Los siguientes pasos se describe nuestro método para llevar a cabo un experimento in situ en las fases embrionarias y las larvas de L. stagnalis. Cuando un paso implica el uso de un producto químico peligroso esto se indica mediante la palabra &quot;PRECAUCIÓN&quot; y todos los procedimientos de seguridad adecuados debe ser adoptada. Los enlaces a las hojas MSDS representativos de los productos químicos peligrosos están dentro de Archivo 1. Recetas para todos los reactivos están dentro del archivo complementaria 2. 1. Montaje de Decapsulation Aparato <ol><li> Para ello, conectar una jeringa desechable ml 20 a un tubo de silicio (con un diámetro interior de 1 mm y un diámetro exterior de 3 mm) utilizando un corte de punta P1,000 a una longitud adecuada como se muestra en la Figura 2A. </li><li> Cinta de un portaobjetos de microscopio estándar a una placa de Petri grande invertida. Tape el tubo de silicona inmediatamente adyacente al portaobjetos de microscopio como se muestra en la figura60; 2C y 2D. </li><li> Descansar un aguja de vidrio tirado en el portaobjetos de un microscopio y suavemente insertarlo en el tubo de silicona hasta que la punta de la aguja sobresale aproximadamente el 20% del camino a través del diámetro interior del tubo (véase la Figura 2C y 2D). Una vez que la aguja está en posición de la cinta hacia abajo a la placa de Petri. </li><li> Deje que el extremo libre del tubo de silicona para descansar en otra placa de Petri que recogerá el material decapsulado. </li></ol> 2. Recolección de muestras, fijación y Decapsulation NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. <ol><li> Recoger con cuidado cadenas de huevo de las paredes de un acuario. Para ello, utilice una pieza plana de plástico flexible, como una espátula para raspar la cadena de huevo del sustrato, y el uso de un colador de té de plástico para pescar la cadena de huevo flotando fuera del agua. Escenario y clasificar el material bajo un microscopio utilizando la guía proporcionada en la figura1. </li><li> Coloque la cadena de huevo sobre una toalla de papel y hacer una incisión longitudinal a lo largo de la masa de huevos usando las pinzas de peso pluma. Rollo de las cápsulas de huevos fuera de la cadena de huevo y eliminar la mayor cantidad del material gelatinoso como sea posible de cada cápsula empujándolos alrededor de la toalla de papel utilizando las pinzas de peso pluma. </li><li> El uso de las pinzas de peso pluma, transferir las cápsulas de huevos en una placa de Petri que contiene 5 ml de agua del grifo. Continuar para recoger cápsulas de huevos de-gelatina de las etapas de desarrollo deseados en este plato. Recoger suficientes cápsulas de todas las etapas de desarrollo para el experimento WMISH previsto a continuación, proceder al siguiente paso. </li><li> Cuando se trabaja con larvas más desarrolladas (5 días después de la primera división (CPFD) y mayores) anestesiar a ellos antes de la fijación. NOTA: Esto evitará que los músculos se contraigan lo que hace que la interpretación de los patrones de tinción in situ en muy difíciles. <ol><li> Relax larvas (mientras que todavía están en su capsules) en una solución de 2% w / v de MgCl 2 • 6H 2 O durante 30 min antes de la fijación. </li><li> Evaluar el grado de relajación después de 30 minutos, sumergiendo varios mientras que las larvas todavía en sus cápsulas de huevos en la solución de fijación y el seguimiento de su respuesta bajo un microscopio. Incompletamente larvas relajado se retraerá en sus conchas, mientras que las larvas totalmente relajado no responderá. Una vez que estas larvas se han relajado proceder al siguiente paso. </li></ol></li><li> Transferir las cápsulas de huevos usando una amplia pipeta de plástico orificio en un tubo sellable que proporciona 10 veces el volumen de cápsulas de huevos (por ejemplo., 1 ml de cápsulas asentado requeriría un tubo 10+ ml). </li><li> Aspirar tanto líquido como sea posible desde el tubo y reemplazarlo con un volumen de solución de fijación que es 10 veces el volumen de las cápsulas de huevos asentadas. Gire suavemente las cápsulas de huevos en fijador a temperatura ambiente durante el tiempo apropiado para cada etapa de desarrollo (ver Figura 1). </li><li> Discontinue la rotación y permitir que las cápsulas se hunden y aspirar la solución de fijación en un recipiente apropiado para desechos. </li><li> Se lavan las cápsulas de huevos mediante la sustitución de la solución de fijación con salina tamponada con fosfato con 0,1% Tween-20 (PBTw) y girando a TA durante 5 min. Aspirar el PBTw y repetir dos veces. </li><li> Eliminar embriones y larvas de sus cápsulas utilizando el aparato (véase la sección 1 para más detalles) se muestra en la Figura 2. Dibuje las cápsulas en la jeringa de 20 ml, conectar el tubo y luego disipar las cápsulas a través de la tubería y más allá de la aguja de vidrio hacia el plato de recogida. NOTA: Normalmente, la mayoría (&gt; 90%) de todas las cápsulas debe necesitar solamente un paso a través del dispositivo. En muchos casos, la membrana de la cápsula está dañado pero embriones y larvas permanecen dentro de la cápsula rota. Reprocesar este material simplemente su elaboración en la jeringa y disipar nuevo. </li><li> Recoger los embriones y larvas decapsulados en un tubo de 1,5 ml usando un micrófonoropipette (a P20 para el 0 - larvas de 3 días, y P200 para las larvas mayores con el extremo de la punta cortados). NOTA: Una pausa (hasta varios meses) en el protocolo se pueden hacer en esta etapa. Si esto es necesario, el material decapsuled se debe recoger en un tubo de 1.5 ml para el almacenamiento (continuar con el paso siguiente). De lo contrario seguirá inmediatamente al Protocolo 3. </li><li> Permitir que los embriones y larvas se hundan a la parte inferior del tubo y aspirar el sobrenadante. Reemplazar con 33% de etanol (EtOH) en PBTw y dejar reposar durante 5 - 10 minutos a. Repetir con 66% de EtOH en PBTw y EtOH al 100%. Lavar las larvas de dos veces en 100% de EtOH a TA. Almacenar el material a -20 ° C en EtOH al 100%. </li><li> Cuando esté listo para continuar, re-hidratar las muestras mediante la eliminación del 100% de EtOH y reemplazar con un 66% de EtOH en PBTw, deje reposar durante 5 - 10 minutos a. Repetir con 33% de EtOH en PBTw, deje reposar durante 5 - 10 minutos a. Finalmente se lava con 3 x 5 min lavados de PBTw para asegurar que todos EtOH se retira. </li></ol> 3. proteinasa-K, TEA y Post-fijación NOTA: nos encontramos realizando los pasos siguientes en pequeñas cestas con un suelo de malla, el método más eficiente y suave para intercambiar rápidamente soluciones de tiempo crítico. Mientras que éstos se pueden hacer en casa, utilizamos cestas (tamaño mediano) que son compatibles con la manipulación de líquidos robot Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tales cestas pueden ser rápida y fácilmente movidos entre los pocillos de una placa de cultivo tisular bien 12 (TCD) con el fin de soluciones de intercambio, o la solución pueden ser aspiradas desde el pozo utilizando una pipeta. Alternativamente, todos los intercambios de solución se pueden realizar sin estas cestas simplemente aspirar el sobrenadante de las larvas. En este caso un movimiento de remolino suave se concentrará todos los embriones y larvas al centro del plato permite que el sobrenadante a ser retirado del borde del pozo. Lo siguiente asume que el usuario está empleando cestas para el intercambio de soluciones. <ol><li> Usando una pipeta, Embriones y larvas de transferencia en una cesta que se sienta en un TCD 12 bien con 2 ml de PBTw. NOTA:. El número de embriones y / o larvas que se pueden añadir depende de la etapa de desarrollo siendo investigado, sin embargo, una regla general es la de mantener al menos el 25% de la superficie de suelo libre de embriones / larvas (es decir, no hacer saturar la canasta). </li><li> Preparar una adyacente bien con 2 ml de la solución de proteinasa-K apropiado (véase la Figura 1), y otro 2 pocillos con 2 ml de 0,2% de glicina cada uno. Mover cada cesta dentro del pozo que contiene la concentración apropiada de la proteinasa-K e iniciar inmediatamente la sincronización. </li><li> Después de 10 min mover cada cesta en un pozo que contiene 0,2% de glicina y se incuba durante 5 min. A continuación, pasar cada cesta en el segundo bien con 0,2% de glicina y se incuba durante 5 min. Lavar la glicina con 3 x 5 min intercambios de 3 ml PBTw. </li><li> Eliminar la solución de PBTw y tratar las muestras una vez con sol recién preparada trietanolamina (TEA)lución durante 5 min PRECAUCIÓN: No agite. Reemplazar con 3 ml de solución de TEA recién preparado durante 5 min. No agite. Aspirar la mayoría de la solución de TEA de las muestras. Añadir la trietanolamina recién preparada con una solución de anhídrido acético (TEAAA) e incubar durante 5 min. PRECAUCIÓN! No agite. </li><li> OPCIONAL - Si bien el paso anterior está incubando, preparar otro lote de solución TEAAA y repita el paso anterior. NOTA: Este segundo tratamiento con TEAAA es opcional, pero puede ayudar a eliminar por completo todos los antecedentes con sondas con tendencia a la generación de fondo. </li><li> Eliminar la solución de TEAAA mediante la aspiración del pozo, y reemplazar con 3 ml de PBTw. No agite. Retire el PBTw y aplicar 3 ml de formaldehído al 3,7% en PBTw. Hacer girar suavemente de vez en cuando durante una incubación de 30 min. </li><li> Retire el fijador mediante la aspiración del pozo, y reemplazar con 3 ml de PBTw. Transferir el material en un tubo de 1,5 ml. REColoque la PBTw con tampón de hibridación y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente - PRECAUCIÓN. </li><li> Colocar los tubos en un bloque caliente a temperatura ambiente, y ajustar la temperatura a la temperatura de hibridación deseada. NOTA: La temperatura de hibridación es la sonda específica y tendrá que ser optimizado empíricamente, sin embargo, nos encontramos con 55 ° C a ser una buena temperatura al principio de prueba. Deje que el bloque para llegar a la temperatura de hibridación, y permitir que las muestras de pre-hibridan durante aproximadamente 15 minutos (es decir, el tiempo que se necesita para preparar las ribosondas, ya no es necesario). Preparar volúmenes adecuados (normalmente 100 mu l) de las ribosondas diluidas. Nos típicamente concentraciones de sonda de prueba de 100 y 500 ng / ml como un rango inicial. Preparamos ribosondas de acuerdo con la 12. </li><li> Retire el tampón de hibridación de las muestras y añadir la sonda en tampón de hibridación a las muestras. Overlay con 100 l (o un volumen adecuado para formar una fase por encima de la buffe hibridaciónr) de aceite mineral. NOTA: El aceite mineral impide extensa condensación que se forma durante la larga etapa de hibridación. Amplia condensación alterará significativamente tanto la química de la solución de hibridación y la concentración de la sonda. </li><li> Desnaturalizar la sonda y el ARN diana mediante el calentamiento de las muestras a 75 ° C durante 10 min, a continuación, reducir el calor a la temperatura de hibridación deseada. Permitir la hibridación de proceder durante un mínimo de 12 horas (O / N) o más largo (24 a 48 h). </li><li> Durante la hibridación eliminar un solo tubo del bloque de calor, girar rápidamente entre el pulgar y el dedo índice de suspender las larvas sin molestar a la fase de aceite, y reemplazarlo en el bloque de calor. Repita esto una vez cada 6 - 12 horas más o menos. </li></ol> 4. Se lava y calientes inmunodetección NOTA: Mientras se utiliza un robot de manejo de líquidos para los pasos siguientes, éstas también pueden ser fácilmente realizan manualmente. En este caso, los embriones y larvas shoULD se mantendrá en los tubos de 1,5 ml que se hibridan en. Todos los intercambios de soluciones posteriores se aspiran y se añadió con una pipeta P1,000. Cuando se realiza manualmente cada uno de los siguientes pasos se deben emplear 1 ml de cada solución. <ol><li> volúmenes adecuados de calor (3 ml cada una para cada muestra) de la 4x, 2x y 1x soluciones de lavado a la temperatura de hibridación. </li><li> Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 4x para 15 min cada uno a la temperatura de hibridación. Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 2x durante 15 min cada uno a la temperatura de hibridación. Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 1x durante 15 minutos cada uno a la temperatura de hibridación. </li><li> Lavar todas las muestras una vez con tampón 1x de cloruro de sodio Citrato de sodio + 0,1% Tween (SSC + 0,1% de Tween) a la temperatura de hibridación. Dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Lave todas las muestras dos veces en 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Reemplazar esta solución SSC 1x con el tampón de ácido maleico (MAB) y dejar reposar durante 10 minutos Repetir el MAB wceniza. Reemplazar el MAB con solución de bloqueo y se incuba durante 1,5 horas. </li><li> Intercambiar la solución de bloques para la solución de anticuerpo (1: 10.000 dilución de anticuerpo en solución de bloqueo) y se incuba durante 12 hr (O / N) a TA con agitación suave. </li></ol> 5. El desarrollo del color y de montaje <ol><li> Aspirar la solución de anticuerpo y lavar 15 veces con PBTw de 10 min cada uno. Reemplazar PBTw con 1x tampón de fosfatasa alcalina (AP) y se incuba durante 10 min. </li><li> Mientras que la etapa de incubación superiores a los ingresos, preparar la solución de tinción de AP (ver archivo complementaria 2) - PRECAUCIÓN. Transferir el material en un TCD bien y reemplazar la solución de AP 1x con solución de tinción AP. Tenga en cuenta el tiempo para que la longitud de tiempo que la reacción de color se lleva a cabo para se pueden grabar. Supervisar el desarrollo de el patrón de tinción hasta que la relación de señal a fondo es óptima. </li><li> Para detener el desarrollo del color, eliminar la solución de tinción 1x AP (disponer en el que eras apropiadae contenedor), y aplicar 2 ml de PBTw y tenga en cuenta la hora actual. Enjuague dos veces más con PBTw de 5 min cada uno. Utilice uno de estos enjuagues para transferir el material en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Eliminar la PBTw y aplicar 1 ml de 3,7% de formaldehído en PBTw y agitar o girar para menos 30 minutos a temperatura ambiente (esto también se puede hacer O / N). </li><li> Lavar el fijador con 3 lavados de PBT (deseche el fijador de residuos en un recipiente apropiado para desechos). Se lavan las muestras 3 veces a 50 ° C en agua desionizada. NOTA: Estos lavados eliminan la precipitación de sales que pueden ser visibles durante la limpieza y los pasos de visualización. </li><li> Decidir si las muestras se deben montar en benzoato de bencilo: Alcohol bencílico (BB: BA, también conocido como clara de Murray) o glicerol. NOTA: Preferimos el más poderoso agente de eliminación BB: BA como L. embriones stagnalis son algo opaca. Las muestras que se montan en BB: BA primero tendrá que estar deshidratado a través de una serie de etanol. Las muestras para ser montado en el 60%glicerol se puede montar inmediatamente. </li><li> La transferencia de las muestras en la solución de montaje (BB: BA o glicerol al 60%) con una pipeta. NOTA: Si se monta el BB: BA esto debe hacerse en un vaso bien (BB: BA va a derretir el plástico de policarbonato). </li><li> Dejar que las muestras para despejar el 5 - 10 minutos, y luego montarlos en un portaobjetos utilizando un número apropiado de cubreobjetos apilados como espaciadores (1 cubreobjetos para muestras &lt;1, 2 CPFD cubreobjetos para muestras&gt; 1 CPFD). NOTA: su conjunto se monta ahora se pueden obtener imágenes con un microscopio compuesto con DIC óptica. </li></ol>

<ol><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrusca%2C+RC+%22Invertebrates%22">Invertebrates</a>. , Sinauer. Sunderland. (2002).</li>
<li>Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en">http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en</a> (2013).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+in+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Week.+Epi.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li>
<li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula.%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rep%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li>
<li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+gene+expression+with+larval+competence%2C+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li>
<li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel%2C+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li>
<li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li>
<li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+set+of+maternal+genes%3F+Insights+from+a+molluscan+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li>
<li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage%2C+with+special+reference+to+its%27+chemical+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li>
<li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod%2C+Lymnaea+palustris.%2C+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li>
<li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Emb.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li>
<li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li>
<li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li>
<li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li>
<li>Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).</li>
<li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15(2013).</li>
<li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li>
<li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).</li>
<li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited%2C+lateralized+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li>
<li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li>
<li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li>
<li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745(2011).</li>
<li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+%28LCav-beta%29+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).</li>
<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+genome+size+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método aquí descrito permite la visualización eficaz de transcritos de ARN con presumiblemente diferentes niveles de expresión dentro de todas las etapas de desarrollo de Lymnaea stagnalis. Para eliminar los embriones y larvas de sus cápsulas que probó una variedad de productos químicos, choque osmótico y tratamientos físicos reportados para otro encapsulated- el desarrollo de organismos modelo. Sin embargo, en nuestras manos el método que describimos aquí es la única técnica de alto rendimiento que elimina ...

Los moluscos son un grupo de animales que mantienen el interés de una amplia diversidad de disciplinas científicas. A pesar de su diversidad morfológica 1, la riqueza de especies (en segundo lugar solamente a los artrópodos en términos de número de especies 2) y relevancia para una amplia gama de comerciales 3, 4 médicos y científicos cuestiones 5-8, hay relativamente pocas especies de moluscos que puede presumir de ser ambos modelos científicos bien equipados y fácil de mantener en un entorno de laboratorio. Uno de moluscos que se utiliza mucho por disciplinas como la neurobiología 9, 10 ecotoxicología y más recientemente la biología evolutiva 11,12, es Lymnaea stagnalis, sobre todo debido a su amplia distribución y la extrema facilidad de mantenimiento. A pesar de su popularidad como un organismo &quot;modelo&quot; y su larga historia de uso por los biólogos del desarrollo 13-19, el alcance y la potencia de las herramientas moleculares disponibles para el L. StAGNalis comunidad científica se encuentra muy por detrás de la de los modelos más tradicionales de origen animal (Drosophila, el ratón, el erizo de mar, nematodos). Nuestro deseo de desarrollar Lymnaea como un modelo molecular se debe a un interés en los mecanismos moleculares que guían la formación de la cáscara. Esto nos ha motivado para filtrar un conjunto de técnicas que permitan la visualización eficiente, consistente y sensible de la expresión génica durante el desarrollo de Lymnaea &#39;s. Todo el montaje hibridación in situ (WMISH) se emplea extensamente para una variedad de organismos modelo y ha estado en uso durante más de 40 años 20. En sus diferentes aspectos, ISH puede emplearse para localizar espacialmente loci específicos en los cromosomas, rRNA, mRNA y micro-ARN. Uno de los retos que se necesita para responder antes de perfeccionar un método para L. WMISH stagnalis fue el tema de la extracción con suavidad y eficacia embriones y larvas para distintas etapas de tél cápsulas de huevos en los que se depositan. Esta extracción, o &#39;decapsulación&#39;, que se debe lograr de manera eficiente con el fin de recoger el material adecuado para un determinado experimento in situ, mientras que al mismo tiempo mantener la integridad morfológica y celular. Mientras que otros organismos modelo también se someten a desarrollo encapsulado, en nuestras manos ninguno de los métodos informados para aquellas especies podría emplear con éxito en L. stagnalis. Los objetivos generales de este método son, por lo tanto: para extraer L. stagnalis embriones y larvas de sus cápsulas en una forma de alto rendimiento, que se aplican tratamientos de pre-hibridación que optimizan la señal WMISH, para preparar embriones y larvas con WMISHsignals satisfactorios para la formación de imágenes.

<table><tbody><tr><td>Pinza de peso pluma</td><td>Ehlert & Socio</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 placas de cultivo de tejidos de pocillos</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>PRECAUCIÓN - Puede causar cáncer. Tóxico por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, en contacto con la piel y en caso de ingestión.</td></tr><tr><td>Ácido etilendiamina tetraacético</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>PRECAUCIÓN - CAUSA IRRITACIÓN OCULAR. PUEDE CAUSAR IRRITACIÓN DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS Y DE LA PIEL. Evite respirar polvo. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. Úselo solo con ventilación adecuada</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>PRECAUCIÓN - Puede ser dañino si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll tipo 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polivinilpirrolidona K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>PRECAUCIÓN - Puede ser perjudicial si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere.</td></tr><tr><td>Libre de nucleasaAlbúmina sérica bovina</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Esperma de salmón</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>PRECAUCIÓN - LOS EFECTOS ADVERSOS INCLUYEN HEMORRAGIA, IRRITACIÓN LOCAL. POSIBLE REACCIÓN ALÉRGICA EN CASO DE INHALACIÓN, INGESTA/CONTACTO. IRRITANTE DE OJOS/PIEL/VÍAS RESPIRATORIAS. POSIBLE HIPERSENSIBILIZACIÓN. SE HA REPORTADO QUE DURANTE EL EMBARAZO AUMENTA EL RIESGO DE MUERTE FETAL</td></tr><tr><td>Proteinasa-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>PRECAUCIÓN - Irritante para los ojos y la piel. Puede ser perjudicial por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar daño al feto. Higroscópico.</td></tr><tr><td>Formamida estándar</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>PRECAUCIÓN - Irritante para los ojos y la piel. Puede ser perjudicial por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar daño al feto. Higroscópico.</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>PRECAUCIÓN - Evite respirar vapor o neblina. Evite el contacto con los ojos. Evite el contacto prolongado o repetido con la piel. Lavar bien después de la manipulación.</td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>PRECAUCIÓN - CAUSA QUEMADURAS GRAVES EN LA PIEL Y LOS OJOS. REACCIONA VIOLENTAMENTE CON EL AGUA. DAÑINO SI SE INGIERE. VAPOR IRRITANTE PARA LOS OJOS Y LAS VÍAS RESPIRATORIAS</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>PRECAUCIÓN - Muy peligroso en caso de contacto con los ojos (irritante), de ingestión, . Peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), de inhalación (irritante pulmonar). Ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (permeador). Corrosivo para los ojos y la piel.</td></tr><tr><td>Benzoato de bencilo</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>PRECAUCIÓN - Puede ser dañino si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Nocivo si se ingiere.</td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>PRECAUCIÓN - Nocivo si se ingiere. Nocivo si se inhala. Causa irritación ocular grave.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Polvo bloqueador</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragmentos AP conjugados</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro azul cloruro de tetrazolio en dimetilformamida&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>PRECAUCIÓN - Puede causar daño al feto. Nocivo por inhalación y en contacto con la piel. Irritante para los ojos.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>PRECAUCIÓN - Potencialmente dañino si se ingiere. No entre en contacto con la piel, los ojos ni la ropa. Posible irritante de la piel y los ojos.</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>PRECAUCIÓN - Puede causar irritación en los ojos y la piel. Puede causar irritación del tracto respiratorio y digestivo. Las propiedades toxicológicas de este material no se han investigado a fondo.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>PRECAUCIÓN - Puede ser perjudicial si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere.</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>PRECAUCIÓN - Nocivo si se ingiere. Tóxico en contacto con la piel. Causa irritación de la piel. Causa daños oculares graves. Puede causar irritación respiratoria.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato disódico dihidratado (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tri dihidratado (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>PRECAUCIÓN - Puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Las propiedades toxicológicas de este material no se han investigado a fondo.</td></tr><tr><td>Aceite mineral&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a todo el montaje<em&gt; in situ</em&gt; método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; lymnaea stagnalis</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Todo el montaje hibridación in situ (WMISH) es una técnica que permite la resolución espacial de las moléculas de ácido nucleico (a menudo ARNm) dentro de una preparación de tejido &quot;todo monte &#39;, o etapa de desarrollo (tal como un embrión o larva) de interés. WMISH es extremadamente potente, ya que puede contribuir de manera significativa a la caracterización funcional de los metazoos genomas complejos, un reto que se está convirtiendo en un cuello de botella con el diluvio de datos de secuencias de próxima generación. A pesar de la simplicidad conceptual de la técnica mucho tiempo es a menudo necesaria para optimizar los distintos parámetros inherentes a los experimentos WMISH para nuevos sistemas de modelo; diferencias sutiles en las propiedades celulares y bioquímicas entre tipos de tejidos y etapas del desarrollo significa que un único método WMISH puede no ser apropiada para todas las situaciones. Hemos desarrollado una serie de métodos para WMISH las reemergentes modelo gasterópodo Lymnaea stagnalis que generan consistente yseñales WMISH claras para una gama de genes, y en todas las etapas de desarrollo. Estos métodos incluyen la asignación de las larvas de la edad cronológica desconocido a una ventana ontogénica, la eliminación eficiente de los embriones y larvas de sus cápsulas de huevos, la aplicación de un tratamiento de proteinasa-K apropiado para cada ventana ontogénica, y la hibridación, después de la hibridación y la inmunodetección pasos. Estos métodos proporcionan un fundamento a partir del cual la señal resultante de una transcripción de ARN dada puede ser refinado con ajustes específicos de la sonda (sonda principalmente la concentración y la temperatura de hibridación).

Los patrones de tinción WMISH representativo mostrado en la Figura 3 se generaron utilizando la técnica descrita anteriormente, y reflejan una variedad de patrones de expresión espacial de genes implicados en una serie de procesos moleculares que varían de formación de la cáscara (gen Novel 1, 2, 3 y 4), a la señalización célula-célula (Dpp) para regulación de la transcripción (Brachyury) a través de una gama de etapas de desarrollo. S...

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios un conjunto de métodos para la desencapsulación de alto rendimiento de embriones y larvas de Lymnaea stagnalis en preparación para la hibridación in situ de montaje completo, y para posteriores tratamientos de pre y post-hibridación.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

El objetivo general de este protocolo es visualizar de manera eficiente los patrones espaciales de expresión de genes individuales en preparaciones completas de embriones y larvas del gasterópodo de agua dulce Lymnaea stagnalis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la Evo-Devo y la biología del desarrollo, como dónde y cuándo se expresan los genes, cómo interactúan entre sí y cuáles podrían ser sus funciones específicas. La principal ventaja de esta técnica es que la eliminación del material embrionario y larval de sus cápsulas de huevo es rápida, sencilla y eficaz.Este material se clasifica luego según un mapa de desarrollo que proporcionamos en el material suplementario y después se procesa mediante pasos previos específicos a cada etapa antes de la hibridación. Para comenzar este procedimiento, conecte una jeringa desechable de 20 mililitros a un tubo de silicona. A continuación, sujete con cinta adhesiva un portaobjetos estándar a una placa de Petri invertida grande.Luego, sujete con cinta el tubo de silicona inmediatamente adyacente a la lámina del microscopio. A continuación, coloque una aguja de vidrio estirada sobre la lámina del microscopio. E insértela suavemente en el tubo de silicona hasta que la punta de la aguja sobresalga aproximadamente un 20 % del diámetro interno del tubo.Una vez que la aguja esté en posición, sujétela con cinta adhesiva al recipiente de Petri. Deje que el extremo libre del tubo de silicona descanse en otro recipiente de Petri que recolectará el material desencapsulado. Para recolectar las cepas de huevos de las paredes de un acuario, utilice un trozo de plástico plano y flexible como espátula para raspar la cepa de huevos del sustrato.Y utilice un colador de plástico para extraer del agua la cepa de huevos flotantes. A continuación, clasifique y ordene el material bajo el microscopio según esta guía. Coloque la cepa de huevos sobre una toalla de papel y realice una incisión longitudinal a lo largo de la masa de huevos utilizando la pinza de peso ligero.Luego, enrolle las cápsulas de huevo fuera del filtro de huevo y elimine la mayor cantidad posible del material gelatinoso de cada cápsula moviéndola sobre la toalla de papel. A continuación, utilizando la pinza de peso ligero, transfiera las cápsulas de huevo a una placa de Petri que contenga 5 mililitros de agua del grifo. Continúe recolectando cápsulas de huevo desgelatinizadas de las etapas de desarrollo deseadas en este recipiente.Recolecte suficientes cápsulas de todas las etapas de desarrollo para el experimento de HISH en todo el organismo planeado antes de pasar al siguiente paso. Ahora, relaje larvas mayores de cinco días posteriores a la primera división en una solución al 2% peso/volumen de cloruro de magnesio hexahidratado durante 30 minutos antes de la fijación. Después de 30 minutos, evalúe el grado de relajación sumergiendo varias larvas aún dentro de sus cápsulas ovulares y en la solución fijadora, y monitoree su respuesta bajo un microscopio.Las larvas que no se hayan relajado completamente se retraerán hacia sus conchas. Mientras que las larvas completamente relajadas no responderán. Una vez que estas larvas hayan sido relajadas, transfiera las cápsulas ovulares utilizando una pipeta plástica de gran orificio a un tubo hermético que ofrezca un volumen diez veces mayor que el de las cápsulas ovulares.A continuación, aspire todo el líquido posible del tubo y sustitúyalo por la solución fijadora, que debe ser 10 veces el volumen de los capullos de huevo sedimentados. Gire suavemente los capullos de huevo en el fijador a temperatura ambiente durante la duración adecuada para cada estadio de desarrollo. Luego, detenga la rotación y permita que los capullos se sedimenten.Aspire la solución fijadora hacia un recipiente de desecho adecuado. Lave las cápsulas ovulares reemplazando la solución fijadora con PBTw y rotándolas a temperatura ambiente durante cinco minutos.Aspire el PBTw y lave dos veces más. A continuación, retire los embriones y las larvas de sus cápsulas utilizando el aparato. Introduzca las cápsulas en una jeringa de 20 mililitros.Luego, sujete la jeringa al tubo. Expulse las cápsulas a través del tubo y de la aguja de vidrio hacia el recipiente de recolección. Posteriormente, recoja los embriones y larvas desencapsulados en un tubo de 1,5 mililitros utilizando una pipeta micrométrica.Posteriormente, deshidrate y almacene el material fijado o realice los pasos de Proteinasa K, TEA y postfijación. Una vez completados estos pasos, pre-hibride brevemente el material y agregue los riboprobes. La importancia de un tratamiento adecuado con Pro K para los resultados finales de un experimento de hibridación in situ es fundamental en Lymnaea stagnalis.Esto se refleja en una amplia gama de concentraciones de Pro K requeridas por distintas etapas de desarrollo, que van desde 0 hasta 500 microgramos por mil. Durante la hibridación, retire un solo tubo del bloque térmico. Rótelo rápidamente entre el pulgar y el índice para suspender las larvas sin perturbar la fase de aceite, y devuélvalo al bloque térmico.Repita este procedimiento una vez cada seis a doce horas. Los patrones de expresión génica mostrados aquí se generaron utilizando larvas de diversas etapas de desarrollo. Y todas las muestras se montaron e imaged en Murray's Clear.Las edades aproximadas se indican en la parte superior derecha de cada imagen. La orientación de la vista se indica en la parte inferior derecha, y la ortología de los genes se indica en la parte inferior izquierda. Estos resultados ilustran los patrones de expresión de genes implicados en una variedad de procesos moleculares que van desde la formación del caparazón hasta la transcripción y la señalización entre células.En todos los casos, es visible un patrón de tinción celular único y claro, y los resultados son altamente consistentes entre larvas individuales dentro de un experimento y altamente reproducibles entre experimentos. Una vez dominada, el tiempo total de manipulación de esta técnica requiere menos de dos días. La mayor parte del tiempo se dedica a recolectar y preparar material embrionario y de larvas para la hibridación y a obtener las imágenes de los resultados.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada ribosonda requerirá probablemente ajustes sutiles en parámetros importantes, como la temperatura de hibridación, la concentración de la sonda y la duración de la hibridación. Después de su desarrollo, esta técnica nos permitió caracterizar de manera adecuada un conjunto de genes implicados en la formación del caparazón que habían sido identificados mediante análisis transcriptómicos y proteómicos previos.

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

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Biología

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El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.

Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

La conservación del mejillón de agua dulce depende del monitoreo de los patrones y procesos reproductivos de las especies. Este estudio estandariza un protocolo no letal para tomar muestras de contenidos de branquias, caracterizar el desarrollo larvario y proporcionar un repositorio digital para los datos recopilados. Este paquete de protocolo-base de datos será una herramienta importante para los investigadores de mejillones en la recuperación de especies en busca.

Estandarización de un método no letal para caracterizar el estado reproductivo y el desarrollo larvarios de los mejillones de agua dulce (Bivalvia: Unionida)

El artículo presenta métodos para el cultivo larvario del gasterópodo Crepidula fornicata en un sistema a escala de laboratorio de pequeño volumen y en un sistema de mesocosmos de agua de mar ambiental que se puede implementar en el campo.

Cultivo en Laboratorio y Campo de Larvas de la Lapa Zapatilla, Crepidula fornicata

Aprenda la hibridación in situ en montaje completo para visualizar patrones de expresión génica en embriones y larvas de Lymnaea stagnalis. Este método optimiza la biología del desarrollo y la investigación evo-devo.

A todo el montaje

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